王夢(mèng)藍(lán) 張淑涵 郭 寧 徐 核 王安琪 李西文 孫 奕

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700)

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq.var.seoulenseNakai或華細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根莖,在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被初次記載,同時(shí)被列為上品,其味辛性溫,歸心、肺、腎經(jīng),具有行水通竅、溫肺化飲、祛風(fēng)散寒、止痛的功效,也可用于鼻塞鼻淵、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、痰飲喘咳等癥[1]。細(xì)辛根部的揮發(fā)油類成分主要包括甲基丁香酚和黃樟醚,其次為3,5-二甲氧基甲苯、肉豆蔻醚、β-蒎烯、α-蒎烯、優(yōu)葛縷酮、α-細(xì)辛醚、欖香素等[2-7]。從其根及根莖的去揮發(fā)油部分則鑒定出2E,4E,8Z,10E-N-異丁基-2,4,8,10-十二碳四烯酰胺、細(xì)辛脂素、芝麻脂素、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、5,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖基柚皮素、馬兜鈴酸Ⅰ(Aristolochic Acid Ⅰ,AAⅠ)等多種非揮發(fā)性成分[8-11]。臨床研究表明,細(xì)辛具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制、調(diào)節(jié)血壓、抗過敏、抗衰老等藥理作用[12-13]。

“煮散”首次記載于唐代孫思邈的《備急千金要方》,而在更早的漢朝《傷寒雜病論》中已經(jīng)出現(xiàn)關(guān)于劑型的描述。中藥煮散是將藥物制成細(xì)粉或粗粉,加入水或引藥煎煮,去掉藥渣留下湯汁,最終制成的湯劑。目前,仍沿用至今的煮散劑包括銀翹散、玉屏風(fēng)散等。在當(dāng)代,隨著中藥飲片的需求量逐年上升,煮散劑可以發(fā)揮簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)的優(yōu)勢(shì),能夠大量節(jié)約藥源,因此有必要重新考量其應(yīng)用價(jià)值[14]。目前研究較多的一是煮散劑的臨床研究并觀察其療效,二是將煮散劑與中西醫(yī)其他療法結(jié)合來進(jìn)行臨床試驗(yàn),三是探討影響煮散有效成分浸出的相關(guān)因素等,四是對(duì)比研究煮散劑與傳統(tǒng)飲片煎出率的差異以及產(chǎn)生差異的因素[15-17]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)辛的精準(zhǔn)煮散劑進(jìn)行了出膏率、有效成分轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜等方面的研究;與藥材飲片中有效成分的含量進(jìn)行比較,并分析不同規(guī)格煮散之間的成分及其含量的差別,確定了藥材煮散的最佳粉碎粒徑,同時(shí)評(píng)價(jià)煮散與原飲片的質(zhì)量均一性,建立煮散劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)系統(tǒng)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：Waters 2695)，超高效液相色譜儀(Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：Acquity UPLC Class I)，超高效液相系統(tǒng)(Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：ACQUITY UPLC H-Class)，高分辨質(zhì)譜儀(Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：Q-TOF)，電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：Sartorius-WWZA-124S)，電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：YP502N)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-5200B)，臺(tái)式高速離心機(jī)(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：D2012)，高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：FW100)，pH試紙(上海三愛思試劑有限公司精密試紙，批號(hào)：20056)。

1.2 試劑 細(xì)辛脂素對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):BBP03975,純度≥98%),甲醇、乙腈均為色譜純級(jí)別(Fisher,美國(guó),批號(hào):20191125),其他分析試劑均為分析純級(jí)別,實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水或屈臣氏飲用水。

1.3 分析樣品 3批細(xì)辛飲片經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李西文研究員鑒定,均由馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesF.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.的干燥根及根莖炮制加工而成,藥材標(biāo)本存放于中國(guó)中醫(yī)研究院中藥研究所整合中藥學(xué)中心。見表1。

表1 細(xì)辛產(chǎn)地及批次

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 細(xì)辛飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備 精密稱取生產(chǎn)批號(hào)160960111的細(xì)辛20 g,加8倍量水,采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑的方法進(jìn)行煎煮。首先浸泡30 min,第1次加熱回流30 min,用200目的篩網(wǎng)趁熱過濾,再加入6倍量水,第2次加熱回流30 min,趁熱過濾,合并2次煎煮濾液,減壓濃縮,使最終體積為100 mL,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.2 不同規(guī)格煮散飲片水煎液供試品溶液的制備 取細(xì)辛飲片均勻粉碎后過篩,分別過5～10目,10～24目,24～65目篩,可得到3種不同規(guī)格的煮散飲片。稱取上述煮散飲片各20 g,加8倍量水,采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑方法進(jìn)行煎煮。浸泡30 min,第1次加熱回流30 min,用200目的篩網(wǎng)趁熱過濾,接著加入6倍量水,第2次加熱回流30 min,趁熱過濾,合并2次煎煮濾液,減壓濃縮,使最終體積為100 mL,過0.22 μm微孔濾膜即得。

2.1.3 細(xì)辛飲片供試品溶液的制備 本品粉末過3號(hào)篩后,精密稱定約0.5 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入15 mL甲醇,密塞稱重,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)45 min,待冷卻后再次稱重,用甲醇補(bǔ)足減失的重量后,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定適量細(xì)辛脂素對(duì)照品,加入甲醇制成50 μg/mL的細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液,4 ℃保存,即得。

2.2 細(xì)辛脂素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);0.2%乙酸水(A)-流動(dòng)相乙腈(B),梯度洗脫(0～8 min,5%B;8～20 min,5%～20%B;20～40 min,20%～60%B;40～45 min,60%～95%B;45～50 min,95%B),流速為1.0 mg/mL,柱溫設(shè)置為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 取細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液,分別稀釋2、4、8、16、32倍,按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,橫坐標(biāo)(X)為對(duì)照品質(zhì)量(μg),縱坐標(biāo)(Y)為峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程Y=1 282.8X+593 3,r=1,線性范圍為50～500 ng。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取煮散劑供試品溶液(S1)，按2.2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果顯示供試品溶液中細(xì)辛脂素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取煮散劑供試品溶液(S1),分別在0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析,結(jié)果表明供試品中細(xì)辛脂素峰面積RSD為1.3%,表明標(biāo)準(zhǔn)煮散供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性 取相同批次的標(biāo)準(zhǔn)煮散劑樣品(S1),按2.1.2項(xiàng)中的方法平行制備6份供試品溶液,分別按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析,計(jì)算得出細(xì)辛脂素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.025,0.025,0.024,0.024,0.025,0.024 mg/mL,RSD為2.2%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取同一批次已知含量的供試品溶液適量(S1),按1∶1的比例添加細(xì)辛脂素對(duì)照品,平行制備6份后按2.2.1項(xiàng)色譜方法對(duì)細(xì)辛脂素進(jìn)行分析,計(jì)算出細(xì)辛脂素的平均回收率為101.3%,RSD為2.1%,表明該實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.7 細(xì)辛樣品中細(xì)辛脂素含量測(cè)定 依照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》方法,制備不同批次細(xì)辛飲片樣品溶液,精密吸取3批次供試品溶液各10 μL,并在2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定細(xì)辛脂素的峰面積,通過外標(biāo)法計(jì)算細(xì)辛脂素含量。見表2。

表2 細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散劑的理化特征參數(shù)與細(xì)辛脂素參數(shù)

2.2.8 細(xì)辛飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中細(xì)辛脂素含量測(cè)定 精密吸取2.1.1項(xiàng)下細(xì)辛飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液10 μL,并在2.2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,測(cè)定細(xì)辛脂素的峰面積,根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算細(xì)辛脂素含量。見表2。

2.2.9 細(xì)辛煮散飲片水煎液中細(xì)辛脂素量測(cè)定 精密吸取2.1.2項(xiàng)下各個(gè)批次不同規(guī)格的供試品溶液各10 μL,并在2.2.1項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣分析,測(cè)定細(xì)辛脂素的峰面積,接著通過外標(biāo)法計(jì)算細(xì)辛脂素含量。見表2。

2.3 細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)測(cè)得的細(xì)辛脂素含量得結(jié)果,按照轉(zhuǎn)移率的公式計(jì)算細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率,轉(zhuǎn)移率=標(biāo)準(zhǔn)湯劑或煮散劑中細(xì)辛脂素含量/相應(yīng)飲片中細(xì)辛脂素含量×100%,發(fā)現(xiàn)粉碎后的不同粒徑煮散飲片水煎液細(xì)辛脂素的轉(zhuǎn)移率均比原飲片有顯著增加,其中以中等粒徑細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率最高。見表2。

2.4 出膏率 精密量取2.1.1項(xiàng)下制得的細(xì)辛飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑和2.1.2項(xiàng)下制得不同規(guī)格煮散飲片水煎液25 mL,置于干燥的蒸發(fā)皿中,水浴加熱蒸干,接著在105 ℃烘箱中干燥3 h,取出后放置干燥器中冷卻30 min,稱重,計(jì)算出膏率。見表2。

2.5 指紋圖譜的建立 將3批細(xì)辛飲片標(biāo)準(zhǔn)煮散劑生成高效液相色譜指紋圖譜,對(duì)照指紋圖譜則由平均數(shù)生成。見圖1～2。根據(jù)峰形、峰面積、保留時(shí)間等參數(shù),最終選擇出共有峰5個(gè),以峰5作參照,來計(jì)算5個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、保留時(shí)間、相對(duì)峰面積以及峰面積。見表3。通過對(duì)比高效液相色譜色譜圖信息可知,3批細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散劑所生成的指紋圖譜的相似度均大于90%。見表4。

圖1 細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散劑的高壓液相色譜圖譜

圖2 細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散劑的高效液相色譜指紋譜

表3 細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散劑的主要共有指紋峰指標(biāo)參數(shù)

表4 細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散劑的高效液相色譜指紋圖譜的相似度

2.6 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)成分指認(rèn)

2.6.1 檢測(cè)條件 色譜條件為Waters ACQUITY HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～2 min,5%B;2～17 min,5%～95%B;17～19 min,95%B;19～24 min,95%～5%B),流速0.3 mL/min,進(jìn)樣2 μL,柱溫設(shè)置為40 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

質(zhì)譜條件為電噴霧電離(Electrospray Ionization,ESI),正離子模式全掃描;離子源工作參數(shù)為毛細(xì)管電壓3.0 kV,錐孔電壓30 V,錐孔反吹氣流量(N2)50 L/h,脫溶劑氣流量1 000 L/h,離子源溫度120 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃,每0.2秒采集1次譜圖,掃描范圍m/z 50～1 000,采用UNIFITM 1.9.4質(zhì)譜分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

2.6.2 色譜峰指認(rèn) 精密吸取2 μL的細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散供試品溶液注入超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)儀器,在正離子模式下測(cè)定,利用UNIFITM1.9.4質(zhì)譜分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)比分析相對(duì)分子質(zhì)量、特征離子碎片,并結(jié)合MassFragmentTM確定化合物的分子式和相對(duì)分子質(zhì)量等信息。最終鑒定出16個(gè)色譜峰?；衔锛跋嚓P(guān)離子推斷見表5,圖3。

圖3 細(xì)辛標(biāo)準(zhǔn)煮散劑UPLC-Q-TOF-MS分析的基峰離子(Base Peak Ion,BPI)色譜圖

表5 正離子模式下細(xì)辛煮散劑溶液中的色譜峰鑒別

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選取了不同產(chǎn)地的細(xì)辛制成煮散劑,分別測(cè)定了出膏率和pH值。結(jié)果顯示,粉碎成不同粒徑的煮散飲片與原飲片pH值無明顯差異,而出膏率則比原飲片有所增加;然而最小粒徑容易出現(xiàn)輕微糊化現(xiàn)象,故選用中等細(xì)度的顆粒制備煮散劑最為合適。

中藥生產(chǎn)中計(jì)算出膏率最重要的是要確保中藥的提取程度夠完全,并保證中藥材能煮透,計(jì)算出膏率的基礎(chǔ)上可以降低生產(chǎn)成本,使藥品質(zhì)量得到控制以實(shí)現(xiàn)良好的經(jīng)濟(jì)效益。并且出膏率和含量之間的關(guān)聯(lián)密切;控制好藥材的質(zhì)量和工藝提取參數(shù),有利于更好地保證產(chǎn)品的最終質(zhì)量。

采用高壓液相色譜法-二極管面陣(High-performance Liquid Chromatography-diode Array Detection,HPLC-DAD)色譜法進(jìn)行分析,根據(jù)其高分辨數(shù)據(jù)以及分析結(jié)果,說明不同規(guī)格煮散劑與原飲片在主要成分上并沒有明顯差別,具有屬性上的一致性;根據(jù)其相似度計(jì)算結(jié)果,不同規(guī)格煮散劑與原飲片批次之間相似度較好,說明粉碎后的煮散飲片與原藥材飲片中的成分種類沒有太大差別,是否粉碎及粉碎程度對(duì)其藥物成分幾乎沒有影響。本實(shí)驗(yàn)制成了3個(gè)不同規(guī)格煮散劑,包括粗粒徑(24～65目)、中粒徑(10～24目)、細(xì)粒徑(5～10目),通過查閱2020版《中華人民共和國(guó)藥典》,借鑒其中方法,對(duì)有效成分細(xì)辛脂素的含量及轉(zhuǎn)移率進(jìn)行了測(cè)定,與飲片制得的標(biāo)準(zhǔn)湯劑比較,粉碎后不同粒徑煮散飲片水煎液中細(xì)辛脂素的含量均明顯增加,其中中等粒徑(10～24目)細(xì)辛脂素含量及轉(zhuǎn)移率均為最高,有效成分含量最高,且不易糊化。如果細(xì)辛藥材制成10～24目粒徑的顆粒再加工成煮散劑,則可以得到最高的藥材提取率,從而更廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥行業(yè)。

細(xì)辛在炮制入藥時(shí),飲片中的有效成分之一細(xì)辛脂素的轉(zhuǎn)移率不高,但制成煮散后,可使其出膏率和轉(zhuǎn)移率有所提高。研究發(fā)現(xiàn),不同規(guī)格的煮散劑之間的出膏率也存在差異,其中以中等顆粒的細(xì)辛脂素的轉(zhuǎn)移率最高,且具有良好的均一性。采用UPLC-QTOF-MS進(jìn)行檢測(cè),用UNIFITM1.9.4質(zhì)譜分析軟件分析,結(jié)合文獻(xiàn)查閱,以及對(duì)照品質(zhì)譜分析和保留時(shí)間等參數(shù),最終鑒定出16個(gè)化合物,這對(duì)于細(xì)辛煮散劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有一定的研究意義。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)按照制備中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)煮散劑的方法,建立細(xì)辛飲片標(biāo)準(zhǔn)煮散劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),而煮散可以使得患者煎煮服藥過程更簡(jiǎn)單、快捷;并且價(jià)格相對(duì)低廉,一定程度上減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān);技術(shù)的改進(jìn)可以大大提高效率,節(jié)約資源的同時(shí)能保護(hù)環(huán)境。傳統(tǒng)湯劑由于長(zhǎng)時(shí)間沸騰會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性有效成分的散失,煮散恰好避免這個(gè)問題。同時(shí)煮散可以減少藥材使用、縮短煎煮時(shí)間、煎藥出率高,有助于藥效更好的發(fā)揮,方便攜帶以及服用。煮散雖好,但也存在一些缺點(diǎn),比如無法清晰辨認(rèn)原材料是何種藥材,不易長(zhǎng)久保存等問題。目前對(duì)于煮散劑的研究已比較深入且取得不小成就,但仍有缺陷需要系統(tǒng)地完善,這也將是煮散方向今后研究和討論的熱點(diǎn)。

利益沖突聲明:無。