閆尊強(qiáng),計亞楠,王鵬飛,張 博,石海霞,滾雙寶,2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州 730070)

類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)基因(Steroidogenic acute regulatory,StAR)在睪丸、卵巢、肝臟等組織中表達(dá),編碼的StAR蛋白是類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移域家族的重要成員之一,在類固醇激素合成過程中起重要作用[1-3]。StAR蛋白主要由α-螺旋和β-折疊組成,屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,前體蛋白有285個氨基酸,逐步加工為成熟蛋白,活性部位為羧基端,稱為StAR相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(StAR-related lipid transfer,START)[4-6]。StAR蛋白是類固醇激素合成過程中重要的限速酶,能結(jié)合線粒體外膜中的膽固醇,轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)膜(羧基端協(xié)助膽固醇從含量多的線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至含量低的線粒體內(nèi)膜上,氨基端引導(dǎo)其定位到線粒體上),進(jìn)入內(nèi)膜中的膽固醇被細(xì)胞色素P450支鏈裂解酶催化生成孕烯醇酮,孕烯醇酮離開線粒體后在機(jī)體不同組織中合成孕酮、睪酮、雌激素、醛固酮等類固醇激素[7-8]。有研究表明,StAR基因突變后膽固醇很難轉(zhuǎn)化成孕烯醇酮,導(dǎo)致先天性腎上腺增生[9-10];睪丸間質(zhì)細(xì)胞StAR基因表達(dá)量降低,引起間質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)膜的膽固醇供應(yīng)減少,睪酮生成不足,造成不育[11-12];StAR-/-小鼠卵巢中的脂質(zhì)大量積累,雌激素水平降低,乳房發(fā)育不良[13],說明StAR基因在動物生殖活動中有重要功能。

合作豬(又稱山豬、蕨麻豬)適應(yīng)極端惡劣氣候環(huán)境,主要分布于甘肅省甘南藏族自治州的合作、夏河、迭部等縣(市)的高海拔牧區(qū),是我國獨(dú)有的小型高原型豬種[14-17]。StAR基因與畜禽繁殖性能密切相關(guān),但未見合作豬StAR基因研究的報道。因此,本試驗通過克隆合作豬StAR基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同組織中StAR基因表達(dá)量,為深入研究該基因在合作公豬性成熟過程中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

選擇甘肅省甘南藏族自治州農(nóng)戶放牧飼養(yǎng)的3月齡合作公豬,屠宰后采集睪丸、心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、空腸和回腸組織,液氮速凍,帶回實(shí)驗室-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑購自北京全式金公司,PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRTMPremixExTaqTMⅡ熒光定量試劑盒、pMD19-T載體購自TaKaRa公司,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、2×Taq Master Mix、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根公司,其他試劑購自Solarbio公司。

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用TRIzol提取睪丸、心等組織總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:①5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,Total RNA 1 μL(0.5 μg/μL),gDNA Eraser 1 μL,RNase Free H2O 6 μL,42 ℃反應(yīng)2 min;②上一步驟的10 μL反應(yīng)液加PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL,RT Prime Mix 1 μL,5 ×PrimeScript Buffer 4 μL,RNase Free H2O 4 μL,37 ℃反應(yīng)15 min,85 ℃反應(yīng)5 s。反應(yīng)結(jié)束后,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank收錄的豬StAR基因序列(NM_213755.2)及內(nèi)參GAPDH基因序列(NM_001206359.1),引物使用Primer 5.0軟件設(shè)計,引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物信息

1.5 表達(dá)量檢測

以cDNA為模板,用RT-qPCR檢測StAR基因在睪丸、心等組織中的表達(dá)量。反應(yīng)體系20 μL,其中SYBRPremix Ex Taq Ⅱ 10 μL,上、下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/μL),cDNA 2 μL,RNase Free H2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,40個循環(huán);72 ℃ 20 s。GAPDH基因為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法[18]計算相對表達(dá)量,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±s)表示,用SPSS 20.0軟件中單因素方差Duncan程序進(jìn)行顯著性檢驗。

1.6 克隆及測序

睪丸StAR基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,純化目的片段,與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)入DH5α細(xì)胞,在不含AMP+的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)45 min,取少許液體均勻涂抹于含有AMP+、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過夜。采集單個的白色菌落,置入含有AMP+的100 mL LB液體培養(yǎng)基中搖菌10 h,吸菌液做PCR,提取大小與目的條帶一致的菌液質(zhì)粒,進(jìn)行Sanger測序。

1.7 生物信息學(xué)分析

合作豬StAR基因生物信息學(xué)分析工具參見表2。

表2 生物信息學(xué)分析工具

2 結(jié)果與分析

2.1 StAR基因克隆及測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得特異性條帶,與預(yù)期片段大小一致(圖1)。測序后發(fā)現(xiàn)CDS區(qū)長858 bp,編碼285個氨基酸,其中第572位點(diǎn)處的A突變?yōu)镚,導(dǎo)致第191位點(diǎn)的賴氨酸突變成精氨酸,為錯義突變,第791位點(diǎn)處插入1個堿基C,導(dǎo)致隨后20個氨基酸發(fā)生突變,為移碼突變(圖2,3)。

圖1 合作豬StAR基因PCR擴(kuò)增

圖2 合作豬StAR基因測序結(jié)果分析

圖3 合作豬StAR蛋白氨基酸序列比對

2.2 StAR基因同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

下載人(NM_000349.3)、綿羊(NM_001009243.1)、狗(NM_001097542.1)、黑猩猩(XM_009455195.3)、家鼠(NM_011485.5)、馬(NM_001081800.3)、獼猴(NM_001265769.1)、黃牛(NM_174189.3)、豬(NM_213755.2)和雞(NM_204686.2)的核苷酸序列,使用Blast軟件分析合作豬StAR基因的同源性(表3),用MEGA 7.0軟件構(gòu)建StAR基因的進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),合作豬與豬的親緣關(guān)系最近,其次為黃牛和綿羊,與家鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖4 StAR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

表3 合作豬StAR基因與其他物種序列比對

2.3 StAR蛋白理化性質(zhì)分析

使用ProtParam軟件預(yù)測合作豬StAR蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示,分子式為C1391H2277N415O412S13,原子總數(shù)4 453,分子量90.95 ku,理論等電點(diǎn)(pI)8.87,消光系數(shù)(γ=280 nm)33 835,不穩(wěn)定系數(shù)41.49,理論半衰期30 h,親水性平均值-0.278。氨基酸殘基中亮氨酸(11.6%)和精氨酸(8.5%)比例較高,帶負(fù)電荷的天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基31個,帶正電荷的精氨酸殘基和賴氨酸殘基36個(圖5)。

圖5 合作豬StAR蛋白的氨基酸組成及頻率

2.4 StAR蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用在線軟件SOPMA預(yù)測合作豬StAR蛋白二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)由17.49%的延伸鏈、5.94%的β-轉(zhuǎn)角、39.51%的α-螺旋和37.06%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖6-A)。采用在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測其三級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖6-B),與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測基本一致。

h.α-螺旋;t.β-轉(zhuǎn)角;c.無規(guī)則卷曲;e.延伸鏈。

2.5 StAR蛋白親疏水性分析

運(yùn)用ExPASy在線軟件Protscale分析合作豬StAR蛋白的親/疏水性,氨基酸序列中第100位出現(xiàn)最小疏水值(-3.111),第200位出現(xiàn)最大疏水值(2.122),疏水性氨基酸殘基少于親水性氨基酸殘基,推測為親水性蛋白(圖7)。

圖7 合作豬StAR蛋白的疏水性分析

2.6 StAR蛋白跨膜區(qū)域及信號肽分析

采用TMHMM軟件分析跨膜區(qū)域,預(yù)測期望值為0,無跨膜區(qū)域,是非跨膜蛋白(圖8-A)。使用SignalP軟件預(yù)測信號肽,發(fā)現(xiàn)剪切位點(diǎn)分值(Y)為0.152,信號肽酶切位點(diǎn)分值(C)為0.162,信號肽(S)的分值為0.312,該蛋白不存在信號肽,推測不是分泌蛋白(圖8-B)。

圖8 合作豬StAR蛋白的跨膜區(qū)域(A)及信號肽(B)

2.7 StAR蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測

使用SMART軟件預(yù)測合作豬StAR蛋白結(jié)構(gòu)域的位置和種類,發(fā)現(xiàn)在76—282位氨基酸殘基之間有一個START結(jié)構(gòu)域,屬于SRPBcc結(jié)構(gòu)域蛋白超家族(圖9)。

圖9 合作豬StAR蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.8 StAR蛋白糖基化修飾位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過NetNGlyc 1.0軟件預(yù)測StAR蛋白糖基化修飾位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)第148位氨基酸處存在1個N-糖基修飾位點(diǎn)(圖10-A)。采用PSORTⅡ軟件對合作豬StAR蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)分布在線粒體(52%)、細(xì)胞質(zhì)(26%)、細(xì)胞核(18%)和分泌系統(tǒng)的囊泡(4%),推測是線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖10-B)。

圖10 合作豬StAR蛋白N-糖基化位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位

2.9 StAR蛋白相互作用分析

通過STRING 11.5軟件分析發(fā)現(xiàn),StAR蛋白可能與FSHR、VDAC1、CERS6、NR5A1、TSPO等蛋白有相互作用(圖11)。

圖11 合作豬StAR蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析圖

2.10 StAR基因在合作豬各組織中的表達(dá)量

使用RT-qPCR檢測StAR基因在合作豬不同組織中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)所有組織均表達(dá),肺臟表達(dá)量最高,其次睪丸,且極顯著高于脾臟、腎臟等組織(圖12)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

類固醇激素合成能力是影響畜禽繁殖力的重要因素之一。StAR基因編碼的蛋白產(chǎn)物是類固醇激素合成過程中的重要限速酶,表達(dá)于腎上腺、卵巢﹑睪丸、胎盤等組織,對畜禽繁殖性狀(如性別分化、精子發(fā)生、卵泡發(fā)育)有重要功能[19-21]。StAR-/-小鼠卵巢有早衰癥狀,具體表現(xiàn)為脂質(zhì)沉積﹑基質(zhì)細(xì)胞黃素化、卵泡不完全成熟等[13];胚胎期StAR基因在動物睪丸間質(zhì)細(xì)胞前體的胞間隙中表達(dá),隨后在間質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá),在支持細(xì)胞中微量表達(dá),最終影響生殖活動[7]。研究發(fā)現(xiàn),人StAR基因序列的突變可引起腎上腺和性腺類固醇激素合成受阻,表現(xiàn)為脂樣腎功能增生綜合征[22],雞StAR基因序列的突變影響膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如ABCA1、ABCG1)的表達(dá)量,引起膽固醇激素合成受阻,導(dǎo)致生殖機(jī)能異常[23]。以上研究表明,StAR基因?qū)游锓敝承誀钌嫌兄匾δ?其核酸序列突變可引起蛋白質(zhì)功能的改變,影響動物繁殖。

目前,關(guān)于合作豬StAR基因相關(guān)研究未見報道,為獲取合作豬StAR基因相關(guān)信息,本試驗以合作公豬睪丸組織cDNA為模板,克隆該基因,發(fā)現(xiàn)CDS全長858 bp,編碼285個氨基酸。劉宇等[5]發(fā)現(xiàn)牦牛StAR基因CDS全長858 bp,編碼285個氨基酸,與本研究得到的結(jié)果一致。StAR基因的突變會引起類固醇激素含量的改變,影響睪丸功能[7,20]。本研究發(fā)現(xiàn),與豬參考序列相比,合作豬StAR基因共有2處突變,第572位點(diǎn)處的A突變成G,導(dǎo)致第191位的賴氨酸突變成精氨酸,為錯義突變,第791位點(diǎn)處插入一個堿基C,引起C端的20個氨基酸改變,為移碼突變。推測合作豬StAR蛋白中21個氨基酸的改變,可提高蛋白活性,高效轉(zhuǎn)運(yùn)更多膽固醇進(jìn)入內(nèi)膜生成睪酮等類固醇激素,保證生活在高寒低氧環(huán)境中合作公豬正常的繁殖性能。為證實(shí)這種推測,今后將在細(xì)胞(如睪丸間質(zhì)細(xì)胞)水平過表達(dá)正常StAR基因(對應(yīng)野生型蛋白)及StAR基因突變(對應(yīng)突變型蛋白),檢測細(xì)胞合成類固醇激素的速率及含量。

StAR基因與豬同源性最高,遺傳距離最近,親緣關(guān)系最近,與黃牛﹑綿羊具有較高的同源性,在進(jìn)化上是比較保守的。Bauer等[24]對魚類、哺乳動物等StAR蛋白氨基酸序列做了比較﹐也發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在不同種類動物中具有很強(qiáng)的保守性,與本研究結(jié)果一致。StAR蛋白羧基端有一個START結(jié)構(gòu)域,各物種間十分保守,在膽固醇運(yùn)輸過程中有重要功能,本研究也發(fā)現(xiàn)StAR蛋白在76—282位氨基酸處有一個START保守結(jié)構(gòu)域。合作豬StAR蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白,定位在線粒體,這與楊沛方等[25]在單、多羔黔北麻羊母羊性腺組織中StAR基因的研究結(jié)果一致。StAR蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示,其與VDAC1(電壓依賴性陰離子通道1)等蛋白相互作用。VDAC屬于線粒體孔道蛋白,參與多種細(xì)胞代謝物/離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Bose等[26]研究發(fā)現(xiàn),腎上腺細(xì)胞中磷酸化StAR蛋白能與線粒體外膜上的VDAC1蛋白相互作用,能促進(jìn)37 ku磷酸化StAR蛋白到32 ku中間體的加工。采用RT-qPCR檢測該基因在合作豬不同組織中的表達(dá)豐度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),睪丸表達(dá)量較高,與StAR蛋白的功能及睪丸是類固醇激素主要來源的內(nèi)分泌特性相吻合。

本研究克隆了合作豬StAR基因,CDS區(qū)長858 bp,編碼285個氨基酸,是親水性蛋白,有典型的START結(jié)構(gòu)域,物種間十分保守,睪丸表達(dá)量較高。表明StAR基因在合作豬睪丸發(fā)育及性成熟過程中發(fā)揮了重要功能,此研究為進(jìn)一步解析合作豬StAR基因發(fā)揮功能的分子調(diào)控機(jī)制提供了參考。