彭多姿,黃顥源,范占煌,戴 悅,元妙新,張振乾

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.中節(jié)能大地(杭州)環(huán)境修復(fù)有限公司,浙江 杭州 310020)

土壤重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重,土壤中富集的重金屬不僅會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)產(chǎn)生不利影響,還會(huì)嚴(yán)重影響其加工食品的質(zhì)量和安全[1]。重金屬污染土壤修復(fù)常用的方法有休耕、物理修復(fù)、化學(xué)改良修復(fù)和生物修復(fù)等[2]。生物修復(fù)操作簡(jiǎn)單、成本低、效果明顯,且不會(huì)引起二次污染[3]。植物修復(fù)是生物修復(fù)的一種,具有應(yīng)用性較好、清除重金屬污染物較徹底、成本低廉、操作簡(jiǎn)單、安全清潔、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[4]。油菜(BrassicanapusL.)是中國(guó)南方地區(qū)第二大作物,不與水稻爭(zhēng)地,種植技術(shù)簡(jiǎn)單,生物量遠(yuǎn)較蜈蚣草、野趾草等超富集修復(fù)植物大,且有較強(qiáng)的吸收累積鎘能力[5],且重金屬主要積蓄于粕餅中,毛油中重金屬含量符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),不存在消費(fèi)風(fēng)險(xiǎn),可實(shí)現(xiàn)邊修復(fù)邊生產(chǎn)[6-7]。楊洋等[8]研究發(fā)現(xiàn),重金屬在不同類型油菜間的吸收積累及轉(zhuǎn)運(yùn)情況差異顯著,芥菜型油菜適合Cu、Pb 污染的土壤,而甘藍(lán)型油菜對(duì) Zn、Cd 的吸收積累效果最好,適合用來(lái)修復(fù)重金屬?gòu)?fù)合污染的土壤。范占煌等[9]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),甘藍(lán)型油菜在高濃度鎘存在的土壤中仍能生長(zhǎng)、結(jié)實(shí),且不影響菜籽油的食用價(jià)值,是一種理想的修復(fù)植物。當(dāng)前的研究多為不同基因型,如甘藍(lán)型油菜[10]、白菜型油菜[11]和芥菜型油菜[12-13]之間的差異和不同類型甘藍(lán)型油菜不同品種[14-16]的修復(fù)效果研究及同一材料不同生育期及部位間重金屬累積情況[17],其中甘藍(lán)型油菜栽培面積較大[18],因而相關(guān)研究較多,但不同甘藍(lán)型油菜雜交類型油菜對(duì)修復(fù)作用影響相關(guān)的研究較少。

為明晰不同雜交類型油菜在修復(fù)重金屬污染土壤中的差異,本研究以自交系159-6、單交油菜灃油520和三交油菜159-6×灃油520 為材料,通過(guò)盆栽試驗(yàn)比較在不同材料不同重金屬污染土配比環(huán)境下的苗期長(zhǎng)勢(shì)、生理特性差異以及光合作用相關(guān)基因(Bna0280620[19]、Bna049040[20]和BnaC08g46180D[21])和抗金屬性相關(guān)基因(BnaA08g04000D[21]、BnaA09g24330D[22]、BnNRAMP[23]和BnPri-miR167a[23])的表達(dá)量差異,以期找出適宜的重金屬污染土壤油菜類型,為后續(xù)的修復(fù)研究及新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

灃油520(20A×C3R,國(guó)審油2009009)、自交系159-6和三交油菜159-6×灃油520均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)盆栽試驗(yàn),用營(yíng)養(yǎng)土和污染土混合,以Ⅰ(100%營(yíng)養(yǎng)土)生長(zhǎng)環(huán)境為對(duì)照組Ⅰ(CK),設(shè)置不同污染土配比的Ⅱ(25%污染土,75%營(yíng)養(yǎng)土)、Ⅲ(50%污染土,50%營(yíng)養(yǎng)土)、Ⅳ(75%污染土,25%營(yíng)養(yǎng)土)3個(gè)污染土環(huán)境,肥水、光照等其余條件均保持一致。每個(gè)生長(zhǎng)環(huán)境下,每個(gè)材料種4盆,每盆留苗10株。

營(yíng)養(yǎng)土:由基質(zhì)土、優(yōu)質(zhì)鋸末、進(jìn)口椰糠、蛭石、珍珠巖混合發(fā)酵而成,含氮15%,含磷15%,含鉀15%。

重金屬污染土:由中節(jié)能大地環(huán)保公司提供,采集自溫州填埋場(chǎng)。主要成分:干物質(zhì)78.4%,pH=7.67,有機(jī)質(zhì)133 g/kg,水溶性總鹽量3.63 g/kg,鎘含量為1.5 mg/kg,鉻含量為913 mg/kg、鎳含量為165 mg/kg、鉛含量449 mg/kg、砷和汞含量分別12.600,0.443 mg/kg,以農(nóng)用地土壤污染國(guó)家控制標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-2008)為依據(jù),鎘超標(biāo)150.0%,鉻超標(biāo)265.2%,鉛超標(biāo)164.1%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 油菜生長(zhǎng)14 d后取新鮮葉片,于-80 ℃冰箱保存,用于測(cè)定生理生化指標(biāo);取新鮮葉片提取RNA,反轉(zhuǎn)成cDNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 干質(zhì)量測(cè)定 將油菜植株測(cè)鮮質(zhì)量后置于烘箱,105 ℃殺青30 min,80 ℃烘48 h至恒質(zhì)量,并稱質(zhì)量。

1.3.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定 分別采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量,考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量,95%乙醇浸提法測(cè)定葉綠素含量,氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)活性、過(guò)氧化氫法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(Catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量[24]。

1.3.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 用TransZol Up Plus RNA Kit 試劑盒提取RNA(全式金生物,北京),用2100生物分析儀檢測(cè)RNA質(zhì)量(Agilent,美國(guó))。用Hieff?1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester Plus)試劑盒(翌圣生物,上海)反轉(zhuǎn)合成cDNA。

1.3.5 基因表達(dá)情況分析 用NCBI設(shè)計(jì)引物,由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成(表1),利用全式金熒光定量試劑盒(全式金生物,北京)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。利用Hieff?qPCR SYBR?Green Maste Mix(High Rox Plus)試劑盒(翌圣生物,上海)進(jìn)行熒光定量PCR,具體操作參照說(shuō)明書。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.4 試驗(yàn)儀器

U8000紫外分光光度計(jì)(元析,上海),冷凍離心機(jī)(元析,上海),2100生物分析儀(Agilent,美國(guó))),GelDoc2000凝膠成像儀(Bio-Rad,美國(guó)),CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國(guó)),PTC200 PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))。

1.5 數(shù)據(jù)處理

RT-qPCR采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),Excel 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油菜干鮮質(zhì)量的差異分析

不同污染土配比對(duì)油菜干鮮質(zhì)量的影響如圖1,不同污染土配比下,159-6×灃油520和159-6鮮質(zhì)量均高于對(duì)照組Ⅰ,且隨著污染土比例的增加,先升高后降低;灃油520鮮質(zhì)量均低于對(duì)照組Ⅰ,呈持續(xù)下降的趨勢(shì);159-6×灃油520干質(zhì)量均高于對(duì)照組Ⅰ,呈先升高后下降的趨勢(shì);灃油520干質(zhì)量均低于對(duì)照組Ⅰ,趨勢(shì)為先下降后升高再下降;159-6干質(zhì)量先下降后升高再下降,在50%污染土配比下高于對(duì)照組Ⅰ。在含25%污染土配比環(huán)境中,159-6×灃油520的鮮質(zhì)量顯著高于159-6(P=0.036)。在50%和75%污染土配比環(huán)境中159-6×灃油520的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均顯著高于灃油520和159-6(P<0.05)。

不同小寫字母表示同一處理下不同材料間差異顯著(P<0.05)。圖2—7同。

2.2 生理指標(biāo)分析

2.2.1 不同油菜可溶性糖含量的差異分析 不同污染土配比對(duì)油菜可溶性糖含量的影響如圖2,發(fā)現(xiàn)不同污染土配比下,油菜可溶性糖含量變化均較小,3個(gè)材料可溶性糖含量均無(wú)顯著差異,說(shuō)明這3個(gè)材料的可溶性糖含量受到重金屬污染土環(huán)境影響較小。

圖2 不同污染土配比處理對(duì)油菜可溶性糖含量的影響

2.2.2 不同油菜可溶性蛋白含量的差異分析 不同污染土配比下油菜葉片中可溶性蛋白含量差異如圖3,159-6×灃油520可溶性蛋白含量隨著污染土比例的增加,先升高后降低,在含50%和75%污染土配比環(huán)境下低于對(duì)照組Ⅰ;灃油520可溶性蛋白含量先降低后升高再降低,在含有25%和75%污染土配比環(huán)境下低于對(duì)照組Ⅰ,159-6可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)和灃油520一致,在25%污染土配比環(huán)境下低于對(duì)照組Ⅰ。在含25%和75%污染土配比環(huán)境中,159-6×灃油520和灃油520可溶性蛋白含量均顯著高于159-6。除在50%污染土配比環(huán)境下,灃油520可溶性蛋白含量最高,與159-6×灃油520和159-6有顯著差異。

圖3 不同污染土配比處理對(duì)油菜可溶性蛋白含量的影響

2.2.3 不同油菜葉綠素含量的差異分析 不同污染土配比對(duì)油菜葉綠素含量的影響如圖4,隨著污染土比例的增加,油菜葉綠素含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。100%營(yíng)養(yǎng)土環(huán)境中,159-6×灃油520葉綠素含量最高,顯著高于159-6。在25%污染土環(huán)境下,159-6葉綠素含量顯著高于159-6×灃油520和灃油520;在50%和75%污染土配比環(huán)境中,159-6×灃油520葉綠素含量均顯著高于灃油520和159-6。

圖4 不同污染土配比處理對(duì)油菜葉綠素含量的影響

2.2.4 不同油菜抗氧化酶活性和MDA含量的差異分析 不同污染土配比下油菜葉片中SOD、POD、CAT活性和MDA含量(以解質(zhì)量外)差異如圖5,SOD和CAT活性均隨著污染土比例增加先升高后降低,且在含75%污染土配比環(huán)境下均低于對(duì)照組Ⅰ;POD活性和MDA含量隨著污染土比例增加而逐漸升高。在含50%和75%污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的SOD活性均最高;除75%污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的POD活性均最高,其余污染土環(huán)境下灃油520的POD活性最高;不同污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的MDA含量均最低。

圖5 不同污染土配比處理對(duì)油菜SOD、POD、CAT活性和MDA含量的影響

2.3 相關(guān)基因表達(dá)情況分析

2.3.1 不同油菜光合作用相關(guān)基因表達(dá)量的差異分析 不同污染土配比下的油菜葉片中Bna0280620、Bna049040和BnaC08g46180D3個(gè)光合作用基因表達(dá)情況如圖6,Bna0280620和Bna049040基因在不同污染土配比環(huán)境下的油菜葉片中均下調(diào)表達(dá)。在25%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因僅在灃油520葉片中上調(diào)表達(dá);Bna0280620基因在159-6葉片中的表達(dá)量最高,在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量最低;Bna049040基因在159-6葉片中的表達(dá)量最高,在灃油520葉片中的表達(dá)量最低。在含50%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因僅在159-6×灃油520葉片中上調(diào)表達(dá);Bna0280620基因在159-6葉片中的表達(dá)量最高,在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量最低;Bna049040基因在灃油520葉片中的表達(dá)量最高,在159-6葉片中的表達(dá)量最低。在含75%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因在3個(gè)材料中均上調(diào)表達(dá),其中在灃油520葉片中的表達(dá)量最高,在159-6葉片中的表達(dá)量最低,Bna0280620和Bna049040基因在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量最高。

圖6 不同污染土配比處理下光合作用相關(guān)基因在不同類型油菜葉片中表達(dá)情況

2.3.2 不同油菜抗重金屬相關(guān)基因表達(dá)量的差異分析 不同污染土配比下的油菜葉片中4個(gè)抗重金屬相關(guān)基因BnaA08g04000D、BnaA09g24330D、BnNRAMP1和BnPri-miR167a的表達(dá)情況如圖7所示,BnaA08g04000D、BnaA09g24330D基因表達(dá)量隨著污染土比例升高在3個(gè)材料葉片中先降低后升高;BnNRAMP1和BnPri-miR167a基因表達(dá)量均在75%污染土配比下的159-6×灃油520葉片中達(dá)最高值。在含25%污染土環(huán)境下,BnNRAMP1和BnPri-miR167a基因在159-6×灃油520和159-6葉片中表達(dá)量均顯著高于灃油520。在含50%和75%污染土配比環(huán)境中,4個(gè)基因在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量均最高,在159-6葉片中的表達(dá)量最低,以上差異均達(dá)顯著水平。

圖7 不同污染土配比處理下抗重金屬相關(guān)基因在不同類型油菜葉片中表達(dá)情況

2.4 基因表達(dá)與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4.1 污染土環(huán)境下油菜光合相關(guān)基因表達(dá)量與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析 對(duì)污染土環(huán)境下不同油菜葉片的基因表達(dá)量與生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表2所示,基因表達(dá)量與可溶性蛋白和葉綠素的關(guān)系更密切。Bna0280620基因在159-6中的表達(dá)量與鮮質(zhì)量、可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān),其中與可溶性蛋白含量的相關(guān)性最大;在159-6×灃油520中的表達(dá)量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)。Bna049040基因在159-6×灃油520中的表達(dá)量與可溶性糖呈顯著正相關(guān)。BnaC08g46180D基因表達(dá)量與生理指標(biāo)的關(guān)系較Bna0280620和Bna049040基因更密切,且在159-6中的相關(guān)性普遍低于灃油520和159-6×灃油520。BnaC08g46180D基因在159-6×灃油520中的表達(dá)量與鮮質(zhì)量呈顯著正相關(guān)、與干質(zhì)量、葉綠素含量呈顯著正相關(guān),與可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān),其中與可溶性蛋白的相關(guān)性最大;在灃油520中的表達(dá)量與各個(gè)生理指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān),其中與葉綠素的相關(guān)性最大;在159-6中的表達(dá)量與干質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān),與葉綠素呈顯著負(fù)相關(guān),其中與葉綠素的相關(guān)性最大。

表2 光合作用相關(guān)基因表達(dá)量與生理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

2.4.2 污染土環(huán)境下油菜重金屬脅迫相關(guān)基因表達(dá)量與酶活性的相關(guān)性分析 對(duì)污染土環(huán)境下不同油菜葉片的基因表達(dá)量與酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表3所示。基因表達(dá)量與CAT和MDA的關(guān)系最密切,BnPri-miR167a基因在3個(gè)油菜中的表達(dá)量均與CAT和MDA有較高的相關(guān)性,其余基因在159-6×灃油520和159-6中的表達(dá)量也與CAT和MDA有較高的相關(guān)性。另外,各個(gè)基因的表達(dá)量與灃油520中的SOD關(guān)系最密切,其中BnNRAMP1基因的相關(guān)性最大;與灃油520×159中的POD關(guān)系最密切,其中BnPri-miR167a基因的相關(guān)性最高。

表3 重金屬脅迫相關(guān)基因表達(dá)量與酶活性之間的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

土壤中重金屬元素在進(jìn)入植物體后,極易在體內(nèi)富集,會(huì)影響植物的各項(xiàng)生理指標(biāo),延緩植物生長(zhǎng),甚至?xí)怪参锼劳鯷25]。甘藍(lán)型油菜較其余植物相比具有更高的生物量,更能耐受土壤中的重金屬脅迫[26],但不同類型的油菜對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)能力不同[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn),3種甘藍(lán)型油菜在不同配比重金屬污染土環(huán)境下均能正常生長(zhǎng)發(fā)育,表明油菜對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的耐性;其中,三交油菜159-6×灃油520的干鮮質(zhì)量最高,且均顯著高于對(duì)照組Ⅰ,說(shuō)明其生長(zhǎng)力更強(qiáng),對(duì)重金屬具有更高的耐性,適合種植在重金屬污染的土壤中。

葉綠素含量的高低可反映出光合能力的強(qiáng)弱,葉綠素含量的增加,可以明顯提高植物的光合能力[29]。而過(guò)量的重金屬離子會(huì)影響葉綠素的合成和光合相關(guān)基因的表達(dá)水平,抑制植物的光合作用,破壞生理過(guò)程,阻礙植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)Bna0280620和Bna049040基因在不同污染土配比環(huán)境下的油菜葉片中的表達(dá)量均受到抑制,而在高濃度的重金屬污染土環(huán)境下,誘導(dǎo)了BnaC08g46180D基因的表達(dá)。此外,通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)光合相關(guān)基因表達(dá)量與可溶性蛋白和葉綠素含量有較高相關(guān)性,在含50%和75%污染土環(huán)境下,159-6×灃油520的葉綠素含量最高,在含50%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量最高,在含75%污染土環(huán)境下,Bna0280620和Bna049040基因在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量最高。結(jié)果表明,在含50%和75%污染土環(huán)境下,159-6×灃油520的光合能力更強(qiáng),有助于積累更多的干物質(zhì),從而提高對(duì)重金屬的耐受性。

植物在重金屬脅迫下會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),為了免受ROS的侵害,油菜會(huì)采取防御機(jī)制,產(chǎn)生大量的SOD、POD和CAT,來(lái)幫助清除活性氧物質(zhì),減少重金屬對(duì)機(jī)體的損傷,提高對(duì)重金屬的適應(yīng)能力[33]。張敏[34]發(fā)現(xiàn),在Cd脅迫下CAT和SOD活性均隨脅迫濃度增加呈先增后降趨勢(shì),本研究結(jié)果與其一致,且在50%和75%污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的SOD活性最高。MDA含量是評(píng)估抗氧化劑對(duì)重金屬脅迫的破壞程度的重要指標(biāo),重金屬脅迫下,當(dāng)油菜膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA含量逐漸增多,說(shuō)明膜脂過(guò)氧化作用逐漸增強(qiáng),膜受害程度逐漸加重,給油菜組織細(xì)胞帶來(lái)極大的損傷[35]。本研究中MDA含量隨著重金屬污染土比例的增加而升高,說(shuō)明重金屬使油菜機(jī)體受到了損傷,但是159-6×灃油520的MDA含量最低,說(shuō)明受到的損傷更小。此外,通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)。抗重金屬相關(guān)基因表達(dá)量與抗氧化酶活性和MDA具有較高的相關(guān)性,且在50%和75%污染土配比環(huán)境下,4個(gè)抗重金屬基因在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量最高,說(shuō)明159-6×灃油520對(duì)重金屬的適應(yīng)能力更強(qiáng)。

以上結(jié)果表明,3種不同雜交類型的油菜在重金屬污染土環(huán)境下均能正常生長(zhǎng),且具有一定的適應(yīng)能力,其中,159-6×灃油520在重金屬土壤中的抗逆能力最強(qiáng),可能更適合作為土壤修復(fù)植物。

在不同污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均高于對(duì)照組Ⅰ,159-6鮮質(zhì)量均高于對(duì)照組Ⅰ,灃油520鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均低于對(duì)照組Ⅰ;且159-6×灃油520鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著高于159-6和灃油520。除含25%污染土環(huán)境下159-6葉綠素含量最高外,其余159-6×灃油520的葉綠素含量均最高。除含50%污染土環(huán)境下灃油520可溶性蛋白含量最高外,其余159-6×灃油520的可溶性蛋白含量均最高。在50%和75%污染土環(huán)境下,159-6×灃油520的SOD活性均最高,MDA含量均低于159-6和灃油520;4個(gè)抗重金屬相關(guān)基因(BnaA08g04000D、BnaA09g24330D、BnNRAMP1和BnPri-miR167a)在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量均高于159-6和灃油520;在75%污染土環(huán)境下Bna0280620和Bna049040基因在159-6×灃油520葉片中的表達(dá)量也高于159-6和灃油520。