劉保財(cái) 陳菁瑛 張武君 黃穎楨 趙云青 劉劍超 危智誠(chéng)

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心，福州 350003；3. 福建省南平市邵武市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，邵武 354000；4. 福建和平古鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，邵武 354000）

種子是植物貯藏營(yíng)養(yǎng)和繁育后代的重要器官，也是人及家禽畜牧動(dòng)物的主要食物來源［1]，種子萌發(fā)過程因胚發(fā)育程度不同而存在差異，具有成熟胚的種子，遇水吸脹后胚根首先突破種皮并向下生長(zhǎng)形成根，胚芽向上生長(zhǎng)露出地面形成莖，從而形成完整的植株［2-3]。然而部分植物種子不具有成熟胚，萌發(fā)過程存在特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，如黃精（Polygonatum sibiricum）［4]、多花黃精（Polygonatum cyrtonema）［5]、滇重樓（Paris polyphylla）［6]等百合科具有多年生根莖植物的種子，這些種子萌發(fā)過程中存在第一節(jié)微根莖形成的特殊萌發(fā)現(xiàn)象［7-9]。

多花黃精（P. cyrtonema）系百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本［10]，《中華人民共和國(guó)藥典》（2020）規(guī)定的中藥飲品黃精的基原物種之一，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎的功效，藥食同源物種，甚至一些地方將其列為雜糧作物，近年逐步開始大規(guī)模的人工栽培［11-12]。據(jù)報(bào)道［8]及結(jié)合筆者研究，多花黃精種子萌發(fā)過程如下，胚根首先突破種皮（圖1-A），然后生長(zhǎng)一段時(shí)間（圖1-B），在中胚軸的地方，逐步膨大（圖1-C），形成最初的根莖（微根莖，圖1-D），進(jìn)一步在其上端分化形成芽生長(zhǎng)點(diǎn)，生長(zhǎng)第一片真葉，同時(shí)下端分化形成側(cè)根/不定根，從而開始每年在根莖上形成芽和根的生長(zhǎng)模式。在此萌發(fā)過程中，從胚根突破種皮到微根莖的形成，基本全部利用種子儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微根莖形成后，逐步變?yōu)榫G色，開始光合作用，原種子逐步變?yōu)榭瞻T狀態(tài)，由“異養(yǎng)”變?yōu)椤白责B(yǎng)”（圖1-E），進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，形成小苗（圖1-F）。

圖1 多花黃精種子萌發(fā)過程Fig. 1 Germination process of P. cyrtonema seeds

當(dāng)前，為解決多花黃精生產(chǎn)上種苗短缺問題，對(duì)多花黃精種子催芽、栽培等進(jìn)行了研究并報(bào)道［8,11-12]，然而關(guān)于其萌發(fā)過程中調(diào)控微根莖發(fā)育的關(guān)鍵基因及參與的生理生化變化報(bào)道較少，制約了多花黃精種子生理、生產(chǎn)上微根莖的快速生長(zhǎng)及其開發(fā)利用等研究，為此開展了多花黃精種子萌發(fā)過程中微根莖發(fā)育研究。本文以胚根突破種皮（圖1-A）、微根莖（圖1-D）和根狀莖變綠（圖1-E）3個(gè)萌發(fā)階段為實(shí)驗(yàn)材料，基于二代高通量測(cè)序技術(shù)，進(jìn)一步借助生信分析相關(guān)方法，對(duì)微根莖發(fā)育過程中的表達(dá)差異基因進(jìn)行分析，以期揭示多花黃精種子微根莖發(fā)育過程中基因表達(dá)特征及其參與的通路變化，為多花黃精的種子生理、形態(tài)結(jié)構(gòu)、育種與栽培等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采集于福建省泰寧縣野生多花黃精，經(jīng)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所陳菁瑛研究員鑒定為Polygonatum cyrtonema Hua，種植于邵武市和平鎮(zhèn)和平村林下。2019年11月采集10株果皮發(fā)黑的成熟果實(shí)，經(jīng)8 d堆置發(fā)酵后，用手捏碎變軟的果實(shí)，漂去果皮等雜質(zhì)并用水清洗，干凈的種子作為試驗(yàn)材料備用。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將洗干凈的種子用無菌水沖洗10遍，移到超凈工作臺(tái)上，57%的酒精浸泡1 min，然后用無菌水沖洗5遍，放入經(jīng)過121℃滅菌30 min的河沙內(nèi)，再倒入少量的無菌水，保持沙層濕潤(rùn)，進(jìn)行沙藏，每周定期檢查并補(bǔ)充水分；150 d后，挑選胚剛突破種皮的種子（編號(hào)A，圖1-A）和形成的微根狀莖（編號(hào)D，圖1-D），種植20 d后，挑選變綠的微根狀莖（編號(hào)E，圖1-E），這些種子和微根狀莖用清水沖洗干凈，吸取表面的水分，立即放入液氮中凍存10 min，然后移入-80℃冰箱中保存，直到RNA提取。

1.2.2 建庫(kù)測(cè)序 采用DP441-RNAprep pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取總RNA，NanoPhotometer spectrophotometer檢測(cè)RNA純度（OD260/280及OD260/230比值）和Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)RNA完整性。進(jìn)一步使用試劑盒Illumina 的 NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit，參照說明書構(gòu)建文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫(kù)插入片段大小檢測(cè)，用RT-qPCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。庫(kù)檢合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司應(yīng)用Illumina 測(cè)序完成序列的測(cè)定。

1.2.3 基因表達(dá)水平分析 采用RSEM軟件［13]，調(diào)用Bowtie2對(duì)比并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列（Ref），將每個(gè)樣品的clean reads匹配到Ref，獲得單個(gè)樣品的匹配率，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品中基因比對(duì)到的reads數(shù)目，并進(jìn)行FPKM（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）轉(zhuǎn)換，獲得單個(gè)樣品中基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。

1.2.4 差異基因表達(dá)分析 使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)地DESeq2 R包［14]（1.10.1），進(jìn)行兩個(gè)條件/組的差異表達(dá)分析，使用Benjamini和Hochberg的方法校正得到的P值（Padj）以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，Padj＜0.05的基因認(rèn)定為差異表達(dá)?；?GOseq［15]所述方法對(duì)篩選到的DEGs進(jìn)行GO富集分析。基于KEGG注釋結(jié)果，使用 KOBAS，Padj＜0.05的基因認(rèn)定為差異表達(dá)，進(jìn)行 Pathway富集分析。

1.2.5 RT-qPCR 驗(yàn)證 隨機(jī)選取通路上的7個(gè)差異基因，設(shè)計(jì)引物和合成引物序列見表1，以種子萌發(fā)的3個(gè)不同階段的RNA 為模板，按照 TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）（AT341）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照 PerfectStart? Green qPCR SuperMix（+Dye II）試劑盒說明書，以cDNA為模板，在ABI QuantStudio 3儀上完成 RT-qPCR。用2-ΔΔCt方法［16]計(jì)算每個(gè)基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量，Actin為內(nèi)參基因。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Gene-specific primers used in RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 微根莖發(fā)育過程基因表達(dá)水平

以組裝后的序列為模板，將胚根突破種皮（A1、A2、A3）、微根狀莖形成（D1、D 2、D3）和微根狀莖變?yōu)榫G色（E1、E2、E3）的clean reads與之比對(duì)，各樣本的匹配reads數(shù)目和匹配率見表2，胚根突破種皮時(shí)匹配率為71.63%-74.23%，微根狀莖形成時(shí)的匹配率為73.60%-75.09%，綠色微根狀莖的匹配率為74.81%-76.03%。對(duì)各樣品中表達(dá)的Cluster數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并轉(zhuǎn)換為FPKM，再根據(jù)FPKM大小劃分區(qū)間，各區(qū)間的表達(dá)量及所占比例見表3，各樣品的FPKM＞15的Cluster數(shù)量沒有較大的差異，即各樣品中高表達(dá)的基因數(shù)目差異較少。

表2 各樣品reads 與組裝轉(zhuǎn)錄本比對(duì)Table 2 Mapped results of sample reads and assembly transcripts

表3 樣品表達(dá)水平FPKM區(qū)間數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 3 FPKM interval statistics of sample expressed levels

2.2 微根莖形成與胚根突破種皮的差異基因分析

將微根莖形成時(shí)與胚根突破種皮比較（圖2-A），共有顯著性差異的Unigenes 17907條，其中上調(diào)的有9797條，下調(diào)的為8110條。進(jìn)一步將上調(diào)或下調(diào)差異基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中富集分析，選取最顯著的40個(gè)Terms繪制柱狀圖（圖2-B），微根莖形成時(shí)與胚根突破種皮相比，所有的Terms中上調(diào)的Unigenes數(shù)量大于下調(diào)的Unigenes數(shù)量。就差異Unigenes數(shù)量而言，無論是上調(diào)還是下調(diào)，主要集中富集在生物過程（biological process, BP）和分子功能（molecular function, MF），而細(xì)胞組成（cellular component, CC）的Unigenes數(shù)量相對(duì)較少。在BP中參與代謝過程（metabolic process）的差異基因有4952條，其中上調(diào)的有3135條（如Cluster-68615.36386、Cluster-68615.82941等），下調(diào)的有1817條（如Cluster-68615.49491、Cluster-68615.48139等）；參與蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation）、磷酸化（phosphorylation）、含磷化合物代謝過程（phosphate-containing compound metabolic process）、磷代謝過程（phosphorus metabolic process）等與磷相關(guān)的Terms均有較高的差異表達(dá)。在MF中主要參與的有催化活性（catalytic activity）、轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、離子結(jié)合（ion binding）等Terms，其中參與催化活性的差異基因有4196條，上調(diào)的有2814條（如Cluster-68615.86087、Cluster-68615.91384等），下調(diào)的有1382條（如Cluster-68615.14912、Cluster-68615.64310等）。CC與MF和BP相比，參與的差異基因較少，顯著差異的前40個(gè)Terms中，Terms數(shù)量也較少。

圖2 DvsA差異表達(dá)基因Fig. 2 DvsA different expressed genes

通過Pathway顯著性富集確定差異基因間相互協(xié)調(diào)及其生物學(xué)功能，將差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集后，挑選了富集最顯著的20條pathway條目進(jìn)行展示（圖3），差異基因主要富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、光合作用（photosynthesis）、光合作用-天線蛋白（photosynthesis - antenna proteins）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、黃酮類生物合成（flavonoid biosynthesis）等通路中，而這些通路與種子萌發(fā)過程中胚形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育和代謝有直接的關(guān)聯(lián)。富集到差異最顯著苯丙烷生物合成通路中基因有240條，有顯著差異的有108條（如Cluster-32281.0、Cluster-68615.50869等）。富集到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的差異基因有354條，有顯著差異的有133條（如Cluster-68615.83466、Cluster-68615.49580等）。富集到淀粉和蔗糖的代謝通路的基因有397條，有顯著差異的有132條（如Cluster-68615.91668、Cluster-68615.7364等）。

圖3 DvsA差異基因KEGG通路富集Fig. 3 KEGG pathway enrichment of DvsA differential gene

為了進(jìn)一步解析差異基因中上調(diào)和下調(diào)基因參與的生理與代謝通路，分別將上調(diào)的差異基因的前20條通路（圖4-A）和下調(diào)的前20條通路進(jìn)行了KEGG通路富集（圖4-B）。在上調(diào)的差異表達(dá)基因中，主要富集在了芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成（stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、光合作用-天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）等通路中，其中富集到淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路的差異基因顯著上升。下降的差異基因主要富集在了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（valine, leucine and isoleucine biosynthesis）、輔酶Q及其他萜-醌合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、剪接體（splicesome）、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)（RNA transport）等通路中，其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、剪接體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路中富集的差異基因數(shù)量明顯下降。而無論是表達(dá)上調(diào)還是表達(dá)下調(diào)的差異基因中，富集到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的基因均有大量表達(dá)，即植物激素在微根莖的形成中發(fā)揮了重要作用。

圖4 TOP 20 差異基因KEGG富集結(jié)果Fig. 4 KEGG enrichment results of TOP 20 differential genes

基于上述分析，淀粉和蔗糖的代謝與植物激素代謝在根莖初步形成過程中具有關(guān)鍵作用，因此進(jìn)一步將DvsA的差異基因映射到淀粉和蔗糖代謝（ko00500）通路，結(jié)果（圖5）表明，參與編碼磷酸蔗糖合酶（sucrose-phosphate synthase, 2.4.1.14）、己糖激酶（hexokinase, 2.7.1.1）和α-海藻糖酶（alphatrehalase, 3.2.1.28）的差異轉(zhuǎn)錄本均全部下調(diào)，參與編碼α-淀粉酶（alpha-amylase, 3.2.1.1）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase, 2.4.1.1）、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（4-alpha-glucanotransferase, 2.4.1.25）、麥芽糖酶-葡糖淀粉酶（3.2.1.20maltase-glucoamylase）、β-D-呋喃果糖苷水解酶（beta-fructofuranosidase, 3.2.1.26）、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶（glucose-1-phosphate adenylyltransferase, 2.7.7.27）等的差異轉(zhuǎn)錄本均全部上調(diào)，而參與編碼果糖激酶（fructokinase, 2.7.1.4）、β-葡萄糖苷酶（beta-glucosidase, 3.2.1.21）等的差異轉(zhuǎn)錄本則既有上調(diào)也有下調(diào)。

圖5 參與淀粉和蔗糖代謝的DvsA差異表達(dá)基因Fig. 5 DvsA differentially expressed genes involved in starch and sucrose metabolism

為了進(jìn)一步剖析植物激素相關(guān)基因?qū)ξ⒏o初步形成的影響，將DvsA的差異基因映射到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）通路上，結(jié)果（圖6）表明，參與編碼生長(zhǎng)素（包括AUX/IAA、ARF、GH3、SAUR）、細(xì)胞分裂素（B-ARR、A-ARR）和赤霉素（TF）各關(guān)鍵酶的基因均有上調(diào)和下調(diào)，然而這些基因中，除 ARF和GH3外，所有表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)多于表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)，如AUX/IAA中，僅有1條基因表達(dá)下調(diào)，11條表達(dá)上調(diào)。參與編碼油菜素內(nèi)酯各關(guān)鍵酶基因表達(dá)均上調(diào)，參與編碼脫落酸關(guān)鍵酶（PYR/PYLH、ABF）基因表達(dá)全部下調(diào)，編碼關(guān)鍵酶（PP2C、SnPK2）基因的下調(diào)轉(zhuǎn)錄本多于上調(diào)轉(zhuǎn)錄本，再次說明參與編碼植物激素的基因在微根莖形成中具有重要作用，而油菜素內(nèi)酯可能是根莖初步形成的一類關(guān)鍵激素。

圖6 參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的DvsA差異表達(dá)基因Fig. 6 DvsA differentially expressed genes involved in plant hormone signal transduction

2.3 微根莖變綠前后差異基因分析

比較微根莖變綠前后差異基因表達(dá)（圖7-A），共有顯著性差異的Unigenes 26833條，其中上調(diào)的有14567條，下調(diào)的為12266條。進(jìn)一步將上調(diào)或下調(diào)差異基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中富集，選取最顯著的40個(gè)Terms繪制柱狀圖（圖7-B），微根莖變綠前后相比，除了與過氧化酶反應(yīng)有關(guān)的3個(gè)Terms外，所有的同一Terms中上調(diào)的Unigenes數(shù)量大于下調(diào)的Unigenes數(shù)量。就差異Unigenes數(shù)量而言，無論是上調(diào)還是下調(diào)，主要富集在生物過程（bological process, BP），而分子功能（molecular function, MF）和細(xì)胞組成（cellular component, CC）的Unigenes數(shù)量相對(duì)較少。在BP中參與代謝過程（metabolic process）的差異基因有6896條，其中上調(diào)的有3758條（如Cluster-68615.21356、Cluster-68615.32031等），下調(diào)的有3138條（如Cluster-68615.92980、Cluster-68615.3727等）；參與肽生物合成過程（peptide biosynthetic process）、酰胺生物合成過程（amide biosynthetic process）、有機(jī)氮化合物生物合成過程（organonitrogen compound biosynthetic process）等生物合成通路中的基因均得到強(qiáng)烈富集，即這些基因參與了微根莖變綠前后的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理活性。而在MF中主要參與的有催化活性（catalytic activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）等Terms，其中參與催化活性的差異基因有5518條，上調(diào)的有2893條（如Cluster-15152.0、Cluster-68615.16027等），下調(diào)的有2625條（如Cluster-68615.69338、Cluster-68615.31773等）。在CC過程中，差異基因主要參與細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、大分子復(fù)合物差異（macromolecular complex）等Terms中。

圖7 EvsD差異表達(dá)基因Fig. 7 EvsD differently expressed genes

通過Pathway顯著性富集確定差異基因間相互協(xié)調(diào)及其生物學(xué)功能，將差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集后，挑選了富集最顯著的20條pathway條目進(jìn)行展示（圖8），差異基因主要富集于核糖體（ribosome）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、光合作用（photosynthesis）、光合作用-天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins）、吞噬體（phagosome）、卟啉和葉綠素代謝（porphyrin and chlorophyll metabolism）等通路中，而這些通路直接體現(xiàn)了種子由“異養(yǎng)”向“自養(yǎng)”的轉(zhuǎn)變，如富集到差異最顯著核糖體通路中基因的有1403條，有顯著差異的有640條；富集到光合作用、光合作用-天線蛋白的差異基因分別有97條和41條，有顯著差異的有63條和33條。

圖8 TOP 20差異基因KEGG富集結(jié)果Fig. 8 KEGG enrichment results of TOP 20 differential genes

為了進(jìn)一步解析差異基因中上調(diào)和下調(diào)基因參與的生理與代謝通路，分別將上調(diào)的差異基因的前20條通路和下調(diào)的前20條通路進(jìn)行了KEGG通路富集（圖9-A和9-B）。整體而言，上調(diào)的差異基因數(shù)多于下調(diào)的差異基因數(shù)。在上調(diào)的差異基因中，主要富集在了光合作用（photosynthesis）、核糖體（ribosome）、光合作用-天線蛋白（photosynthesisantenna proteins）等通路中，其中注釋到光合作用的有61條、光合作用-天線蛋白的有33條、光合生物中的碳固定的60條。差異基因中表達(dá)量降低的基因主要富集在了苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）、吞噬體（phagosome）等通路中，其中富集于淀粉和蔗糖代謝通路中的差異基因有114條。值得注意的是植物-病原體相互作用通路中富集了74條?；谕贩治霰砻?，微根莖變綠前，仍然是以淀粉、蔗糖代謝為主，變綠后，光合相關(guān)通路的基因進(jìn)行了表達(dá)與上調(diào)，同時(shí)與植物病原互作的基因開始高表達(dá)。

微根莖變綠前后，光合通路中相關(guān)基因具有關(guān)鍵作用，因此進(jìn)一步將EvsD的差異基因比對(duì)到光合作用（ko00195）通路上（圖10），參與編碼光合系統(tǒng)I（PsaA、PsaB、PsaD、PsaE、PsaF、PsaG、PsaH、PsaK、PsaL、PsaN、PsaO）、光合系統(tǒng)Ⅱ（PsbA、PsbB、PsbC、PsbK、PsbO、PsbP、PsbQ、PsbR、PsbS、PsbY、PsbZ、Psb27、Psb28）等關(guān)鍵酶的基因表達(dá)均為上調(diào)，僅有少量的如編碼三磷酸腺苷酶ε基因表達(dá)下調(diào)。

2.4 差異基因RT-qPCR分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組獲得的數(shù)據(jù)，隨機(jī)選擇具有顯著差異的7個(gè)基因，采用RT-qPCR分析（圖11），各基因在各樣本的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的趨勢(shì)基本一致。

圖11 7個(gè)差異基因的RT-qPCR驗(yàn)證Fig. 11 Verification of seven selected DEGs by RT-qPCR

3 討論

3.1 微根莖發(fā)育前后的基因表達(dá)特征：淀粉和蔗糖的代謝與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

多花黃精種子從胚根突破種皮到微根莖形成，發(fā)生一系列表觀形態(tài)特征變化，陳怡等［8]對(duì)多花黃精的萌發(fā)過程進(jìn)行了形態(tài)解剖觀察，明確了成熟的多花黃精種子，其胚未分化出明顯的子葉、胚芽和胚根，隨著種子的萌發(fā)伴隨著胚乳的降解而分化形成成熟胚。從胚根突破種皮到微根莖形成的差異基因經(jīng)GO數(shù)據(jù)庫(kù)中富集分析，主要參與代謝過程、催化活性、單生物代謝過程、氧化還原酶活性、核糖體等，KEGG顯著性富集表明差異基因主要富集于核糖體、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝等通路中，上調(diào)的差異基因主要富集在了淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中，下調(diào)的差異基因主要富集在了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、剪接體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路中，與前人報(bào)道多花黃精種子含有淀粉、粗脂肪、可溶性糖、游離氨基酸和植物甾醇含量較高，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化酶活性結(jié)果一致［17-19]。進(jìn)一步淀粉和蔗糖的代謝通路比對(duì)分析，參與編碼磷酸蔗糖合酶、己糖激酶和α-海藻糖酶的差異轉(zhuǎn)錄本均全部下調(diào)，參與編碼α-淀粉酶、糖原磷酸化酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖酶-葡糖淀粉酶、β-D-呋喃果糖苷水解酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶等的差異轉(zhuǎn)錄本均全部上調(diào)，而參與編碼果糖激酶、β-葡萄糖苷酶等的差異轉(zhuǎn)錄本則既有上調(diào)也有下調(diào)，淀粉水解成葡萄糖，可能為微根莖形成提供必要的能量［19]。激素種類和含量的變化對(duì)多花黃精種子萌發(fā)具有顯著影響，多花黃精種子萌發(fā)過程中出現(xiàn)IAA、GA3和TZR含量呈上升-下降-上升趨勢(shì)，ABA含量降低并維持在較低水平［5,20]，這與本文所述的編碼生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素各關(guān)鍵酶的基因均有上調(diào)和下調(diào)的結(jié)果基本一致。而參與編碼脫落酸關(guān)鍵酶（PYR/PYLH、ABF）基因表達(dá)全部下調(diào)，編碼油菜素內(nèi)酯各關(guān)鍵酶均為上調(diào)，可見油菜素內(nèi)酯可能是根莖初步形成的一類關(guān)鍵激素，與報(bào)道的油菜素內(nèi)酯調(diào)控馬鈴薯塊莖的形成結(jié)果一致［21]，其能否作為外源激素用以促進(jìn)微根莖的膨大，有待進(jìn)一步研究與分析。

3.2 外界環(huán)境通過內(nèi)在成分影響種子萌發(fā)與微根莖的發(fā)育

低溫可以有效打破和縮短黃精種子休眠，促進(jìn)其發(fā)育不全的胚成熟、突破種皮和發(fā)芽，主要原因也是低溫誘導(dǎo)了激素相關(guān)基因的表達(dá)，與本文研究的參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因可能調(diào)控多花黃精微根莖發(fā)育結(jié)果一致［22-24]。層積處理是打破多花黃精種子休眠的有效方法之一，種子沙藏后糖分種類、含量等均發(fā)生了變化，提高了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)［20,25]。外源激素的處理也有利于打破多花黃精種子的休眠，6-芐氨基嘌呤可打破上胚軸休眠，從而促進(jìn)多花黃精種子的發(fā)芽［26]。有些微生物的分泌物也具有促進(jìn)多花黃精種子萌發(fā)的效果［27]，這些分泌物是否促進(jìn)微根莖發(fā)育，有待進(jìn)一步研究。上述可知，多花黃精種子胚根突破種皮到第一節(jié)根莖的形成，涉及許多生理變化與形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育，因此受到內(nèi)部和外界多種因素綜合影響。

3.3 微根莖變綠后即可進(jìn)行光合作用

微根莖變綠前，以種子內(nèi)貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗為主，變綠后，種子內(nèi)貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本消耗完畢，開始逐步依靠自身光合作用進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育。因此微根莖變綠前后顯著性差異基因GO富集分析，主要參與了代謝過程、肽生物合成過程、催化活性等；KEGG顯著性富集表明，差異基因主要富集于核糖體、淀粉和蔗糖代謝、光合作用等通路中，這與前人報(bào)道的多花黃精種子萌發(fā)過程中差異基因主要參與碳代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和多糖的代謝結(jié)果一致［20,28]。微根莖變綠前后的差異基因在光合通路上比對(duì)后，除編碼三磷酸腺苷酶ε等少量基因表達(dá)下調(diào)外，均為上調(diào)，表明微根莖已逐步開始光合作用，與光照影響多花黃精種子的萌發(fā)一致［22]，但光合作用的強(qiáng)弱尚待進(jìn)一步研究。

3.4 微根莖營(yíng)養(yǎng)價(jià)值亟需評(píng)價(jià)

近年對(duì)多花黃精根狀莖的多糖［29-30]、甾體皂苷生物合成［31-32]等關(guān)鍵基因進(jìn)行了研究，并解析了根莖多糖的藥理［33-34]，然而多花黃精微根莖發(fā)育過程中所產(chǎn)生的多糖是否具有類似的功效，有待進(jìn)一步研究。所產(chǎn)生的微根莖能否作為類似“豆芽”的芽菜類開發(fā)，也亟需進(jìn)一步對(duì)其營(yíng)養(yǎng)、藥理、毒理等開展評(píng)價(jià)。

綜上，通過本文闡述，明確了微根莖基因表達(dá)特征，為多花黃精種子萌發(fā)的生理、生產(chǎn)上促進(jìn)微根莖快速膨大、微根莖的開發(fā)利用等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究獲得了多花黃精種子萌發(fā)過程中不同萌發(fā)階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，參與淀粉和蔗糖代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因在微根莖形成中發(fā)揮了重要作用，尤其是編碼油菜素內(nèi)酯通路關(guān)鍵酶的基因。微根莖變綠后，光合相關(guān)基因得到大量表達(dá)，已具有光合作用能力。