韓浩園,李 濤,李世凱,宋小雨,李 君,哈 斯,趙金艷,魏紅芳,權(quán) 凱

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物科技學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642;3.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

產(chǎn)羔數(shù)是山羊生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟指標(biāo),山羊的產(chǎn)羔數(shù)由多個基因共同控制,遺傳力低,常規(guī)的育種技術(shù)難以對其改良。利用標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection,MAS)技術(shù)對山羊的產(chǎn)羔數(shù)量性狀進行篩選,已成為當(dāng)前的研究熱點。

間隙連接蛋白(Connexin,Cx)也稱為縫隙連接通道,可形成細(xì)胞間膜通道,細(xì)胞間以此連接通道為直接途徑傳遞代謝物質(zhì)和信號分子[1]。卵巢、卵泡、卵母細(xì)胞以及胚胎發(fā)育等生理過程均受間隙連接蛋白調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),特異性敲除小鼠顆粒細(xì)胞的Cx后,造成卵泡形態(tài)異常,卵母細(xì)胞的胞質(zhì)和顆粒細(xì)胞空泡化。在卵泡發(fā)育的早期階段,含有Cx組成的連接通道是維持顆粒細(xì)胞群擴張所必需的,若缺乏連接通道會對卵母細(xì)胞的生長與成熟造成損害[2]。Cx家族成員眾多,編碼間隙連接蛋白30(Cx30)的GJB6基因?qū)儆贑x家族成員,目前,GJB6基因研究主要集中在耳聾以及其他疾病上[3-4]。關(guān)于GJB6基因與繁殖性能關(guān)系的研究極少,僅在云上黑山羊產(chǎn)羔性能研究中發(fā)現(xiàn),GJB6基因突變位點GJB6g.50694816A>G和GJB6g.50694819G>A的不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)間相互關(guān)聯(lián),且差異性顯著,可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記[5]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),GJB6蛋白在卵丘細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達[6]。綜上所述,Cx家族GJB6基因在動物繁殖性能方面研究較少,但可能影響山羊的產(chǎn)羔性狀。

腺苷活化蛋白激酶α1亞基(Protein kinase,AMP activated α1,PRKAA1)蛋白屬于哺乳動物的單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)家族中一員,是在血管細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的主要亞型,在哺乳動物中參與細(xì)胞生長、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和能量代謝等多種過程[7-8]。PRKAA1是構(gòu)成AMPK的催化亞基之一。研究發(fā)現(xiàn),PRKAA1具有維持豬和牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的作用[9],其他PRKAA1基因多態(tài)性研究多集中于胃癌、慢性乙型肝炎等疾病中[10-11]。有關(guān)PRKAA1基因與山羊繁殖性能關(guān)系的研究極少,僅Wang等[12]在濟寧青山羊群體中檢測到PRKKA1基因為潛在的產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)的候選基因。然而,山羊PRKAA1基因的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系尚未見報道。

槐山羊是國內(nèi)為數(shù)不多的高繁力山羊品種,為了篩選GJB6和PRKAA1基因的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)突變,并探究GJB6和PRKAA1基因SNP與山羊產(chǎn)羔性狀之間的關(guān)系,本研究檢測了不同產(chǎn)羔數(shù)槐山羊群體中GJB6和PRKAA1基因多態(tài)位點,對篩選出的SNP與槐山羊的產(chǎn)羔數(shù)進行了相關(guān)性分析,以期能夠找出與槐山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的潛在分子標(biāo)記,為GJB6和PRKAA1基因功能的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

利用負(fù)壓抗凝采血管采集122只母羊頸靜脈血液樣本,依據(jù)沈丘縣農(nóng)牧科技研發(fā)中心的繁殖記錄表,記錄母羊的產(chǎn)羔季節(jié)、胎次、產(chǎn)羔數(shù)等信息,依據(jù)產(chǎn)羔數(shù)將群體分為單羔組(54只)、雙羔組(59只)和多羔組(9只),血液樣本置于干冰暫時保存,帶回實驗室后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

利用血液基因組柱式小量提取試劑盒(Blood Genomic DNA Mini Kit,北京艾德萊生物科技有限公司)提取122只槐山羊頸靜脈血樣的全基因組DNA。采用紫外可見分光光度計法對DNA的濃度和質(zhì)量進行測定。將基因組DNA稀釋至15 ng/μL,放置4 ℃進行保存,用于后續(xù)試驗。

1.3 引物設(shè)計

基于NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開的山羊GJB6基因(登錄號:XM_018056534.1)和PRKAA1基因(登錄號:XM_018065500.1)的參考序列,使用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性擴增引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 GJB6和PRKAA1基因的引物序列

1.4 PCR擴增

PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL,包括ddH2O 10.5 μL、2×TaqPCR Master Mix(康為世紀(jì))12.5 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、DNA模板1 μL(20 ng/μL)。PCR擴增條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,退火30 s(退火溫度見表1),72 ℃延伸1 min,共34個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,擴增條帶單一且明亮的引物用于后續(xù)試驗。

1.5 SNP掃描及基因分型

依據(jù)產(chǎn)羔數(shù),將122個槐山羊DNA樣品混合為9個DNA池,進行PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測后,經(jīng)生工生物工程(上海)有限公司測序,使用SeqMan軟件對測序峰圖進行分析,篩選混合樣的突變位點。采用產(chǎn)生突變位點的引物對122只槐山羊樣品進行測序及基因分型。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件,對SNP的基因型頻率、等位基因頻率、基因雜合度(Gene heterozygosity,He)、多態(tài)信息含量(Polymorphic information content,PIC)和有效等位基因數(shù)(Effective allele numbers,Ne)等進行計算,并進行哈代溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,H-W)檢驗。利用SHEsis Main數(shù)據(jù)庫(http://analysis.bio-x.cn/)對SNP進行連鎖不平衡(Linkage disequilibrium,LD)與單倍型分析。采用SPSS 26.0中的一般線性模型(One-way ANOVA)進行槐山羊GJB6基因和PRKAA1基因SNP與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析,并進行不同單倍型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

對GJB6和PRKAA1基因序列進行PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,GJB6基因第2,3對引物及PRKAA1基因第4,5,6,7對引物擴增產(chǎn)物條帶清晰、單一、整齊,沒有殘留,目的條帶與預(yù)期擴增片段大小一致,可用于后續(xù)研究。部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1所示。

M.Marker;1—3.混合樣1,2,3。

2.2 槐山羊GJB6和PRKAA1基因SNP掃描結(jié)果

測序發(fā)現(xiàn),GJB6和PRKAA1基因共存在5個SNP,其中,以已知山羊的GJB6基因(XM_018056534.1)序列為參照,槐山羊的GJB6基因存在2個SNP位點,分別位于第837 bp(C/T)和840 bp(T/C)處(圖2),均為同義突變,C837T突變前后均編碼絲氨酸,T840C突變前后均編碼纈氨酸。與參考序列NC_030819.1比對后,將GJB6基因的C837T突變命名為g.50694819 C>T,將T840C突變命名為g.50694816 T>C。

圖2 GJB6基因2個SNP位點測序峰圖

以已知山羊的PRKAA1基因(XM_018065500.1)序列為參照,槐山羊PRKAA1基因存在3個SNP位點,分別位于第2 287 bp(T/C)、第3 898 bp(T/C)和第4 193 bp(A/T)處(圖3),3個突變均位于基因的非編碼區(qū),不編碼氨基酸。與參考序列NC_030827.1比對后,分別將PRKAA1基因T2287C突變、T3898C突變和A4193T突變命名為g.33691489 T>C、g.33693100 T>C和g.33693395 A>T。

圖3 PRKAA1基因3個SNP位點測序峰圖

2.3 槐山羊GJB6和PRKAA1基因分型

利用DNAstar軟件以及Excel軟件將分型結(jié)果進行整理,結(jié)果顯示,GJB6和PRKAA1基因的5個SNP均存在3種基因型,各基因型的個體數(shù)分布見表2。分別對5個SNP進行基因型頻率和等位基因頻率分析(表3)。GJB6基因g.50694819 C>T位點的等位基因頻率存在明顯的差異,C為優(yōu)勢等位基因,等位基因頻率為0.909 8;g.50694816 T>C位點TT為優(yōu)勢基因型,T為優(yōu)勢等位基因,等位基因頻率為0.762 3;PRKAA1基因的g.33691489 T>C位點TC為優(yōu)勢基因型,C為優(yōu)勢等位基因,等位基因頻率為0.557 4;g.33693100 T>C位點TT為優(yōu)勢基因型,T為優(yōu)勢等位基因,等位基因頻率為0.909 8;g.33693395 A>T位點AT為優(yōu)勢基因型,A為優(yōu)勢等位基因,等位基因頻率為0.536 9。

表2 GJB6和PRKAA1基因SNP分型結(jié)果

表3 槐山羊5個SNP位點基因型頻率與等位基因頻率

2.4 槐山羊GJB6和PRKAA1基因SNP遺傳多樣性分析

對GJB6和PRKAA1基因的SNP位點進行了卡方檢驗(χ2)及多態(tài)信息含量、雜合度、有效等位基因數(shù)等遺傳參數(shù)分析(表4),結(jié)果表明,GJB6基因g.50694819 C>T位點和PRKAA1基因g.33693100 T>C位點多態(tài)信息含量低于0.25,屬于低度多態(tài),與雜合度結(jié)果相符;GJB6基因g.50694816 T>C位點、PRKAA1基因g.33691489 T>C和g.33693395 A>T位點屬于中度多態(tài)位點。Hardy-Weinberg平衡分析顯示,5個SNP位點χ2檢驗結(jié)果均小于5.99,處于Hardy-Weinberg平衡。

表4 槐山羊GJB6和PRKAA1基因SNP位點的遺傳多樣性

2.5 槐山羊GJB6和PRKAA1基因SNP的連鎖不平衡分析

槐山羊群體GJB6和PRKAA1基因5個SNP的連鎖不平衡分析結(jié)果顯示,GJB6基因g.50694819 C>T和g.50694816 T>C位點間D′=0.862、r2=0.236(D′>0.8,r2<0.33),為弱連鎖平衡狀態(tài);PRKAA1基因的g.33691489 T>C和g.33693395 A>T位點間D′=1.000、r2=0.685(D′>0.8,r2>0.33),屬于強連鎖平衡狀態(tài),而g.33693100 T>C和g.33691489 T>C以及g.33693100 T>C和g.33693395 A>T之間D′>0.8,r2<0.33,為弱連鎖平衡狀態(tài)。

2.6 槐山羊GJB6和PRKAA1基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用SPSS 26.0軟件的一般線性模型對GJB6和PRKAA1基因中存在的SNP位點進行基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果見表5。GJB6基因SNP不同基因型間的產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。而PRKAA1基因g.33691489 T>C位點的TC基因型個體產(chǎn)羔數(shù)與CC基因型個體產(chǎn)羔數(shù)差異顯著,TC基因型產(chǎn)羔數(shù)比CC基因型多0.603只;g.33693395 A>T位點AT基因型個體產(chǎn)羔數(shù)與TT、AA基因型個體產(chǎn)羔數(shù)差異顯著,AT基因型產(chǎn)羔數(shù)比TT基因型多0.459只。結(jié)果表明,g.33691489 T>C位點TC基因型和g.33693395 A>T位點AT基因型的產(chǎn)羔數(shù)較高。

表5 GJB6和PRKAA1基因突變位點的多態(tài)性與槐山羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

2.7 GJB6和PRKAA1基因SNP單倍型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

單倍型分析發(fā)現(xiàn),GJB6基因的2個SNP將群體分為4種單倍型:CC、CT、TC和TT。利用SPSS 26.0軟件分析單倍型與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性,結(jié)果表明,GJB6基因不同單倍型與產(chǎn)羔數(shù)不顯著(表6)。

表6 GJB6和PRKAA1基因單倍型對槐山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響

PRKAA1基因的3個SNP將群體分為5種單倍型:CCT、CTA、CTT、TTA和TCA。單羔和雙羔群體中存在4種單倍型,分別為CCT、CTA、CTT和TTA;多羔群體中存在4種單倍型,分別為CTA、CTT、TTA和TCA。單倍型與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)聯(lián)分析表明,TCA單倍型個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CTT、CTA和TTA單倍型個體(表6)。

3 結(jié)論與討論

3.1 GJB6基因多態(tài)性與山羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

目前,GJB6基因的遺傳突變研究主要集中在耳聾等疾病方面[13-14],對于繁殖性狀的研究極少。本研究根據(jù)沈丘縣農(nóng)牧科技研發(fā)中心的繁殖記錄,共采集54只產(chǎn)單羔母羊、59只產(chǎn)雙羔母羊以及9只產(chǎn)3羔以上的母羊,進行了GJB6基因的SNP及其與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析。在槐山羊GJB6基因中發(fā)現(xiàn)2個SNP,分別為g.50694819 C>T和g.50694816 T>C,均與陶林等[5]在GJB6基因中發(fā)現(xiàn)的突變位點一致。有研究表明,GJB6基因在哺乳動物中相當(dāng)保守,平均同義替換率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非同義替換率[14],與本研究結(jié)果相符。

PIC指標(biāo)用于衡量基因的變異程度,當(dāng)PIC水平高,等位基因數(shù)量多,雜合度高時,說明該群體的多態(tài)位點具有較高的遺傳變異,具有很好的選擇性。本研究PIC測定結(jié)果表明,槐山羊中GJB6基因g.50694816 T>C位點為中度多態(tài)(0.25T位點為低度多態(tài)(PIC<0.25),與濟寧青山羊研究中的結(jié)果一致[5]。經(jīng)過χ2適應(yīng)性檢驗,槐山羊GJB6基因g.50694816 T>C和g.50694819 C>T位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),與云上黑山羊和濟寧青山羊一致[5],表明這2個SNP在長期的進化和自然選擇中具有一定的遺傳優(yōu)勢,從而達到了平衡。

本研究進行了GJB6基因SNP位點與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果表明,g.50694819 C>T位點和g.50694816 T>C位點的不同基因型、單倍型與槐山羊的產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)均無顯著相關(guān)性(P>0.05),說明上述位點均不是影響槐山羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)鍵位點。而在云上黑山羊的研究中發(fā)現(xiàn),GJB6基因g.50694816 A>G AA型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG型,g.50694819 G>A GG型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AG型。GJB6基因的組合基因型分析發(fā)現(xiàn),AAGG型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AGGG型,說明GJB6的2個位點可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記[5]。以上結(jié)果表明,GJB6g.50694819 G>A和g.50694816 A>G位點可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記,卻與槐山羊的產(chǎn)羔數(shù)無關(guān),說明山羊品種間影響產(chǎn)羔數(shù)的基因可能不同。

3.2 PRKAA1基因多態(tài)性與山羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

本研究進行了槐山羊PRKAA1基因的SNP分析,發(fā)現(xiàn)3個SNP位點g.33691489 T>C、g.33693100 T>C和g.33693395 A>T,3個SNP位點均位于非編碼區(qū),有研究表明,編碼區(qū)域的突變往往影響個體的正常生長和發(fā)育,因此,在非編碼區(qū)域中檢測到的SNP多于編碼區(qū)域[15-17]。PIC測定結(jié)果表明,PRKAA1基因g.33691489 T>C和g.33693395 A>T位點在槐山羊群體中處于中度多態(tài)。PIC數(shù)值大小可以反映出種群中個體的均一性,數(shù)值越大,遺傳變異越大,反之,則群體變異越小[18-19]。本研究結(jié)果表明,槐山羊g.33691489 T>C和g.33693395 A>T位點雜合度較高,說明這2個位點具有較高的遺傳變異,有很好的選擇性,且處于強連鎖平衡狀態(tài),可以通過這些位點進行標(biāo)記來輔助育種。

目前,尚無對山羊PRKAA1基因SNP與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性的研究,本研究中槐山羊PRKAA1基因型與產(chǎn)羔表型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,g.33691489 T>C位點的TC基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于CC基因型;g.33693395 A>T位點AT基因型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA、TT基因型。且單倍型分析結(jié)果說明,TCA單倍型個體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CTA、CTT、TTA單倍型,說明PRKAA1基因單倍型TCA槐山羊產(chǎn)羔數(shù)更多。在對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析中,通過對不同產(chǎn)羔數(shù)分組的選擇消除分析,鑒定出PRKAA1基因是與山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的潛在候選基因[12]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),PRKAA1具有維持豬和牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的作用[20-21],vaspin通過調(diào)控PRKAA1促進卵母細(xì)胞成熟,調(diào)控類固醇生成和抑制卵泡細(xì)胞凋亡[22-23],本研究結(jié)果支持了以上研究結(jié)論。且本研究首次發(fā)現(xiàn),g.33691489 T>C和g.33693395 A>T位點與山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān),可作為多羔性狀選育的潛在分子標(biāo)記。但本研究的樣本數(shù)量有限,且突變位點僅限于非編碼區(qū),還需擴大樣本數(shù)量進一步研究。

綜上,在槐山羊GJB6基因中發(fā)現(xiàn)2個SNP,分別為g.50694819 C>T和g.50694816 T>C,為同義突變,與槐山羊產(chǎn)羔數(shù)之間無顯著相關(guān)性。在槐山羊PRKAA1基因上共發(fā)現(xiàn)了3個SNP,分別為g.33691489 T>C、g.33693100 T>C和g.33693395 A>T,位于非編碼區(qū)。g.33691489 T>C位點的TC基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CC基因型,g.33693395 A>T位點AT基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA和TT基因型(P<0.05),可作為槐山羊多羔性狀選育的潛在分子標(biāo)記。