趙斯達(dá) 李儲(chǔ)忠 張亞卓

首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100070

垂體神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤之一，其發(fā)病率為（70～90）/100 000 人［1］。雖然過(guò)去“垂體腺瘤”的命名表明該類腫瘤具有良性腫瘤的行為，但長(zhǎng)期以來(lái)人們已意識(shí)到，某些腫瘤亞型在群體中發(fā)病率較高［2］。促性腺激素細(xì)胞腫瘤是垂體神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤術(shù)中病理診斷中最常見(jiàn)的類型。促性腺激素細(xì)胞腫瘤來(lái)源于促性腺激素細(xì)胞，占垂體神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的10%～20%［3］。促性腺激素細(xì)胞腫瘤占大腫瘤（＞1 cm）的50%，在男性中更為常見(jiàn)［4］。其臨床表現(xiàn)包括勃起功能障礙、頭痛、頭暈、視交叉受壓導(dǎo)致的視野缺陷，以及正常垂體受壓導(dǎo)致的激素缺乏。手術(shù)切除是一種有效的治療手段，但手術(shù)往往無(wú)法治愈那些侵襲性或復(fù)發(fā)性腫瘤。因此，我們需要尋找腫瘤的生物標(biāo)志物，開發(fā)靶向治療。

本研究通過(guò)對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)GSE26966 數(shù)據(jù)中正常樣本和促性腺激素細(xì)胞腫瘤樣本的生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)促性腺激素細(xì)胞腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為腫瘤的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)的獲取從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇編號(hào)為GSE26966 的人促性腺激素細(xì)胞腫瘤基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，該芯片基于GPL570 平臺(tái)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 檢測(cè)。該數(shù)據(jù)由9例正常垂體，10例促性腺激素細(xì)胞腫瘤和4例零細(xì)胞腺瘤（null cell），本文選取其中9 例正常垂體和10例促性腺激素細(xì)胞腫瘤組織的基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)用于本研究。

1.2 差異基因的篩選使用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的分析工具GEO2R對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，選取其中的促性腺激素細(xì)胞腫瘤（n=10）和正常垂體（n=9）組織標(biāo)本作為分析對(duì)象。篩選基因表達(dá)差異倍數(shù)＞4，P值＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05的基因作為本研究的研究對(duì)象。

1.3 差異基因的通路富集分析將篩選出的差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，尋找在促性腺激素細(xì)胞腫瘤中存在顯著異常改變的重要通路。該研究中使用R 4.2.1進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.4 基因之間相互作用網(wǎng)絡(luò)利用STRING（https：//cn.string-db.org）網(wǎng)站分析差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)。將基因按照相互作用關(guān)系多少進(jìn)行排列，取互作關(guān)系最多的前10 個(gè)分子進(jìn)行分析，篩選出與促性腺激素細(xì)胞腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵差異基因。

2 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)中促性腺激素細(xì)胞腫瘤與正常垂體組織間差異基因的篩選GSE26966 芯片數(shù)據(jù)包含38 932 個(gè)基因（圖1A）。通過(guò)對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定到1 193 個(gè)基因在促性腺激素細(xì)胞腫瘤（n=10）和正常垂體組織（n=9）之間差異表達(dá)（篩選基因表達(dá)差異倍數(shù)＞4，P 值＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05）。其中在促性腺激素細(xì)胞腫瘤中表達(dá)下調(diào)的基因有830個(gè)，表達(dá)上調(diào)的基因有363個(gè)（圖1B、C）。促性腺激素細(xì)胞腫瘤和正常垂體組織間的主成分分析結(jié)果顯示2 組樣本的表達(dá)譜能夠顯著將兩者區(qū)分，而組內(nèi)的各個(gè)樣本能夠顯著聚集，具有高度相似性（圖1D）。

圖1 芯片表達(dá)譜 A：2 組樣本通過(guò)基因芯片檢測(cè)共鑒定出38 932 個(gè)基因；B：促性腺激素細(xì)胞腫瘤和正常垂體組織間差異表達(dá)基因火山圖；C：促性腺激素細(xì)胞腫瘤和正常垂體組織間差異表達(dá)基因熱圖；D：促性腺激素細(xì)胞腫瘤和正常垂體組織間主成分分析Figure 1 Microarray expression profiling.A：38 932 genes were identified by microarray result between gonadotroph PitNETs and normal pituitary tissues；B：The volcano diagram between gonadotroph PitNETs and normal pituitary tissues；C：The heatmap diagram between gonadotroph PitNETs and normal pituitary tissues；D：Principal component analysis

2.2 差異基因通路富集分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析。GO功能注釋分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在脂肪細(xì)胞分化，脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)和對(duì)皮質(zhì)類固醇的應(yīng)答3個(gè)生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞成分分類顯示差異基因主要富集在含膠原蛋白的細(xì)胞外間質(zhì)，細(xì)胞頂端和頂端質(zhì)膜，分子功能富集結(jié)果顯示差異基因主要富集在細(xì)胞外間質(zhì)結(jié)構(gòu)成分，跨膜受體蛋白激酶活性和跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（圖2A）。KEGG通路富集結(jié)果顯示差異基因主要富集在PI3K-Akt信號(hào)通路，蛋白質(zhì)消化吸收和ECM-受體相互作用等（圖2B）。PI3K-Akt通路是差異基因富集的主要通路，該信號(hào)通路中有46個(gè)基因富集，其中有42個(gè)基因在PI3K-Akt通路中低表達(dá)。

圖2 差異基因富集通路 A：GO功能注釋；B：KEGG通路分析Figure 2 Pathway enrichment analysis.A：GO enrichment analysis results；B：KEGG pathway enrichment analysis results

本文將課題組前期研究中檢測(cè)到促性腺激素細(xì)胞腫瘤與正常垂體之間差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與GSE26966 芯片數(shù)據(jù)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)2 組數(shù)據(jù)中共表達(dá)的基因有283個(gè)，其中共同高表達(dá)的基因?yàn)?6個(gè)，共同低表達(dá)的基因224 個(gè)。將以上共表達(dá)的基因進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示這些共表達(dá)基因主要富集在PI3K-Akt 信號(hào)通路（圖3）。

圖3 GSE26966數(shù)據(jù)與課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)比分析 A：GSE26966數(shù)據(jù)與課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，2組數(shù)據(jù)中有283個(gè)共表達(dá)基因；B：283個(gè)共表達(dá)基因的通路富集分析顯示這些通路顯著富集在PI3K-Akt信號(hào)通路中Figure 3Compared analysis between GSE26966 data and our previous microarray analysis.A：There were 283 co-expressed genes between the two group；B：283 genes were mainly enriched in PI3K-Akt signaling pathway

2.3 蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)將促性腺激素細(xì)胞腫瘤和正常垂體組織間的1193 個(gè)差異基因在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，共識(shí)別到1 087 個(gè)節(jié)點(diǎn)（nodes），形成6 397 個(gè)相互作用（number of edges：6 397），平均節(jié)點(diǎn)等級(jí)為11.87 （average node degree：11.87）。此網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)最多的前10 個(gè)基因分別為：IL6、EGFR、JUN、STAT3、FOS、CD44、ESR1、BDNF、SOX2、CCL2，它們所形成的相互作用數(shù)目分別為145、140、117、111、99、97、93、89、81 和76（圖4A），其中IL6、EGFR 和BDNF 富集在PI3K-Akt 信號(hào)通路中，且它們?cè)诖傩韵偌に丶?xì)胞腫瘤中的表達(dá)水平均低于正常垂體組織（圖4B）。PI3K-Akt 信號(hào)通路中富集分子所形成的互作網(wǎng)絡(luò)如圖5A，其中24 個(gè)基因與IL6 有相互作用關(guān)系。共表達(dá)熱圖分析表明，IL6 高表達(dá)時(shí)，與其相互作用的24 個(gè)基因也呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)（圖5B）。

圖4 差異基因的網(wǎng)絡(luò)分析 A：1 193 個(gè)基因互作網(wǎng)絡(luò)分析，篩選互作個(gè)數(shù)最多的前10個(gè)基因；B：前10基因中富集在PI3K-Akt信號(hào)通路中的3個(gè)基因的表達(dá)情況Figure 4 The PPI network of the differently expressed genes.A：The top 10 genes with the most PPI network among 1193 genes.B：The expression of 3 of the top 10 genes enriched in PI3K-Akt signaling pathway

圖5 A：PI3K-Akt 信號(hào)通路的互作網(wǎng)絡(luò)分析；B：IL6 和與其有相互作用的基因之間的共表達(dá)熱圖Figure 5 A：PPI network of the PI3K-Akt signaling pathway；B：Co-expression of IL6 and its interacted genes

3 討論

促性腺激素細(xì)胞腫瘤是垂體神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的第二大亞型，僅排在催乳素型腫瘤之后［5］。雖然促性腺激素細(xì)胞腫瘤在垂體神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的發(fā)生率較高，但對(duì)該腫瘤的研究目前依然較少。另外，與其他腫瘤相比，目前沒(méi)有針對(duì)該腫瘤的有效治療方式［6］。該腫瘤的首選治療方式為手術(shù)治療，但術(shù)后仍有部分患者的腫瘤病灶存在殘留，還有部分患者病灶無(wú)肉眼可見(jiàn)殘留，但腫瘤仍可復(fù)發(fā)［7］。因此，尋找有效的治療手段十分必要。

本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定到促性腺激素細(xì)胞腫瘤與正常垂體組織間有1 193個(gè)差異基因（篩選基因表達(dá)差異倍數(shù)＞4，P 值＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05）。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示這些差異基因主要富集在PI3K-Akt 信號(hào)通路。該通路中有46 個(gè)差異基因富集，其中有42 個(gè)基因低表達(dá)。當(dāng)把本課題組前期所測(cè)芯片數(shù)據(jù)與GSE26966 芯片數(shù)據(jù)分析比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)2 組數(shù)據(jù)有283 個(gè)共表達(dá)的基因，且這些共表達(dá)基因主要富集的通路為PI3K-Akt信號(hào)通路，可見(jiàn)PI3K-Akt 信號(hào)通路在促性腺激素細(xì)胞腫瘤中具有重要作用。此外，GO功能注釋分析顯示1 193 個(gè)差異基因富集的分子功能相關(guān)通路有跨膜受體蛋白激酶活性和跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性。這兩個(gè)通路負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的磷酸化。在差異表達(dá)基因所形成的網(wǎng)絡(luò)中，IL6是形成互作關(guān)系最多的基因，有145 個(gè)相互作用，同時(shí)富集在PI3K-Akt信號(hào)通路中?？梢?jiàn)IL6在該通路中具有重要作用。

PI3K-Akt信號(hào)通路由多種細(xì)胞刺激或毒性損傷激活，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞基本功能，如轉(zhuǎn)錄，翻譯，增殖，生長(zhǎng)和存活［8］。PI3K-Akt 信號(hào)通路的激活與多種疾病相關(guān)，如腫瘤、糖尿病和自身免疫?。?］。有研究表明PI3K/AKT 信號(hào)的過(guò)度激活促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生［10］。以往有研究報(bào)道PI3K-Akt信號(hào)通路參與垂體無(wú)功能腫瘤的增殖和侵襲［11］。HICKMAN等［12］報(bào)道PI3K-Akt信號(hào)通路在促性腺激素細(xì)胞腫瘤中異常富集。但是這些研究中未詳細(xì)報(bào)道PI3K-Akt信號(hào)通路在腫瘤相對(duì)于正常組織中的分子變化。本研究發(fā)現(xiàn)相較于正常垂體組織，促性腺激素細(xì)胞腫瘤中PI3K-Akt 信號(hào)通路異常富集，且富集在該通路中的基因多數(shù)低表達(dá)。有研究證實(shí)PI3K-Akt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞中呈激活狀態(tài)［13］。PI3K-Akt信號(hào)通路是激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成的通路，其通過(guò)特定的激酶，磷酸酶和蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化之間的轉(zhuǎn)變［14］。PI3K由具有蛋白酪氨酸激酶活性的受體或G蛋白偶聯(lián)受體激活［15］。GO功能注釋分析顯示1 193個(gè)差異基因富集的分子功能相關(guān)通路有跨膜受體蛋白激酶活性和跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性。由于該通路的激活主要是通過(guò)磷酸化，因此我們猜想該通路中基因?qū)?yīng)蛋白通過(guò)酪氨酸激酶被磷酸化，通過(guò)磷酸化發(fā)揮對(duì)腫瘤增殖的調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致在細(xì)胞中剩余基因的表達(dá)水平下降。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出促性腺激素細(xì)胞腫瘤與正常垂體組織間的差異基因，通過(guò)通路富集分析得出在促性腺激素細(xì)胞腫瘤中異常的信號(hào)通路，分析該通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能的分子作用機(jī)制。PI3K-Akt信號(hào)通路在促性腺激素細(xì)胞腫瘤中的異常富集為后續(xù)腫瘤生物學(xué)過(guò)程的研究奠定基礎(chǔ)，為尋找新的分子標(biāo)志物提供可能。