蔡衛(wèi)超，曹衛(wèi)紅，胡大利，葉超，楊霖璟，李晶晶，林威鋼，仇靈江

·論 著·

mRNA水平探究人脂肪干細胞對SD大鼠放射性皮膚損傷的炎癥修復作用

蔡衛(wèi)超，曹衛(wèi)紅，胡大利，葉超，楊霖璟，李晶晶，林威鋼，仇靈江

浙江省臺州醫(yī)院整形美容科，浙江臺州 317000

從mRNA水平探究人脂肪干細胞（human adipose-derived stem cells，H-ADSCs）在SD大鼠放射性皮膚損傷中的作用及炎癥機制。選取15只SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法分成5組，每組3只。給予各組大鼠背部皮膚45Gy電子線照射，分別于照射后0周、1周、2周、3周、4周后處死并取組織標本，檢測皮膚組織內(nèi)炎癥因子mRNA水平。選取35只SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法分成空白對照組（=7）、PBS組（=14）和ADSCs組（=14）?？瞻讓φ战M不做任何處理，PBS組和ADSCs組大鼠背部皮膚給予45Gy電子線照射，輻射后48h起，每72h完成1次注射，共5次，PBS組的大鼠注射1ml PBS，ADSCs組大鼠注射1ml含ADSCs的PBS，共注射5次。觀察大鼠皮膚大體形態(tài)及病理組織學損傷，進行皮膚損傷評分，同時檢測大鼠皮膚組織內(nèi)炎癥因子mRNA表達水平變化。輻射后2d，兩組大鼠的Douglas and Fowler評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（0.05）；輻射后4～10d，ADSCs組大鼠的Douglas and Fowler評分均顯著低于PBS組（0.05）；至輻射后12d，兩組大鼠的Douglas and Fowler評分達到一致。輻射后2周，PBS組和ADSCs組大鼠均出現(xiàn)相同面積及相同程度的皮膚損傷；輻射后3周至處死前，ADSCs組大鼠皮膚損傷面積比值均顯著低于PBS組（0.05）。輻射后3周時，PBS組和ADSC組大鼠皮膚內(nèi)的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、IL-1β，TNF-α等炎癥因子的mRNA水平均顯著高于其他時間點（<0.05），且顯著高于空白對照組（<0.05）。與PBS組相比，ADSC組TNF-α，IL-1β，IL-6水平均顯著降低（0.05），IL-10顯著升高（<0.05）。PBS組與ADSC組的NOS及Arg水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）。H-ADSCs能有效促進大鼠放射性皮膚損傷創(chuàng)面修復，其機制可能是H-ADSCs促進抑炎因子表達、降低促炎因子表達，從而抑制炎癥反應發(fā)揮生物學效應。

人脂肪干細胞；放射性皮膚損傷；炎癥

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，放射治療逐漸成為重要的醫(yī)學治療手段，但常會導致不同程度的皮膚放射性損傷。目前在臨床對于輕中度放射性皮膚損傷的治療仍以藥物治療為主，但缺乏有效治療藥物；對于局部重度放射性皮膚損傷以外科手術(shù)為主，除此之外尚無其他有效的治療方法[1]。在皮膚放射性損傷后的愈合過程中，炎癥反應是首要環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是主要啟動因子，成纖維細胞的活化是中心環(huán)節(jié)，而脂肪組織參與創(chuàng)傷組織修復的全過程[2]。人源性脂肪干細胞（human adipose-derived stem cells，H-ADSCs）屬于間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），具有多向分化潛能。但其來源廣泛、提取便捷、免疫源性更低。有研究表明，H-ADSC可以通過旁分泌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等調(diào)節(jié)并干預炎癥反應，可能有助于創(chuàng)面的愈合過程[3]。基于此，本研究對H-ADSCs在SD大鼠放射性皮膚損傷中的作用進行觀察，從mRNA水平探討其干預創(chuàng)面局部炎癥反應的機制，以期為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與儀器

健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（300±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[動物實驗許可證號：SYXK（浙）2019-0030]。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠1只，室溫為18～24℃，濕度約為40%～60%。放置于固定的12h光照、12h黑暗環(huán)境中，自由攝取食物和水，飼料及飲用水符合實驗標準（動物實驗倫理審批號：tzy-2020053）。

電子線加速器：美國瓦里安公司；光學顯微鏡：日本Olympus公司；一抗：英國Abcam公司；HE染色試劑盒及4%甲醛：武漢谷歌生物科技有限公司；流式細胞儀：美國Beckman公司；細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 H-ADSCs的分離及培養(yǎng) 由水動力吸脂患者提供正常健康的顆粒狀脂肪組織，經(jīng)倫理委員會同意及供者知情同意（倫理審批號：K20230723）；采用膠原酶Ⅰ充分消化脂肪組織后PBS懸浮離心，尼龍紗布過濾；PBS重懸離心，接種培養(yǎng)得到細胞外基質(zhì)血管組分（stromal vascular franctiongel，SVF）；使用CD90和CD105作為表面標志物對SVF進行標記，通過流式細胞儀檢測H-ADSCs比例，經(jīng)過細胞篩選得到原代H-ADSCs后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 H-ADSCs的鑒定 光學顯微鏡下觀察脂肪干細胞的生長特點及形態(tài)；分別以CD90、CD105、CD73、CD29作為陽性標志，以CD11b、CD45、CD31、HLA作為陰性標志，通過流式細胞儀鑒定H-ADSCs。

1.2.3 成脂/成骨分化誘導 選取第3代H-ADSCs，誘導H-ADSCs成脂分化，進行油紅O染色，通過光學顯微鏡（×100）觀察，紅色為脂滴；成骨分化采用茜素紅S染色，通過光學顯微鏡（×100）觀察，紅色為鈣沉積。

1.2.4 動物模型建立與H-ADSCs干預 選取5只雄性SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法分成5組，每組3只，給予水合氯醛腹腔麻醉后接受輻射刺激（6MEV電子線，23EX型直線加速器），非照射部位以鉛板屏蔽，照射面積40mm×50mm，源皮距100cm，吸收劑量率為750cGy/min，總劑量45Gy。各組大鼠分別于輻射后0周、1周、2周、3周、4周后處死并取組織標本，通過熒光定量PCR檢測皮膚組織內(nèi)炎癥因子mRNA水平。選取35只雄性SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組（=7）、ADSCs組（=14）和PBSs組（=14）?？瞻讓φ战M不做任何處理，其余所有兩組大鼠同上述方法進行輻射干預，輻射后48h起，對各組大鼠每72h進行1次注射，共5次，其中ADSCs組注射1ml含600萬個ADSCs的PBS懸液，PBS組注射1ml PBS溶液。隨機選取ADSCs組及PBS組各7只大鼠，于輻射后3周處死并取組織標本，檢測皮膚組織內(nèi)炎癥因子mRNA水平并觀察蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色情況，ADSCs組和PBS組余下大鼠用于觀察皮膚照射損傷創(chuàng)面愈合情況。根據(jù)《急性放射性皮膚損傷分度診斷標準》[4]將皮膚損傷分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度，采用Douglas and Fowler評分評估皮膚損傷嚴重程度，通過計算每只大鼠未愈合皮膚面積占原始皮膚輻照面積的比例，分析創(chuàng)面愈合速度。Douglas and Fowler評分方法如下：0分為正常皮膚；0.75分為輕微紅腫；1分為嚴重紅腫；1.75分為開始脫毛；2分為脫毛面積為25%；2.25分為脫毛面積為33%；2.5分為脫毛面積為50%；2.75分為脫毛面積為66%；3分為脫毛面積>66%；3.25分為大部分區(qū)域脫毛且有滲出物；3.5分為大部分區(qū)域脫毛，有滲出物且表面有壞死。

1.2.5 HE染色和免疫組織化學染色 取大鼠皮膚組織于10%中性甲醛溶液固定，脫水包埋切片，滅活內(nèi)源性酶，展片后進行HE染色；白片封閉山羊血清，在室溫作用20min后檢測抗體，4℃過夜，二抗37℃孵育，DAB顯色，蘇木精復染，二甲苯透明，封片，光鏡（×40）下觀察。

1.2.6 皮膚組織內(nèi)炎癥因子mRNA水平檢測 輻射后3周處死3組大鼠并取皮膚標本，通過熒光定量PCR檢測皮膚組織內(nèi)炎癥因子mRNA水平。Trizol試劑抽提SD大鼠皮膚組織RNA，測定提取的RNA濃度及純度并定量，取等量RNA 5μl，在20μl逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，以5μl cDNA為模板加入靶基因上下游引物，在25μl體系中進行PCR擴增。檢測組織中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、白細胞介素（interleukin，IL）-10、IL-6、IL-1β以及精氨酸酶1（arginase1，Arg1）的變化情況。引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學方法

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 H-ADSCs的培養(yǎng)與鑒定情況

使用CD90和CD105作為表面標志物對SVF進行標記，可見SVF中含有約五分之一的H-ADSCs。培養(yǎng)24h后貼壁細胞大多為干細胞，含部分其他細胞。培養(yǎng)至第3代ADSCs，鏡下可見細胞形態(tài)全為梭形，見圖1。所提細胞表面分子檢測結(jié)果顯示CD90、CD105、CD73、CD29陽性表達，CD11b、CD45、CD31、HLA無表達，鑒定其為H-ADSCs，見圖2。取第3代細胞進行成脂誘導，H-ADSCs變?yōu)閳A形，細胞間質(zhì)中出現(xiàn)脂滴，油紅O染色后脂質(zhì)變紅；進行成骨誘導，H-ADSCs變?yōu)椴灰?guī)則形狀，見基質(zhì)中鈣鹽沉積，重疊生長，見圖3。

圖1 H-ADSCs細胞形態(tài)（×200）

2.2 PBS組和ADSCs組大鼠Douglas and Fowler評分及皮膚損傷面積比較

輻射后2d，兩組大鼠的Douglas and Fowler評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（0.05）；輻射后4～10d，ADSCs組大鼠的Douglas and Fowler評分均顯著低于PBS組（0.05）；至輻射后12d，兩組大鼠的Douglas and Fowler評分達到一致，見圖4。

圖2 H-ADSCs表面分子表達

A～D.分別為CD90、CD105、CD73、CD29陽性表達；E~H.分別為CD11b、CD45、CD31、HLA陰性表達

圖3 H-ADSCs的成脂/成骨誘導分化（×100）

A.成脂誘導；B.成骨誘導

輻射后2周，PBS組和ADSCs組大鼠均出現(xiàn)相同面積及相同程度的皮膚損傷，照射區(qū)域皮膚表面潮濕，毛發(fā)呈棕黃色，部分毛發(fā)脫落，輕輕觸碰有明顯痛覺反應，表皮極易撕脫，符合Ⅳ度放射性皮膚損傷表征。其中ADSCs組大鼠輻射刺激的邊緣區(qū)域最先出現(xiàn)瘢痕化，瘢痕化面積及瘢痕化速度超出PBS組大鼠。輻射后3周至處死前，ADSCs組大鼠皮膚損傷面積比值均顯著低于PBS組（0.05），見圖5。

圖4 ADSCs組與PBS組大鼠Douglas and Fowler評分比較

注：*<0.05

2.3 三組炎癥相關(guān)免疫因子水平比較

輻射后3周時，PBS組和ADSC組大鼠皮膚內(nèi)的TNF-α、IL-1β，IL-6、IL-10、iNOS等炎癥因子的mRNA水平均顯著高于其他時間點（<0.05），且顯著高于空白對照組（<0.05），見圖6。

輻射后3周，與PBS組相比，ADSC組TNF-α，IL-1β，IL-6水平均顯著降低（0.05），IL-10顯著升高（<0.05）。PBS組與ADSC組的NOS及Arg水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）。PBS組和ADSC組各指標均顯著高于空白對照組（<0.05），見圖7。

圖5 ADSCs組與PBS組大鼠皮膚損傷面積比較

注：*<0.05

2.4 HE染色

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ADSCs組大鼠背部皮膚染色后仍可見清晰的層次及相關(guān)附屬器，而PBS組表皮破碎撕脫，組織結(jié)構(gòu)不清，真皮層結(jié)構(gòu)排列紊亂，見圖8。

圖6 輻射刺激后1～4周SD大鼠皮膚組織內(nèi)炎癥因子表達水平

圖7 輻射刺激后3周SD大鼠皮膚組織內(nèi)炎癥因子表達水平

注：*<0.05

圖8 SD大鼠皮膚組織HE染色（×40）

A.PBS組；B.ADSC組

3 討論

近年來對于H-ADSCs促進各類創(chuàng)傷修復的臨床及實驗研究日益增多。H-ADSCs來源廣泛、提取便捷且免疫源性更低，具有更為廣泛的使用前景和推廣價值。近期研究表明，脂肪、骨及臍帶來源干細胞均可通過降低促炎因子表達發(fā)揮其生物學功能，而ADSCs對細胞的損傷保護作用優(yōu)于骨、臍帶來源干細胞，能減輕和修復放射性損傷引起的正常腸、唾液腺、肝臟、皮膚、肺和心肌等組織損傷[5]。

本研究結(jié)果顯示，接受45Gy輻射后的大鼠均出現(xiàn)Ⅳ度放射性皮膚損傷，進行H-ADSCs干預后發(fā)現(xiàn)，H-ADSCs不僅可延緩放射性皮膚損傷出現(xiàn)的進程，還可以加速創(chuàng)面的愈合。有研究認為輻射刺激皮膚后可介導相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達，并通過經(jīng)典的S-mad途徑參與組織纖維化進程，進而干預皮膚的修復過程[6]。研究也證實，ADSCs可通過降低血清中IL-4，IL-6水平非特異性下調(diào)Th2型免疫反應[7]，還可通過在mRNA水平上/下調(diào)干擾素表達及上調(diào)IL-10，轉(zhuǎn)錄因子P3表達從而減輕移植反應[8]。在創(chuàng)傷環(huán)境下，ADSCs可以分泌TNF-α，IL-6，IL-8等調(diào)節(jié)細胞的增殖、黏附、遷移、分化，影響創(chuàng)傷的愈合進程，為局部創(chuàng)面的愈合提供良好的微環(huán)境[9-10]。巨噬細胞在炎癥反應微環(huán)境中起到了功能性作用，M1型與M2型巨噬細胞的分化誘導以及環(huán)境變化中的相互轉(zhuǎn)換是免疫系統(tǒng)中的重要組成成分，通過對TNF-α、IL-1β，IL-6、IL-10、iNOS等炎癥因子mRNA水平表達的檢測，有助于更好的了解H-ADSCs對炎癥微環(huán)境的干預作用。

本研究結(jié)果顯示，受輻射大鼠出現(xiàn)了紅腫、脫屑、褪毛、潰瘍形成等一系列炎癥反應，且照射區(qū)域表皮增厚，膠原結(jié)構(gòu)紊亂，附屬器破壞消失，TNF-α，IL-1β，IL-6等炎癥因子表達顯著增加。通過給予外源性的H-ADSCs能夠有效減輕大鼠放射性皮膚損傷局部的炎癥反應，減少照射區(qū)域炎性細胞浸潤及炎癥誘導的組織損傷。輻射后3周，皮膚組織內(nèi)TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，iNOS及Arg-1出現(xiàn)顯著升高，給予外源性的H-ADSCs可從mRNA水平上降低促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-6表達，并促進抑炎因子IL-10表達增加。

綜上所述，H-ADSCs可通過抑炎反應減輕SD大鼠皮膚放射性損傷。但目前臨床上缺少明確的對于放射性損傷的治療方法，亦缺少早期評估診療手段，期望本研究可為臨床提供一定的理論依據(jù)。

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Inflammatory repair effects of human adipose-derived stem cells promotion on radiodermal skin injury in SD rats probed at the mRNA level

Department of Plastic Surgery, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Taizhou 317000, Zhejiang, China

To investigate the role and inflammatory mechanism of human adipose-derived stem cells (H-ADSCs) in radiological skin injury in SD rats at the mRNA level.Selected 15 SD rats were divided into 5 groups of 3 rats each according to the random number table method. The rats in each group were irradiated with 45Gy electron beams on the back skin, and were executed and tissue specimens were taken at 0, 1, 2, 3 and 4 weeks after irradiation, respectively, to detect the mRNA levels of inflammatory factors in the skin tissues. A total of 35 SD rats were selected and divided into blank control group (=7), PBS group (=14) and ADSCs group (=14) according to the random number table method. Blank control without any treatment, the remaining rats were subjected to electron beam irradiation. After the back skin of SD rats in the PBS and ADSCs groups were irradiated with 45Gy electron ray, the rats in PBS group were injected with 1ml PBS, and the rats in ADSCs group were injected with 1ml PBS containing ADSCs for five times. Observed the gross morphology and pathological histological damage of rat skin, scored the skin damage, and also detected the changes of mRNA expression levels of inflammatory factors in rat skin tissues.At 2 days post-irradiation, the Douglas and Fowler scores of rats in the two groups were compared, and the difference was not statistically significant (>0.05). From 4-10 days post-irradiation, the Douglas and Fowler scores of rats in the ADSCs group were significantly lower than those in the PBS group (<0.05). By 12 days post-irradiation, the Douglas and Fowler scores of the two groups reached the same level. At 2 weeks post-irradiation, rats in the PBS and ADSCs groups showed the same area and degree of skin damage. At 3 weeks post-irradiation and before execution, the ratio of the area of skin damage in the ADSCs group was significantly lower than that in the PBS group (<0.05). Tumor necrosis factor-α (TNF-α), inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin (IL)-6, IL-10, IL-1β, and TNF-α were found in the skin of rats in the PBS and ADSC groups at 3 weeks after radiation, the mRNA levels of which were significantly higher than those of other time points (<0.05) and significantly higher than those of the blank control group (<0.05). Compared with the PBS group, the levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 were significantly lower in the ADSC group (<0.05), and IL-10 was significantly higher (<0.05). Comparing the levels of NOS and Arg in the PBS group and the ADSC group, the differences were not statistically significant (>0.05).H-ADSCs can effectively promote the repair of radioactive skin injury wounds in SD rats, and the mechanism may be that H-ADSCs exert biological effects by promoting the expression of anti-inflammatory factors and decreasing the expression of pro-inflammatory factors, thus inhibiting the inflammatory response.

Human adipose-derived stem cells; Radiation-induced skin injury; Inflammation

R818

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.23.007

臺州市社會發(fā)展科技計劃項目（21ywa10）

曹衛(wèi)紅，電子信箱：caoweihong@hotmail.com

（2022–09–16）

（2023–07–25）