陳國偉， 解修超*,2， 宋 玉,2， 鄧百萬,2， 胥彥明， 田國強

（1. 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723001；2. 陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723001；3. 陜西省城固酒業(yè)股份有限公司，陜西 漢中 723000）

中國白酒歷史悠久，按香型可分為：濃香型、清香型、醬香型、米香型和兼香型五大香型[1]。 城固位于陜南漢中盆地， 濃香型白酒已有3 000 多年釀造歷史。 城固酒素有“城固佳釀味甘美，醉倒東西南北客”之譽[2]。 白酒窖泥中含有豐富的微生物，微生物的數(shù)量及種類決定了窖泥質(zhì)量的好壞，直接影響酒的品質(zhì)。 因此，對窖泥微生物的群落組成、多樣性及基因注釋等進行分析，并對微生物和環(huán)境進行雙向研究，有利于白酒釀造過程的改善。

20 世紀60 年代， 我國才開始對窖泥中的微生物展開研究，目前對窖泥微生物的研究技術(shù)主要采用純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)[3]。 傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)分析微生物存在一定的局限性，純培養(yǎng)菌株離開了白酒生產(chǎn)中的真實環(huán)境，無法完全反映發(fā)酵過程中各微生物之間的聯(lián)系， 不能從整體上研究微生物結(jié)構(gòu)，且絕大多數(shù)微生物是未培的[4-7]。 基于微生物總基因組DNA 的高通量測序法是免培養(yǎng)技術(shù)方法之一，以高通量及低成本為主要特征，并在此基礎(chǔ)上保持了第一代測序的高準確性，逐漸成為目前窖泥中微生物研究的重要手段[8-9]。 高通量測序技術(shù)能全面反映窖泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)，從整體上對微生物進行研究，并可對特定微生物類群進行深入分析。

作者采用傳統(tǒng)培養(yǎng)以及高通量測序法，分析城固酒窖泥中的菌群組成和基因功能，為進一步篩選及應(yīng)用功能菌株來調(diào)控改善城固酒的品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 窖泥樣品： 陜西省城固酒業(yè)股份有限公司； 細菌基因組DNA 提取試劑盒、 真菌基因組DNA 提取試劑盒：安諾倫（北京）生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 牛肉浸粉、氯化鈉、蛋白胨、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等：均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 孟加拉紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基： 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、 葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基：作者所在實驗室配制。

1.2 儀器設(shè)備

LS-B50L 高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；BSA8201 電子分析天平： 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Alliance 4.7 熒光凝膠成像儀： 英國UVItec 公司；TANON EPS300 凝膠電泳儀： 上海天能科技有限公司；Vortex Genius 3 渦旋混合儀：德國IKA 集 團；TC-4000 熱 循 環(huán)PCR 擴 增 儀： 英 國TECHEN 公司；ZWY-2112B 恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 傳統(tǒng)法分析窖泥微生物多樣性

1.3.1 窖泥微生物分離純化 稱取10.00 g 窖泥樣品，倒入90 mL 無菌水錐形瓶中，140 r/min、37 ℃富集培養(yǎng)30 min。 利用傳統(tǒng)稀釋涂布平板法分離窖泥微生物，從分離平板挑取形態(tài)不同的單菌落于新的固體培養(yǎng)基上，多次劃線純化，獲得純化菌株。 真菌于4 ℃馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基斜面?zhèn)鞔２兀?細菌于-20 ℃體積分數(shù)20%的甘油中保藏。

1.3.2 窖泥微生物鑒定 形態(tài)學(xué)觀察：將篩選的目標菌株在相應(yīng)的平板上劃線， 分別于37 ℃和28 ℃培養(yǎng)后觀察菌落的形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定：細菌采用水煮法提取基因組DNA，用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）通用引物對細菌基因組DNA 擴增。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存， 共33 個循環(huán)。 真菌采用CTAB 法提取基因組DNA，用ITS1 和ITS4 通用引物對真菌基因組DNA 擴增，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存，共33 個循環(huán)。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限責(zé)任公司測序， 結(jié)果在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 序列比對，選擇分類信息較為完整且相似度高的序列確定同緣關(guān)系。

1.4 高通量測序分析窖泥微生物多樣性

1.4.1 樣品的預(yù)處理 取適量窖泥放入滅菌的2 mL 離心管中，離心后取沉淀進行提取。

1.4.2 樣品總DNA 提取 采用磁珠法提取DNA，在裂解液和蛋白酶共同作用下裂解消化，經(jīng)結(jié)合液和磁珠吸附純凈DNA， 用1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳（電壓：200 V；時間：30 min）檢測DNA 完整性，無降解，用Qubit 定量檢測gDNA 質(zhì)量濃度，確保達到構(gòu)建二代測序文庫要求。

1.4.3 16S rRNA、ITS 的擴增、測序與分析 采用細菌提取試劑盒和真菌提取試劑盒提取gDNA。 細菌引物采用341F （5′-CCTACGGGNGGCWGCAG） 和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC），真 菌 引物采用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC）對靶序列擴增后測序，測序得到的數(shù)據(jù)進行微生物多樣性分析。

1.4.4 宏基因組測序和數(shù)據(jù)分析 取質(zhì)量合格的gDNA 樣品，對DNA 進行片段化處理，先將測序的原始數(shù)據(jù)通過FastQC 軟件進行質(zhì)量評估， 并通過Trimmomatic 軟件進行過濾處理， 得到相對準確的有效數(shù)據(jù)進行序列拼接，將組裝后的序列結(jié)果進行ORF 預(yù)測，得到具有潛在功能的基因，然后基于不同的數(shù)據(jù)庫進行物種和功能基因的注釋與分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥微生物分離鑒定結(jié)果

利用傳統(tǒng)稀釋涂布分離法從窖泥中分離出細菌49 株，共21 屬；真菌21 株，共14 屬，其中包括3株酵母菌。 圖1 為部分窖泥微生物菌落形態(tài)圖。

圖1 部分窖泥微生物菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of microorganism in some pit mud

細菌菌株經(jīng)過16S rRNA 擴增后測序， 真菌菌株經(jīng)過ITS 基因擴增后測序， 測序結(jié)果在NCBI 上BLAST 比對，并用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2 和圖3。

圖2 窖泥細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of bacterial in pit mud

通過鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析可知，窖泥中細菌可分為Bacillus、Streptomyces、Brevibacterium、Clostridium、Terrisporobacter、Enterobacter 等。 真 菌 可 分 為Aspergillus、Cladosporium、Monascus、Penicillium、Debaryomyces、Rhodotorula 及Saccharomyces 等。

2.2 高通量測序結(jié)果統(tǒng)計分析

2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 城固酒窖泥樣品基因組包含44 967 652 條序列，G+C 比例為51.15 %。由圖4 可以看出，序列讀長為150 bp，圖中所測堿基質(zhì)量整體都在Q{35}左右，沒有太大的質(zhì)量值波動，表明本次測序結(jié)果較好。 根據(jù)堿基的位置，對每個位置上的A、T、C、G 的數(shù)量進行統(tǒng)計， 判斷AT、CG是否有分離現(xiàn)象和過表達序列。 由圖5 可知，因隨機引物擴增偏差的原因， 會導(dǎo)致前面10 bp 的堿基出現(xiàn)雜亂的波動，之后所有位點上的每條線平等且接近，呈水平線，表明測序樣品未污染。

圖4 堿基質(zhì)量分布圖Fig. 4 Distribution of base quality

圖5 堿基比例分布圖Fig. 5 Distribution of base content

2.2.2 菌群多樣性分析 單樣品的多樣性分析不僅可以反映微生物群落的豐度和多樣性，還可通過一系列統(tǒng)計學(xué)分析指數(shù)估計環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。 作者以Alpha 稀釋性曲線和多樣性指數(shù)分析樣本，研究測序數(shù)據(jù)量的合理性和單個樣品內(nèi)部物種的豐度及多樣性。 樣本有效序列計算后的Alpha 稀釋性曲線見圖6， 多樣性指數(shù)分析見表1，Shannon 指數(shù)見圖7。 本實驗中稀釋性曲線達到平緩，說明本次測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息，文庫覆蓋率反映了測序結(jié)果的準確性， 能代表樣本的真實情況。 真菌Chao1 指數(shù)大于細菌Chao1 指數(shù)， 說明真菌物種總數(shù)大于細菌物種總數(shù)。 細菌Simpson 指數(shù)遠大于真菌Simpson 指數(shù)，說明細菌的群落多樣性遠高于真菌。

表1 Alpha 多樣性分析Table 1 Analysis of alpha diversity

圖6 Alpha 指數(shù)稀釋性曲線Fig. 6 Rarefaction curve of alpha index

圖7 Shannon 指數(shù)稀釋性曲線Fig. 7 Rarefaction curve of Shannon index

2.2.3 細菌與真菌群落結(jié)構(gòu)分析 城固酒窖泥屬水平分類結(jié)果見圖8。 細菌（A1） 在屬水平上，測序共劃分了68 個菌屬和其他未分類種群， 但只有12個屬相對豐度在1%以上，主要核心菌屬為Petrimonas（相對豐度為10.54%）、Bacillus（相對豐度為9.21%）、Sedimentibacter（相對豐度為2.37%）、Clostridium（相對豐度為1.21%）。 真菌（B2）在屬水平上，測序共劃分了149 個菌屬和其他未分類種群， 但只有16 個屬豐度在1%以上，主要核心菌屬為Issatchenkia（相對豐度為17.12%）、Debaryomyces （相對豐度為13.83%）、Pichia（相對豐度為8.00%）、Aureobasidium（相對豐度為7.64%）、Aspergillus （相對豐度為4.66%）。

圖8 細菌與真菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 8 Community structure of bacteria and fungi

2.2.4 KEGG 功能注釋分析 城固酒窖泥中共注釋了236 022 個unigene。從屬于KEGG 數(shù)據(jù)庫中六大等級分類的42 個KEGG 二級通路見圖9。六大類分別為環(huán)境信息處理 （26 363，11.17%）、 代謝通路（149 319，63.26%）、遺傳信息處理（30 109，12.76%）、細 胞 過程 （15 080，6.39%）、 人 類疾病（10 323，4.37%）和生命系統(tǒng)（4 848，2.05%）。 富集差異表達基因最多的10 個二級通路為碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism，28 434）、 概觀（overview，27 511）、 氨基酸代謝 （amino acid metabolism，21 910）、能量代謝（energy metabolism，17 715）、膜運輸（membrane transport，16 820）、輔因子和維生素代謝（etabolism of cofactors and vitamins，13 552）、核苷酸 代 謝 （nucleotide metabolism，13 197）、 翻 譯（translation，12 916）、信號傳導(dǎo)（signal transduction，9 477）、復(fù)制和修復(fù)（replication and repair，9 402）。其中有149 319 個unigene 參與微生物新陳代謝，碳水化合物代謝為主要代謝活動， 有15 條碳水化合物代謝途徑，包括丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生、氨基糖和核苷酸糖代謝以及丁酸代謝等。 這些代謝途徑表明窖泥具有良好的糖類代謝及風(fēng)味物質(zhì)合成的能力。還原糖與氨基酸、蛋白質(zhì)之間發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)[10-11]可生成多種香味物質(zhì)，也可生產(chǎn)高微量成分的調(diào)味液來提高白酒的香味強度[12]和豐富白酒風(fēng)味，如酮、醛、吡嗪、呋喃、酚類等[13]，而四甲基吡嗪還具有擴張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板集聚等作用[14]。 窖泥樣品中代謝功能旺盛的碳水化合物和氨基酸代謝為還原糖與氨基酸、 蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)提供了基礎(chǔ)。

圖9 KEGG pathway 功能注釋分類Fig. 9 Functional annotation classification in KEGG pathway

2.2.5 CAzY 功能注釋分析 CAzY 是碳水化合物活性酶的數(shù)據(jù)庫，主要包括糖苷水解酶（GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）、多糖裂解酶（PLs）、糖類酯解酶（CEs）和氧化還原酶（AAs）。此外，還包括碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs）。將宏基因組基因集序列與CAzY 數(shù)據(jù)庫比對，共注釋到210 個碳水化合物酶類。 窖泥樣品中注釋到的酶類及數(shù)量見圖10。在窖泥樣品中糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶類數(shù)量最多，占總數(shù)的74%。糖苷水解酶能水解寡糖、多糖等各種含糖化合物的糖苷鍵，生成單糖、寡糖或糖復(fù)合物，在寡糖、芳香基糖苷的合成、氨基酸和多肽的糖基化方面發(fā)揮了重要作用[15]。 糖基化反應(yīng)是生物體內(nèi)最為重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)[16]，它們將活性糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到糖基受體，從而影響糖基受體的水溶性，改善其化學(xué)穩(wěn)定性和生物活性，同時維持自身代謝的平衡[17-18]。 糖基轉(zhuǎn)移酶基因分為98 個家族糖基轉(zhuǎn)移酶， 能催化各種二糖、寡聚糖及多聚糖合成[19-20]。 窖泥中豐富的糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶有利于糖類的生成、轉(zhuǎn)化及代謝。

圖10 CAzY 功能注釋分類Fig. 10 Functional annotation classification in CAzY

2.2.6 COG 功能注釋分析 將基因集蛋白質(zhì)序列與COG 數(shù)據(jù)庫比較， 對預(yù)測蛋白質(zhì)進行歸類和功能注釋，繪制功能注釋統(tǒng)計圖，見圖11。窖泥樣品中預(yù)測蛋白質(zhì)分屬于23 個主要的功能大類， 未知功能的預(yù)測蛋白質(zhì)最多，其次為大概的功能預(yù)測。 這與鄭琦采用宏基因組技術(shù)研究濃香型白酒香味類微生物生物質(zhì)代謝相關(guān)的基因結(jié)果一致[21]。 未來隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，更多的計算方法和技術(shù)將被應(yīng)用到對這部分預(yù)測蛋白質(zhì)的研究。

圖11 COG 功能注釋分類Fig. 11 Functional annotation classification in COG

2.3 糖代謝轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因分析

2.3.1 糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng) 窖泥中微生物的糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分布見表2。 通過對糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)， 山梨糖醇、麥芽糖、甘露糖、海藻糖、N-乙酰氨基葡萄糖、甘露醇、葡萄糖（α-糖苷）、纖維二糖可通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、滲透酶蛋白和ABC 轉(zhuǎn)運蛋白3 種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)代謝；乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-阿洛糖和低聚糖等可以通過滲透酶蛋白和ABC 轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)2 種方式轉(zhuǎn)運；蔗糖、半乳糖、半乳糖醇和α-葡萄糖苷只能由磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)運；果糖可由磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和ABC 轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)2 種方式轉(zhuǎn)運；纖維二糖可由磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和滲透酶蛋白系統(tǒng)2 種方式轉(zhuǎn)運；木二糖只能由特異性ABC 蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運。 窖泥中甘露糖、甘露醇、甲基半乳糖苷、果糖、蔗糖、乳糖分別有控制基因拷貝數(shù)477、73、233、127、42、60 個，表明白酒釀造過程中窖泥微生物對甘露糖的轉(zhuǎn)運能力最強。

表2 窖泥糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的分布Table 2 Distribution of sugar transporters in pit mud

2.3.2 糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成糖酵解途徑中間產(chǎn)物的過程分析 窖泥微生物基因組中參與將果糖和甘露糖降解形成糖酵解中間產(chǎn)物的特色代謝通路見圖12。 參與將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖酵解中間產(chǎn)物的關(guān)鍵酶基因見表3。

圖12 果糖和甘露糖降解形成糖酵解中間產(chǎn)物的過程Fig. 12 Degradation of fructose and mannose into the glycolytic intermediates

1）D-1-磷酸甘露醇的轉(zhuǎn)化 經(jīng)過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進入細胞的糖都會發(fā)生磷酸化。 甘露醇在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶II 的作用下發(fā)生磷酸化， 最終形成D-1-磷酸甘露醇進入細胞，在1-磷酸甘露醇-5-脫氫酶的作用下最終轉(zhuǎn)化為糖酵解中間產(chǎn)物β-D-6磷酸果糖。

2）6-磷酸山梨醇的轉(zhuǎn)化 山梨醇在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶II 的作用下經(jīng)磷酸化形成6-磷酸山梨醇進入細胞， 在6-磷酸山梨醇-2-脫氫酶的作用下最終轉(zhuǎn)化成糖酵解中間產(chǎn)物β-D-6 磷酸果糖。

3）麥芽糖的轉(zhuǎn)化 麥芽糖通過滲透酶蛋白進入細胞，在麥芽糖磷酸化酶的作用下直接轉(zhuǎn)化成糖酵解中間產(chǎn)物β-D-1-磷酸葡糖，參與糖酵解途徑。

4）D-6-磷酸甘露糖的轉(zhuǎn)化 甘露糖經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)最終形成D-6-磷酸甘露糖進入細胞，在6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)化成β-D-6-磷酸果糖。

5）海藻糖的轉(zhuǎn)化 海藻糖可通過滲透酶蛋白、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)3 種轉(zhuǎn)運方式進入細胞，在海藻糖磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化成糖酵解中間產(chǎn)物β-D-1-磷酸葡糖， 后者可進一步在β-磷酸葡萄糖變位酶的作用下轉(zhuǎn)化成D-6-磷酸葡糖。

6）N-乙酰氨基葡萄糖的轉(zhuǎn)化 N-乙酰氨基葡萄糖通過滲透酶蛋白、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)3 種轉(zhuǎn)運方式進入細胞， 之后經(jīng)過N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶和N-乙酰-1-磷酸氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、 磷酸葡萄糖胺變位酶、6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶等5 種酶的催化下最終轉(zhuǎn)化為糖酵解中間產(chǎn)物α-D-6-磷酸葡糖。

7）6-磷酸纖維二糖的轉(zhuǎn)化 纖維二糖通過滲透酶蛋白和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進入細胞，在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶II 的作用下磷酸化形成6-磷酸纖維二糖。在β-葡萄糖苷酶作用下轉(zhuǎn)化為糖酵解中間產(chǎn)物α-D-1-磷酸葡糖。

8）乳糖的轉(zhuǎn)化 乳糖通過滲透酶蛋白和ABC轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞，經(jīng)過2 條途徑轉(zhuǎn)化為糖酵解的中間產(chǎn)物α-D-6-磷酸葡糖。 途徑I、II 分別是在α-半乳糖苷酶、己糖激酶和葡萄糖激酶、醛糖1-表異構(gòu)酶、半乳糖激酶、UPD 葡萄糖-1-磷酸己糖尿苷酰轉(zhuǎn)移酶和磷酸葡萄糖變位酶的作用下生成糖酵解中間產(chǎn)物α-D-6-磷酸葡糖。

9）D-1 磷酸果糖的轉(zhuǎn)化 果糖通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進入細胞，最終形成D-1-磷酸果糖，而后通過3 條途徑轉(zhuǎn)化成糖酵解中間產(chǎn)物D-3-磷酸甘油醛。 3 條途徑的關(guān)鍵酶分別為I 類果糖二磷酸醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶、1-磷酸果糖激酶和I 類果糖二磷酸醛縮酶、I 類果糖二磷酸醛縮酶和丙糖激酶。

3 討 論

采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法得到的細菌主要屬有Bacillus、Brevibacterium、Enterobacter 等， 真菌主要屬有Aspergillus、Cladosporium、Monascus、Penicillium等。 通過高通量測序結(jié)果顯示，窖泥中細菌和真菌的優(yōu)勢屬為Petrimonas（10.54%）、Bacillus（9.21%）、Issatchenkia（17.12%）、Debaryomyces（13.83%）等。細菌和真菌的傳統(tǒng)分離與高通量測序結(jié)果存在些許偏差，這是因為窖泥中大多數(shù)微生物為未/難培養(yǎng)微生物，培養(yǎng)條件要求苛刻，很難做到全部純培養(yǎng)且只能培養(yǎng)出微生物群落中數(shù)量占優(yōu)勢的菌群，但傳統(tǒng)分離篩選技術(shù)仍占有重要的地位[22]。因此，在分析窖泥微生物的群落結(jié)構(gòu)時要采用2 種或多種方法，才能得到更為全面、客觀的結(jié)果。通過檢索文獻[23-27]發(fā)現(xiàn)，城固酒細菌群落組成分類上與同香型白酒具有一定的相似性， 特別是Bacillus 在同香型白酒中基本均存在， 這是因為窖泥發(fā)酵過程中抗逆性強，耐高溫的芽孢能適應(yīng)復(fù)雜的釀造環(huán)境，并能夠為白酒提供香味物質(zhì)[28]。 但核心菌屬與其他白酒產(chǎn)區(qū)存在較大差異，城固酒細菌屬以Petrimonas 為主，為易降解碳水化合物的發(fā)酵細菌[29-30]；真菌屬多為酵母菌， 兩者顯著區(qū)別于其他產(chǎn)區(qū)的群落結(jié)構(gòu)，這表明城固酒糖代謝途徑更為活躍也更復(fù)雜，出酒率更快更高，使得城固酒釀造周期顯著縮短于其他產(chǎn)區(qū)且具有自身獨特的白酒風(fēng)味。 由此可見，不同釀造環(huán)境、原料、水質(zhì)等的不同對窖泥中微生物的多樣性影響很大，這造成了不同地域白酒風(fēng)味特點的差異。

4 結(jié) 語

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫比對，共注釋了236 022 個unigene，碳水化合物代謝為主要代謝活動，有15 條碳水化合物代謝途徑。通過CAzY 數(shù)據(jù)庫比對，共注釋到210 個碳水化合物酶類，其中糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶類數(shù)量最多，占碳水化合物活性酶總數(shù)的74%，這可能與城固窖泥中以Petrimona 主的易降解碳水化合物的發(fā)酵細菌有關(guān)，在大量糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶的作用下能快速降解糖類，從而為糖類的進一步生成、轉(zhuǎn)化及代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和反應(yīng)條件。

在糖代謝途徑中，窖泥編碼了多種糖類的糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因，通過3 種不同的轉(zhuǎn)運方式將相關(guān)糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，具備將多種糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖酵解中間產(chǎn)物的關(guān)鍵酶基因，其中對甘露糖的轉(zhuǎn)運能力最強，這與夏亞男采用宏基因組測序分析酒醅糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)結(jié)果一致[30]。 甘露糖作為葡萄糖的異構(gòu)體和多種多糖的組成成分，通過多種糖代謝途徑轉(zhuǎn)化和生成，并參與糖酵解過程。 作者在分析窖泥微生物多樣性的基礎(chǔ)上，進一步研究了窖泥微生物代謝活動及糖代謝過程的關(guān)鍵基因，為后續(xù)進一步篩選及應(yīng)用功能菌株，分析其在代謝通路中的作用和關(guān)鍵酶基因，為城固酒窖泥的改善、制備及品質(zhì)的提升提供理論依據(jù)。