宋雅君 龔 哲 杜 娟 邵穎哲 賈延劼

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

抗-N-甲基-D-天冬氨酸受體（anti-N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）腦炎是自身免疫性腦炎（autoimmune encephalitis，AE）最常見的亞型，具有廣泛的臨床譜系［1］。其診斷高度依賴抗NMDAR 抗體的檢出，且血清和腦脊液中的抗體滴度可能是唯一公認的抗NMDAR腦炎疾病活性指標［1-2］。但一些研究提出懷疑，認為一些壽命較長、免疫治療難以攻擊的漿細胞可能在各種器官中存活，并導(dǎo)致抗體保持在一定水平，這體現(xiàn)在臨床康復(fù)多年后患者血清和腦脊液仍有抗體持續(xù)存在［3-4］。鑒于這種可能的局限性，仍需額外的生物標志物評估抗NMDAR 腦炎的嚴重程度或預(yù)后。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的特征包括細胞外斑塊和細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs），分別由β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）沉積和tau 蛋白磷酸化（p-tau）引起［5］。與健康對照組相比，AD 患者的Aβ水平下降，tau 水平升高［6］。越來越多的證據(jù)支持神經(jīng)炎癥是AD的神經(jīng)病理特征之一［7-8］。病毒、細菌甚至真菌抗原已被發(fā)現(xiàn)與Aβ的病理沉積有關(guān)［9-11］。炎癥期間淀粉樣蛋白負擔(dān)的逐漸增加及其抗感染特性的觀察支持了Aβ可能在大腦的整體防線中發(fā)揮重要作用的觀點［12-13］。然而，自身免疫性腦炎的病理過程是否涉及Aβ或tau蛋白的改變，目前尚未報道。另外在認知障礙人群中淀粉樣斑塊沉積與認知密切相關(guān)［14］，而抗NMDAR腦炎患者伴認知功能減退是否與Aβ或tau蛋白有關(guān)尚未報道。

本文通過檢測NMDAR腦炎患者腦脊液中Aβ1-42、Aβ1-40、t-tau 和p-tau 蛋白的水平，并與非炎癥性神經(jīng)疾病進行比較，且分析評估了腦脊液Aβ和tau在NMDAR腦炎患者中的臨床價值。

1 方法與對象

1.1 研究對象納入2019-07—2022-06 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的34例抗NMDAR腦炎患者和13例非炎癥性神經(jīng)疾病患者進行回顧性隊列研究。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者或授權(quán)委托人簽署知情同意書。

抗NMDAR 腦炎組納入標準：（1）年齡≥18 歲；（2）符合2016 年Frances 修訂的抗NMDAR 腦炎診斷標準［15］，且腦脊液中檢測出NMDAR 抗體陽性，明確診斷為抗NMDAR腦炎；（3）發(fā)病后在本院首次確診，就診前未接受任何免疫調(diào)節(jié)治療。排除標準：（1）3個月內(nèi)有過感染性腦炎或其他感染性疾病病史；（2）腦脊液采樣時正在或曾經(jīng)接受免疫治療；（3）存在其他影響mRS評分的疾?。唬?）數(shù)據(jù)不完整者。對照組納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）同期在我院住院行腰穿檢查的其他非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者，包括頭暈、頭痛和軀體化障礙；（3）腦脊液化驗常規(guī)生化細胞學(xué)均無異常。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料的收集：詳細收集所有患者的病史（高血壓、糖尿病、冠心病、腦卒中或其他并發(fā)癥）、人口學(xué)特征、入院時改良Rankin 量表（modified Rankin Scale，mRS）評分、入院時的臨床癥狀（發(fā)熱、頭痛、意識障礙、認知障礙、精神行為異常、癲癇、睡眠障礙等）、入院時的實驗室檢查結(jié)果（CSF和血液數(shù)據(jù)、致病抗體和病原體）以及發(fā)病3 個月后的結(jié)局（mRS 評分）。所有患者均于入院后第2 天早晨采集空腹血，并在治療開始前收集CSF。所有方法均按照相關(guān)規(guī)定進行，所有參與者在入組前均簽署書面知情文件。

1.2.2 腦脊液收集：標準腰椎穿刺后，收集20 mL腦脊液。取15 mL 腦脊液進行常規(guī)、生化、細胞學(xué)、NGS、腦脊液培養(yǎng)、電泳或抗體檢測。剩余的腦脊液樣品立即在4 ℃下，4 000 g 離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移到聚丙烯管中，—80 ℃保存，直到進行測定。所有程序均在60 min內(nèi)完成。

1.2.3 腦炎神經(jīng)功能評分：由兩名經(jīng)驗豐富的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生根據(jù)入院時mRS 評分獨立評估抗NMDAR腦炎的嚴重程度，mRS評分≤2表示疾病嚴重程度較輕，mRS評分≥3表示疾病嚴重程度較重。根據(jù)出院3 個月時隨訪進行mRS 評分評估抗NMDAR 腦炎的預(yù)后。mRS評分≤2表示臨床預(yù)后良好，mRS評分≥3表示預(yù)后較差［16］。

1.2.4 實驗室檢查：所有采集的血液或腦脊液樣本均在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物化學(xué)實驗室或神經(jīng)內(nèi)科實驗室進行分析。血液樣本用于檢查血常規(guī)、凝血功能、白蛋白和炎癥指標水平。對于腦脊液的常規(guī)檢測，通過儀器分析對體液細胞進行計數(shù)和分類。同時，采用離心沉淀玻片法進行人工鏡檢、分類和復(fù)檢?？筃MDAR 腦炎患者的血清和腦脊液樣本在神經(jīng)內(nèi)科實驗室用轉(zhuǎn)染細胞為標準基質(zhì)的方法來確定抗體滴度。CSF 二代測序由北京基因組研究所高通量分析檢測。腦脊液Aβ1-42、Aβ1-40、t-tau 和p-tau蛋白水平由先聲診斷公司采用酶聯(lián)免疫吸附法分析檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0 版進行統(tǒng)計分析。對本研究數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位范圍）表示，并使用Mann-Whitney U 檢驗進行比較。分類數(shù)據(jù)以例數(shù)（%）表示，使用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗進行比較。根據(jù)需要，使用Spearman 的等級分析或Pearson的相關(guān)分析來評估數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。受試者工作特征（receiver operating characteristics，ROC）曲線下的面積用于量化生物標志物對給定診斷的診斷性能。結(jié)果預(yù)測的截止值根據(jù)靈敏度和特異性的最高總和選擇。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦炎組、對照組的一般資料及實驗室檢查如表1 所示，抗NMDAR 腦炎組與對照組的既往患病情況無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與對照組相比，抗NMDAR組患者出現(xiàn)明顯發(fā)熱、意識障礙、癲癇、認知障礙、精神行為異常、腦脊液細胞數(shù)和蛋白升高（P＜0.05）?？筃MDAR組腦脊液Aβ1-42、Aβ1-40明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；在腦脊液t-tau和p-tau的含量上抗NMDAR腦炎組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 抗NMDAR腦炎組和對照組Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ 1-40、t-tau 和p-tau 差異性比較Figure 1 Comparison of differences between the anti-NMDAR encephalitis group and the control group Aβ1-42，Aβ1-40，Aβ1-42/Aβ1-40，t-tau and p-tau

表1 抗NMDAR腦炎組和對照組一般資料、實驗室檢查比較Table 1 Comparison of general data and laboratory tests between the anti-NMDAR encephalitis group and control group

2.2 抗NMDAR 腦炎患者腦脊液中Aβ1-42與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析抗NMDAR腦炎患者的腦脊液Aβ1-42與其他實驗室指標相關(guān)性分析結(jié)果提示，腦脊液Aβ1-42與入院mRS 評分（r=—0.887，P＜0.001）和出院3個月mRS 評分（r=—0.871，P＜0.001）高度相關(guān)；與中性粒絕對值（r=—0.433，P=0.011）、球蛋白（r=—0.436，P=0.010）、NLR（r= —0.548，P＜0.001）、MoCA 評分（r=0.433，P=0.031）中度相關(guān)；與淋巴細胞（r=0.384，P=0.025）、肌酐（r=0.367，P=0.033）、尿酸（r=0.344，P=0.047）、腦脊液氯化物（r=—0.354，P=0.040）低度相關(guān)。見表2。

表2 抗NMDAR腦炎患者腦脊液中Aβ1-42與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of Aβ1-42 in cerebrospinal fluid and clinical parameters in patients with anti-NMDAR encephalitis

2.3 不同嚴重程度組抗NMDAR 腦炎的差異性分析和危險因素如表3所示，將疾病嚴重程度較輕組和較重組的血及腦脊液實驗室檢查指標進行描述統(tǒng)計加差異性分析，2 組在中性粒細胞絕對值（P=0.038）、尿酸（P=0.005）、NLR（P=0.021）、A β1-42（P＜0.001）、Aβ1-40（P＜0.001）、t-tau（P=0.048）上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。較輕組的中性粒細胞絕對值、NLR、t-tau低于較重組，尿酸、Aβ1-42、Aβ1-40高于較重組。將差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標進行單因素Logistic回歸分析，抗NMDAR 腦炎疾病嚴重程度與Aβ1-42（OR=0.976，95% CI：0.958～0.996，P=0.017）、Aβ1-40（OR=0.999，95% CI：0.999～1，P=0.003）、NLR（OR=1.417，95%CI：1.025～1.961，P=0.003）顯著相關(guān)（表4）?？紤]不同因素間的相互影響及部分指標之間的共線性，篩選后進行多因素Logistic 回歸分析，發(fā)現(xiàn)Aβ1-42（OR=0.979，95% CI：0.962～0.997，P=0.023）是抗NMDAR腦炎疾病嚴重程度的獨立危險因素（表5）。

表3 不同嚴重程度組抗NMDAR腦炎的差異性分析Table 3 Differential analysis of anti-NMDAR encephalitis in different severity groups

表4 不同嚴重程度組抗NMDAR腦炎的單因素回歸分析Table 4 Univariate regression analysis of anti-NMDAR encephalitis in different severity groups

表5 不同嚴重程度組抗NMDAR腦炎的多因素回歸分析Table 5 Multivariate regression analysis of anti-NMDAR encephalitis in different severity groups

2.4 不同預(yù)后組抗NMDAR腦炎的差異性分析和危險因素如表6 所示，將預(yù)后情況較好組和較差組的血及腦脊液化驗指標進行描述統(tǒng)計加差異性分析，2 組在尿酸（P=0.011）、A/G（P=0.026）、A β1-42（P＜0.001）、Aβ1-40（P=0.006）上有統(tǒng)計學(xué)差異。較好組的尿酸、A/G、Aβ1-42、Aβ1-40高于較差組。將差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標進行單因素Logistic回歸分析，抗NMDAR 腦炎預(yù)后情況與A β1-42（OR=0.999，95% CI：0.984～0.996，P=0.002）、A β1-40（OR=0.999，95% CI：0.999～1，P=0.014）、A/G（OR=0.081，95% CI：0.007～0.886，P=0.039）、尿酸（OR=0.99，95%CI：0.981～0.999，P=0.023）顯著相關(guān)（表7）?？紤]不同因素間的相互影響及部分指標之間的共線性，篩選后進行多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)Aβ1-42（OR=0.992，95% CI：0.986～0.999，P=0.020）是抗NMDAR 腦炎預(yù)后情況的獨立危險因素（表8）。

表6 不同預(yù)后組抗NMDAR腦炎的差異性分析Table 6 Differential analysis of anti-NMDAR encephalitis in different prognostic groups

表7 不同預(yù)后情況組抗NMDAR腦炎的單因素回歸分析Table 7 Univariate regression analysis of anti-NMDAR encephalitis in different prognostic groups

表8 不同預(yù)后情況組抗NMDAR腦炎的多因素回歸分析Table 8 Multivariate regression analysis of anti-NMDAR encephalitis in different prognostic groups

2.5 抗NMDAR 腦炎患者腦脊液Aβ對疾病嚴重程度及預(yù)后的預(yù)測能力如圖2 所示，腦脊液Aβ1-42對抗NMDAR 腦炎入院時疾病嚴重程度預(yù)測的曲線下面積為0.967 9，95%置信區(qū)間為0.918 3～1.000，截斷值370.9，敏感度0.85，特異度1，P＜0.000 1；對出院后3個月預(yù)后的預(yù)測的曲線下面積為0.871 4，95%置信區(qū)間為0.754 6～0.988 3，截斷值370.9，敏感度0.857 1，特異度0.75，P=0.000 3。

圖2 抗NMDAR腦炎患者腦脊液Aβ1-42的ROC曲線Figure 2 ROC curve of cerebrospinal fluid Aβ1-42 in patients with anti-NMDAR encephalitis

3 討論

Aβ是AD的標志性蛋白之一，其生成和清除失衡導(dǎo)致AD 患者神經(jīng)系統(tǒng)細胞外淀粉樣斑塊的病理改變，這涉及的β-淀粉樣蛋白瀑布學(xué)說一直是AD發(fā)病機制的主流。腦脊液中的Aβ1-42被認為有更強的聚集傾向，從而形成淀粉樣斑塊并具有神經(jīng)毒性［17］。然而除了淀粉樣斑塊沉積外，神經(jīng)炎癥也是AD的神經(jīng)病理學(xué)特征之一［18］。有流行病學(xué)調(diào)查了8 000 多名被診斷患單純皰疹病毒的患者與2.5萬名未患單純皰疹病毒感染診斷的對照組相比，患皰疹后被診斷為AD的概率提高了2.5倍，而且對比在積極接受過皰疹治療的患者中，這種概率的增加幾乎不見了［19］。病毒、支原體、細菌甚至真菌抗原已被發(fā)現(xiàn)與病理性Aβ沉積有關(guān)［10，20-23］。研究人員由此提出AD 的炎癥假說，認為病原體造成的免疫系統(tǒng)持續(xù)性神經(jīng)炎癥導(dǎo)致形成淀粉樣斑塊的沉積［24］。腦脊液中可溶性Aβ的減少由淀粉樣斑塊中的Aβ沉積引起［25］。神經(jīng)元損傷和隨后的認知功能障礙主要由沉積的低聚物Aβ而不是成熟的原纖維造成支持了這一觀點［26］。Aβ抗感染特性的提出也為此提供了支持［27-29］。

研究顯示，細菌性腦膜炎患者腦脊液中的Aβ1-42和Aβ1-40含量，發(fā)現(xiàn)細菌性腦膜炎患者腦脊液中的Aβ1-42與對照組相比顯著減少（P＜0.05）［30］，這可能與Aβ的抗菌活性有關(guān)，即Aβ在免疫反應(yīng)中有一定保護性作用。研究發(fā)現(xiàn)在年輕的5XFAD轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型（表達人Aβ的轉(zhuǎn)基因小鼠，10 周之前腦內(nèi)無Aβ沉積）中，非致命的HSV1 感染可能有助于加速斑塊生成的開始，且5xFAD小鼠在注入致命劑量的HSV1后比對照組小鼠活得更久，而斑塊在其大腦中出現(xiàn)的時間縮短2 d［31］。此外，在無菌條件下，3D 神經(jīng)細胞培養(yǎng)模型通常到培養(yǎng)第6周才會產(chǎn)生可觀察到的Aβ沉積物［32］，而3 周的培養(yǎng)細胞在感染病毒后48 h 內(nèi)就觀察到廣泛的Aβ陽性沉積［31］。上述研究認為Aβ有抗菌肽（AMP）的生物活性，在人體中起保護和損害雙重作用［33］，而Aβ通過凝聚微生物，在入侵病原體周圍形成復(fù)合物發(fā)揮抗菌活性，因此在腦脊液中不再測量［28］。本實驗中抗NMDAR 腦炎患者腦脊液Aβ1-42較對照組明顯降低，但目前無實驗表明自身免疫性腦炎與Aβ的關(guān)系。有研究顯示在多發(fā)性硬化患者中，患者腦脊液Aβ1-42低于正常對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義［30］。根據(jù)上述Aβ的抗菌保護假說，Aβ可能像抗菌肽一樣有凝聚微病原體的抗菌保護作用，任何入侵大腦的感染因子都可能具有這種觸發(fā)作用，同時Aβ沉積可能是一種對感染的保護性免疫反應(yīng)［19，33-37］。推測NMDAR作為一種神經(jīng)細胞膜表面受體在神經(jīng)炎癥中同樣受Aβ抗菌肽生物活性的作用，與感染相似，Aβ在其周圍形成復(fù)合物發(fā)揮抗炎作用，導(dǎo)致腦脊液中可被檢測到的Aβ減少。這些還需實驗來證明。既往研究顯示Aβ水平隨年齡的增長逐漸下降的，因此本研究中抗NMDAR腦炎組較對照組較小的年齡差異不影響抗NMDAR 腦炎患者腦脊液Aβ降低的結(jié)論。

認知功能正常、輕度認知障礙、AD患者的淀粉樣斑塊沉積與認知密切相關(guān)［14，38］。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42在輕度認知障礙和AD患者中與延遲記憶和圖像回憶正相關(guān)，即腦脊液中Aβ1-42含量越低，延遲記憶和圖像回憶能力越差［39］。在帕金森病中，腦脊液Aβ1-42下降與認知功能下降和帕金森病癡呆相關(guān)，可以預(yù)測帕金森病未來認知障礙和癡呆風(fēng)險［40］。另外研究顯示在腦卒中患者中，卒中后3個月血漿Aβ1-42水平下降有助于預(yù)測1 a 后的卒中后認知障礙的發(fā)生［41］。本研究中抗NMDAR 腦炎腦脊液中Aβ1-42與認知水平中度正相關(guān)。參考癡呆中Aβ的作用機制，低聚物Aβ導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認知功能障礙［26］，推測抗NMDAR腦炎腦脊液中Aβ1-42與認知水平相關(guān)原因可能是NMDAR導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥引起異常的Aβ沉積，增強小膠質(zhì)細胞的激活和tau蛋白的病理改變，引發(fā)下游神經(jīng)退行性過程，而這些過程反過來又對認知產(chǎn)生直接影響，決定癡呆的發(fā)展［39，42］。

本研究中，抗NMDAR 腦炎患者腦脊液中Aβ1-42與NLR 呈負相關(guān)，而NLR 在抗NMDAR 腦炎疾病嚴重程度較輕組比較重組低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NLR被認為是一種反應(yīng)全身炎癥狀態(tài)的潛在生物標志物，與多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病等疾病活動有關(guān)［43］。另有研究發(fā)現(xiàn)NLR與抗NMDAR腦炎的疾病嚴重程度有關(guān)［44-45］，對疾病有一定預(yù)測價值［46］。在Aβ的抗菌保護假說背景下，可能高水平的炎癥反應(yīng)引起Aβ1-42更多地形成低聚物Aβ及淀粉樣斑塊，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，而在腦脊液中體現(xiàn)可被監(jiān)測到的Aβ1-42含量降低，因此Aβ1-42與NLR呈負相關(guān)。

NMDAR腦炎患者腦脊液中Aβ1-42與尿酸呈正相關(guān)。單因素Logistic回歸分析中尿酸在抗NMDAR腦炎疾病嚴重程度較輕組比較重組低，預(yù)后情況較好組比預(yù)后情況較差組低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。尿酸是嘌呤代謝途徑的天然產(chǎn)物，能夠抑制炎癥級聯(lián)，降低血腦屏障通透性，減少中樞神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)元死亡［47］。研究顯示抗NMDAR 腦炎患者尿酸較正常對照組患者顯著降低且與疾病嚴重程度相關(guān)［48］，與本研究結(jié)果一致?？筃MDAR腦炎中低水平的尿酸，可能影響了機體對炎癥的抑制，從而促進Aβ1-42的聚集作用，使可被檢測到的Aβ1-42含量下降，因此與疾病嚴重程度和預(yù)后情況有關(guān)。

為進一步了解Aβ1-42是否對抗NMDAR腦炎患者的疾病嚴重程度和預(yù)后有預(yù)測價值，本研究進行不同疾病嚴重程度組和不同預(yù)后情況的單因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)Aβ1-42、Aβ1-40、NLR和尿酸與疾病嚴重程度顯著相關(guān)，Aβ1-42、Aβ1-40、A/G 和尿酸與預(yù)后情況顯著相關(guān)。進行多因素Logistic回歸分析，得出Aβ1-42可能是抗NMDAR 腦炎疾病嚴重程度組和預(yù)后情況的獨立危險因素。ROC 曲線下面積分別為0.967 9和0.871 4。因此，抗NMDAR 腦炎患者腦脊液中，Aβ1-42含量在預(yù)測疾病嚴重程度組和預(yù)后情況上是一項有價值的指標。臨床工作中，腦脊液Aβ1-42水平對抗NMDAR腦炎患者積極治療有一定指導(dǎo)意義。

本研究中抗NMDAR腦炎患者腦脊液Aβ水平明顯降低，且與認知水平相關(guān)，推測Aβ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可能有炎癥保護功能，起減小或局限化炎癥反應(yīng)的作用，一定程度上能保護神經(jīng)功能，減輕疾病炎癥程度。但由于本研究樣本量相對較小且是單中心、回顧性研究，結(jié)論中腦脊液Aβ1-42可能是抗NMDAR 腦炎患者疾病嚴重程度組和預(yù)后情況的獨立危險因素，還需前瞻性、多中心的大型隊列研究進一步證實，具體作用機制也需進一步研究。