馬紅梅， 馬臣杰， 岳 苑，3， 馬玲玲， 馬嘉琦， 曾 瑾*

（1. 寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏大學 生命科學學院，寧夏 銀川 750021；3. 寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院，寧夏 銀川 750002）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM），簡稱單增李斯特菌，是一種常見的革蘭氏陽性胞內寄生菌。 該菌為短桿菌，大小為0.5 μm×（1.0~2.0） μm，兼性厭氧、嗜冷、不含芽孢，不形成莢膜，廣泛存在于周圍環(huán)境中[1-3]。 LM 是一種人畜共患致病菌，主要由污染的食物傳播，是世界衛(wèi)生組織列舉的四大食源性病原菌之一[4-7]。 據國家衛(wèi)健委報道，LM 導致的食源性疾病病例數(shù)在全國食源性病例數(shù)中占很大比例。 LM 是李斯特菌眾多類型中唯一能引起人類李斯特菌?。↙isteriosis）的主要病原體[8]，尤其容易感染孕婦、新生兒等免疫力低下的人群[9-11]。即使是低水平的食物污染也有可能導致局灶性感染、 細菌性敗血癥和腦膜炎以及胎兒感染，導致流產或妊娠并發(fā)癥[12-13]，甚至引起危及生命的疾病[14-15]。 據美國疾病預防控制中心報道，美國每年患有李斯特菌病的人數(shù)多達2 000 人，死亡率高達30%，其致死率甚至高過其他流行性致病菌，如沙門氏菌及肉毒桿菌[16]。據報道，惡性腫瘤或器官移植患者更易患侵襲性李斯特菌病， 人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性患者侵襲性李斯特菌病的發(fā)病率是普通人群的500~1 000 倍[17]。目前，由于其高病死率[18-19]以及高耐藥性，李斯特菌病仍是許多國家關注的重大公共衛(wèi)生問題和面臨的主要挑戰(zhàn)[20-24]。

目前關于LM 的研究主要在LM 的檢測以及應用上， 但關于LM 對機體的致病機制研究尚不明確[25-26]。 因此作者對LM（ATCC 19115）感染前后 的受體細胞RAW264.7 進行了轉錄組測序分析[27]，期望從LM 感染前后的受體細胞中找到差異表達的基因和代表性的差異表達通路，從而為進一步研究LM 的致病機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小鼠單核巨噬白血病細胞（RAW264.7）和單核細胞增生李斯特菌（ATCC 19115）：均為作者所在實驗室保存。

1.2 單核細胞增生李斯特菌的培養(yǎng)

將保有LM 的磁珠在腦心浸液 （brain heart infusion，BHI）固體培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)16~18 h 后挑單菌接至10 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600達0.6~0.8。吸取細菌培養(yǎng)液至無菌的1.5 mL 離心管，12 000 r/min 離心30 s 收集細菌，無菌PBS 洗滌3 次，用1 mL DMEM 完全培養(yǎng)基重懸混勻后， 測定OD600，根據需要調整菌液的濃度。

1.3 RAW264.7 細胞培養(yǎng)及感染

RAW264.7 細胞培養(yǎng)在由基礎培養(yǎng)基和體積分數(shù)10%新生小牛血清（newborn calf serum，NBCS）組成的DMEM 完全培養(yǎng)基中， 取對數(shù)期RAW264.7細胞鋪于6 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔細胞數(shù)量為1×106個， 在37 ℃和體積分數(shù)5%的CO2條件下過夜培養(yǎng)，細胞密度達到約80%時進行處理。 本實驗主要分為2 組，每組進行3 次重復，LM 感染組（MOI=10）命名為NL1、NL2 和NL3，感染時間為6 h；另外一組未處理的細胞作為對照組， 命名為NC1、NC2 和NC3。

1.4 總RNA 提取

使用Trizol 試劑（TIANGEN）提取細胞總RNA，Nanodrop8000 測定RNA 濃度。 OD260/OD280在1.8~2.2 為合格樣本。

1.5 文庫構建及測序

RNA-seq 實驗過程涉及樣本檢測、 富集mRNA、 合成cDNA 第一條鏈和第二條鏈、 末端修復、 加A 尾和接頭、 篩選cDNA、 PCR 擴增、 純化PCR 產物、建庫。文庫質檢合格后測序，流程見圖1。

1.6 數(shù)據質控

測序原始數(shù)據經過一系列過濾、篩選以及錯誤率檢查、GC 含量分布檢查，最后獲得clean reads[28]。 后續(xù)所有分析均為對clean reads 數(shù)據進行分析所得[29]。

1.7 差異基因篩選

使用DESeq2（Anders et al，2014）軟件進行差異表達分析，分析方法基于負二項分布。 以P<0.05 以及|lb F|≥1.5（其中F 為fold change）為標準篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）[30]。

1.8 差異基因富集分析

對篩選后符合標準的DEGs 進行GO（Gene Ontology，GO） 和 KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析[31]。利用GO 對注釋到的基因功能進行分析，利用KEGG 根據參與的通路或功能對DEGs 進行分類和統(tǒng)計。 富集分析標準為P<0.05。

1.9 RT-qPCR 驗證

作者選取了11 個DEGs 對分析結果進行RTqPCR 驗證。 對各基因擴增結果計算相對表達量，并與RNA-Seq 結果進行比較。

1.10 統(tǒng)計學分析

對計算結果進行統(tǒng)計學分析， 繪圖軟件為GraphPad Prism 8， 數(shù)據結果表示為Mean±SD （P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著）。

2 結果與分析

2.1 數(shù)據質控分析

對LM 感染組和對照組獲得的clean reads 進行匯總，見表1。Q20 大于95%，Q30 大于90%，表明經LM 感染后的RAW264.7 細胞所提取的RNA 質量良好，轉錄組測序結果可信。

表1 樣本測序數(shù)據質量匯總Table 1 Summary of sample sequencing data quality

2.2 樣本間相關性分析

相關性分析可用于檢驗實驗可靠性和樣本合理性， 相關系數(shù)值越接近1 代表樣本的相似度越高。 生物學重復樣品間R2一般要求大于0.8。 由圖2 可知，本研究中的3 次獨立重復實驗所收獲的細胞RNA 樣品經轉錄組測序后， 樣本間相關性系數(shù)均大于0.8， 證明3 次重復實驗的樣本間差異不顯著，因此后續(xù)的轉錄組測序結果差異分析可靠。

圖2 樣本間相關性分析熱圖Fig. 2 Heat map of correlation between samples

2.3 差異基因篩選

edgeR 軟件篩選出P<0.05 以 及| lb F |≥1.5 的DEGs（其中F 為基因表達倍數(shù)變化）。圖3 顯示，LM感染RAW264.7 細胞后，DEGs 為1 782 個，其中上調的DEGs 為989，下調的DEGs 為793，篩選結果見火山圖。 另外將DEGs 取并集后進行分析[28]，表達相似基因均可聚類在一起，見圖4。

圖3 差異基因火山圖Fig. 3 Differential gene volcano map

圖4 差異表達基因聚類熱圖Fig.4 Clustering heat map of differentially expressed genes

2.4 差異基因GO 功能富集分析

對聚類后的DEGs 進行GO 功能富集分析，共得到617 條GO 注釋，其中51.05%（315 條）涉及生物學過程 （BP），36.79%（227 條） 涉及分子功能（MF），12.16%（75 條） 涉及細胞組分（CC）。 圖5 為前30 條注釋結果，BP 中DEGs 顯著集中在免疫系統(tǒng)過程（immune system process）、免疫反應（immune response）、G 蛋白偶聯(lián)受體信號通 路 （G-protein coupled receptor signaling pathway）、 細胞內信號轉導（intracellular signal transduction）、細胞程序性死亡的調控（regulation of programmed cell death）等；CC 中DEGs 顯著集中在胞外區(qū)（extracellular region） 中；MF 中DEGs 顯著集中在細胞因子活性（cytokine activity）、 細 胞 因 子 受 體 結 合（cytokine receptor binding）、信號受體結合（signaling receptor binding）、 分 子 功 能 調 節(jié) （molecular function regulator）、受體調節(jié)活性（receptor regulator activity）和受體配體活性（receptor ligand activity）等。在所有注釋中，細胞因子活性最顯著。

圖5 GO 富集分析柱狀圖Fig. 5 Histogram of GO enrichment analysis

2.5 差異基因KEGG 富集分析

對DEGs 進行KEGG 分析，DEGs 富集到了304條信號通路中，顯著性變化的有44 條（P<0.05）。 圖6 為富集的前19 條KEGG 通路[28]，DEGs 在腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、甲型流感（Influenza A）、IL-17 信 號 通 路 （IL-17 signaling pathway）、NF-κB 信號通路 （NF-kappa B signaling pathway）等信號通路顯著富集。 對顯著富集的前幾條信號通路的差異基因進行統(tǒng)計， 結果見表2。KEGG 通路分析表明， 上調的基因主要集中在促炎細胞因子、趨化因子等免疫調控方面的基因，例如白介素IL-6、IL-1β、TNF、NLRP3、CC 基序趨化因子CCL2 和CCL22 等。

表2 顯著富集信號通路及其差異表達基因Table 2 Significantly enriched signaling pathways and their differentially expressed genes

圖6 前19 條富集的KEGG 信號通路散點圖Fig. 6 Scatter diagram of the first 19 enriched KEGG signaling pathways

2.6 RT-qPCR 驗證

為了進一步驗證結果準確性，從表2 列出的通路中篩選出11 個基因（5 個上調，6 個下調）進行驗證，RT-qPCR 引物序列見表3，對比結果見圖7。 由圖7 可知，RT-qPCR 結果與轉錄組測序一致， 表明數(shù)據可靠。

表3 RT-qPCR 引物序列Table 3 RT-qPCR primer sequence

圖7 RT-qPCR 數(shù)據與RNA-Seq 數(shù)據比較Fig. 7 Comparison of RT-qPCR data and RNA-Seq data

3 討 論

李斯特菌病是許多國家關注的重大公共衛(wèi)生安全問題，在2017 年6 月中旬，南非曾出現(xiàn)李斯特菌病病例爆發(fā)的案例。 據美國國家傳染病研究所（NICD）報告，在1 060 個實驗室檢測確認的李斯特菌病病例中死亡人數(shù)多達216 人，通過流行病學調查發(fā)現(xiàn)， 爆發(fā)的主要原因是食用了被LM 污染的即食肉制品。 通過對患者的不同分離株進行MLST（multilocus sequence typing，MLST）分析[32]，發(fā) 現(xiàn) 來自患者的分離株中很大一部分（91%）的序列類型為6 型 （ST6）[33-35]。 Zhang 等使用脈沖場凝膠電泳（PFGE）和全基因組測序（WGS）對上海市即食肉類加工廠中的單核細胞增生李斯特菌進行了研究，結果顯示在48 個送檢樣本中，有12 個樣本存在單核細胞增生李斯特菌分離株，其中ST5（1/2b）分離株占主導地位（83.3%，10/12）[20]。 另外，有研究團隊對2008—2019 年來自29 個醫(yī)療機構的144 例李斯特菌病病例進行了分析，其中包括96 例母嬰感染，33例菌血癥，13 例神經性李斯特菌病和2 例皮膚性李斯特菌病。這些病例中，52 例感染孕婦有31 例胎兒流產 （占59.6%），41 例新生兒患者中有4 例死亡（占9.8%），通過MLST 分析將144 株臨床分離菌株區(qū)分為23 個單獨的ST 序列類型。 分析結果顯示，最流行的ST 是ST87（49 株，占34.0%）。 此外，該研究發(fā)現(xiàn)所有單核細胞增生李斯特氏菌分離株對青霉素、氨芐青霉素和美羅培南均敏感,這也說明，導致臨床李斯特菌病的單核細胞增生李斯特菌菌株具有基因多態(tài)性， 同時應該警惕ST87 和ST1 型所引起的高患病率[36]。

單增李斯特菌是一種胞內寄生菌，是動物和人類胃腸道的暫時性寄居者[37-38]。 它能穿越包括胎盤屏障、血腦屏障、腸上皮緊密連接在內的多種生理性屏障，能廣泛定植于各種組織器官。 LM 細胞膜表面存在2 種重要的毒力因子InlA 和InIB，在LM 中通過腸上皮屏障和胎盤屏障發(fā)揮關鍵作用[39]。 溶血素O（listeriolysinO，LLO）是LM 分泌的成孔毒素，在LM 從囊泡逃逸進入胞漿內的過程中發(fā)揮重要作用[40-42]。 ActA 也是LM 的胞膜表面蛋白質，介導LM 在細胞內的遷移以及在相鄰細胞和組織間的傳播[43-44]。

在胃腸道內，先天免疫受體起著抵抗侵入性病原體的直接防御機制作用，而細菌建立感染的第一步，也是最重要的一步，就是微生物病原體可能通過毒素、RNA、DNA 作用于宿主細胞，觸發(fā)宿主細胞內的信號轉導，引起細胞生理和生化變化，同時宿主細胞也通過分泌某些蛋白質進行免疫調控[45-46]。這種細菌與宿主的相互作用不僅決定了疾病的轉歸，而且對理解病原微生物的早期感染機制也具有重要意義[47-49]。

轉錄組分析在真菌及細菌的致病機理研究中應用廣泛。 唐光甫等人利用轉錄組分析，對紅曲中桔霉素導致毒性的內在機理進行了探究[50]，發(fā)現(xiàn)桔霉素可能通過TP53、CASP3、MAPK3 和ALB 等關鍵靶點導致肝腎毒性，揭示了桔霉素導致肝腎毒性的潛在作用靶點和信號通路，為進一步研究桔霉素致毒機理和健康防護提供理論參考。 目前還未有LM感染RAW264.7 細胞后轉錄組表達譜差異分析的報道。 RAW264.7 細胞是研究細菌感染的經典細胞系[51]。為了探討RAW264.7 細胞經LM 處理后基因表達譜的變化， 用LM 感染RAW264.7 細胞6 h 后提取感染組和對照組細胞總RNA 進行轉錄組測序。 結果表明，與對照組相比，差異表達基因有1 782 個，其中上調為989， 下調為793。 對DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析， 測序分析的結果表明DEGs 大多富集在與炎癥相關的信號通路中，如腫瘤壞死因子信號通路、NF-κB 信號通路、 凋亡通路和IL-17 信號通路等。 對上述通路中高表達的基因進行研究，基因NLRP3 在LM 感染后顯著上調。 NLRP3 也稱NOD 樣受體蛋白質3 （Nod-like receptor protein 3，NLRP3），它能結合凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）形成NLRP3 （NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性小體。 研究表明，NLRP3 在心血管疾?。–VD）[52]、動脈粥樣硬化[53-55]、敗血癥[56]、糖尿病腎病[57-58]、帕金森病[59]、缺血性肌肉損傷[60]等多種疾病中發(fā)揮重要作用。本課題組也對NLRP3 進行了相關研究[61]，NLRP3 炎性小體可由雙信號模式激活，微生物或內源性細胞因子刺激細胞， 導致核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的激活，NF-κB 激活后則會介導IL-1β 和IL-18 等重要的細胞炎性因子前體的產生，同時NF-κB 激活NLRP3 mRNA 的轉錄，再進行翻譯及翻譯后修飾等， 此過程即稱為NLRP3 priming， 也被認為是經典的NLRP3 炎性小體活化中的第一信號[62-63]。 第二信號可由ATP、毒素、病毒、ROS 等識別位于細胞質內的模式識別受體NLRs 激活[64-65]。 2 種信號也會共同作用，導致一系列嚴重的炎癥反應[66-67]。 總之，結合轉錄組分析及以上研究數(shù)據表明， 在LM 感染RAW264.7 細胞中，NLRP3 介導的炎癥反應可能發(fā)揮了極其關鍵的作用。

4 結 語

通過轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，RAW264.7 細胞在感染LM 6 h 后差異表達基因有1 782 個， 其中上調為989，下調為793。 通過對基因注釋發(fā)現(xiàn)，DEGs 主要集中在免疫系統(tǒng)過程、免疫反應、細胞內信號轉導、細胞程序性死亡的調控、細胞因子活性、細胞因子受體結合、信號受體結合、分子功能調節(jié)、受體調節(jié)活性和受體配體活性等生物學功能。 除此之外，DEGs 大多富集在與炎癥相關的信號通路中， 如腫瘤壞死因子信號通路、NF-κB 信號通路、Toll 樣受體信號通路、凋亡通路和IL-17 信號通路等。 通過對功能基因進行分析，發(fā)現(xiàn)NLRP3 基因在LM 感染后顯著上調，這為單增李斯特菌感染RAW264.7 細胞后介導的炎癥反應提供了新思路， 也為進一步研究LM 的致病機理提供思路和研究基礎。