張 莉,吳 歡,尹艷艷

(1.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室,安徽 合肥 230032;2.安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室,安徽 合肥 230038)

復方苦參注射液(Compound Kushen Injection,CKI)又稱“巖舒注射液”,是由苦參及白土苓飲片提取精制而成的滅菌水溶性制劑［1］,具有清熱解毒、涼血利濕、散結止痛之功效。CKI臨床主要用于抑制腫瘤并緩解癌性疼痛,療效確切［2-3］。近年來有研究［4-5］表明,生物堿是CKI的主要活性成分,其抑制腫瘤的作用及機制也逐漸被揭示。中藥制劑的體內外物質基礎研究是中藥現代化、國際化的核心問題,能從本質上揭示中藥作用的科學內涵,同時也為其質量控制提供依據。馬悅［6］利用液質聯用結合核磁共振技術識別了CKI中11種化學成分,然后利用高效液相色譜建立了27批CKI的指紋圖譜并指認了8個色譜共有峰,研究取得一定進展。但CKI中生物堿類成分仍需系統(tǒng)研究,尤其是其血中移行成分。

超高效液相色譜—電噴霧離子化—四極桿飛行時間質譜(ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-ESI-QTOF/MS)具有分離性能好、靈敏度高、分辨率高、動態(tài)掃描范圍寬等優(yōu)點,已被廣泛應用于中藥體內外物質基礎的研究［7-9］。本研究采用UHPLC-ESI-QTOF/MS的全信息串聯質譜技術(full information tandem mass spectrometry,MSE)采集樣品信息,然后基于UNIFI構建靶向篩查策略識別CKI中生物堿類成分及血中移行成分,以期為CKI的質量控制及藥效物質研究提供參考。

1 儀器與材料

UHPLC-ESI-QTOF/MS配有ACQUITY I-Class UHPLC系統(tǒng)(包括在線脫氣器、恒溫控制柱室、自動取樣器和四聯泵)和Xevo G2-XS QTOF系統(tǒng):美國Waters公司;Masslynx 4.1工作站和UNIFI軟件:美國Waters公司;Milli-Q超純水凈化系統(tǒng):美國Millipore公司;CKI(總生物堿含量為20.8 mg/mL):山西振東制藥股份有限公司;色譜級乙腈:德國Merck公司;甲酸:上海Aladdin有限公司。

2 方法

2.1 CKI樣品溶液及空白溶液的制備 取CKI 10 mL,減壓離心揮干溶劑。加入2 mL甲醇,渦旋振蕩30 s使殘渣溶解,12 000 r/min離心10 min。取上清1 mL至100 mL量瓶中,甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,0.22 μm微孔濾膜濾過,即得CKI樣品溶液。取生理鹽水10 mL同法制備即得空白樣品。

2.2 動物實驗 12只SPF級健康雄性SD大鼠,體質量約200 g,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供,動物生產許可證號為SCXK(皖)2017-001。適應性飼養(yǎng)7 d(溫度和濕度分別為25 ℃±2 ℃和50%±10%,晝夜交替時間為12 h)。大鼠禁食12 h后,隨機分為CKI組和空白組,每組6只。CKI組大鼠腹腔注射CKI 2 mL,隔日1次,連續(xù)2次?？瞻捉M給予等量生理鹽水。末次給藥后,分別于0.5、1、2、4、8、12、24 h從眼下靜脈采集0.5 mL血液,置于肝素化EP管中。4 ℃ 、3 000 r/min離心5 min后,取上清,即得血漿樣品。將不同時間點所取血漿合并后,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 CKI血漿樣品及空白血漿的制備 取1 mL血漿,平均分成5份,每份200 μL。將200 μL血漿置于1.5 mL EP管中,加600 μL預冷甲醇,旋渦振蕩10 s,4 ℃、13 000 r/min離心10 min。取上清,用氮氣吹干。加200 μL預冷甲醇重新溶解殘渣,合并5份殘渣混合液,旋渦混合30 s,4 ℃、13 000 r/min離心10 min,取上清,再次用氮氣吹干,加入100 μL預冷甲醇,旋渦混合30 s,4 ℃、13 000 r/min離心10 min,即得CKI血漿樣品溶液?？瞻捉M血漿亦按此方法處理。

2.4 UHPLC條件 采用ACQUITY BEH C18色譜柱(2.1 mm×10 cm,粒徑為1.7 μm)對復雜組分進行色譜分離,柱溫為35 ℃;進樣量及流速分別為2 μL和0.2 mL/min。流動相由0.01 mol/L醋酸銨溶液(A)和乙腈(B)組成。洗脫程序:6% B,0～2.0 min;6%～15% B,2.0～4.0 min;15%～25% B,7.5～14.0 min;25%～45% B,14.0～16.0 min;45%～90% B,16.0～18.0 min;90%～100% B,20.0～21.0 min;100%～6% B,23.0～24.0 min;6% B,24.0～27.0 min。

2.5 QTOF/MS條件 采用ESI-QTOF/MS進行質譜檢測。運行參數:毛細管電壓3.0 kV,錐孔電壓40.0 V。離子源和干燥氣的溫度分別為120 ℃和400 ℃。錐孔氣體流速為40 L/h,干燥氣體流速為600 L/h。數據采集速率0.5 spectrum/s,掃描范圍50～1 200 Da。使用亮氨酸—腦啡肽(200 pg/mL)在10 μL/min流速下進行實時數據校正。MSE模式下的低、高碰撞能量分別為4 V和20～35 V。

2.6 數據分析方法 首先,建立CKI生物堿化學成分數據庫。以苦參作為關鍵詞檢索PubMed、Web of Science、Medline和CNKI等數據庫,收集CKI可能含有的生物堿類成分信息(包含化合物名稱、分子式及結構式)并輸入至Excel表格中。然后,將UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE［其中低碰撞能(4 V)獲取母離子精確質量,高碰撞能(20～35 V)獲取碎片離子精確質量］采集的CKI樣品及空白樣品源文件和CKI生物堿化學成分數據庫一起導入UNIFI軟件進行靶向篩查。UNIFI軟件參數設定:二維［2D,包含保留時間(retention time,tR)和離子強度］檢測最小峰面積為200;三維(3D,包含tR、離子強度和m/z)檢測的低、高碰撞能量下峰強度分別設置為500和150;tR偏差為±0.1 min;質量誤差為±5×10-6。待識別出CKI所含的生物堿類成分后,以這些成分重新建庫,連同UHPLC-ESI-QTOF/MSE采集的CKI給藥后大鼠血漿及空白血漿導入UNIFI軟件進行血中移行成分的篩查。依據母離子、碎片離子的精確質量對篩查出的化合物結構進行確認。最后驗證結果,對UNIFI輸出的結果進行逐一核實,當在空白組和CKI組樣品譜圖的同一tR處提取到離子強度相近的離子流時,則認為該成分為假陽性結果,應予以剔除。

3 結果

3.1 UHPLC-ESI-QTOF/MS條件的優(yōu)化 流動相的表面張力、黏度及流速越低,越有利于ESI源電噴霧離子化。因此,有機相選擇表面張力和黏度均較低的乙腈,流速設為0.2 mL/min。生物堿容易荷正電荷,離子檢測模式設置為ESI+模式。水相分別考察了純水、0.5%乙酸溶液、0.1%甲酸溶液和0.01 mol/L醋酸銨溶液,其中0.01 mol/L醋酸銨溶液作為水相與乙腈進行梯度洗脫時,化合物峰形和分離度均較好。因此,選擇乙腈-0.01 mol/L醋酸銨溶液作為洗脫液。

3.2 CKI樣品中生物堿成分分析 采用UHPLC-ESI-QTOF/MSE檢測CKI樣品溶液及空白溶液。在正離子模式下CKI樣品溶液和空白溶液的總離子流圖見圖1。根據“2.6”項下構建的靶向篩查策略對CKI中生物堿類成分進行定性分析。共識別出20種生物堿類成分,包括12種苦參堿型、3種金雀花堿型、3種羽扇豆堿型、2種苦豆堿型成分,具體結果見表1。

表1 CKI生物堿類成分的UHPLC-ESI-QTOF/MSE色譜及質譜數據

圖1 空白樣品(A)和CKI樣品(B)在ESI+模式下的總離子流色譜圖

以峰7為例解析苦參堿類化合物的識別過程。低碰撞能量下峰7(tR=3.65 min)檢測到加合離子［M+H］+的m/z為 265.191 2,以MassLynx 4.1的元素組成工具推測其分子式為C15H25N2O2;高碰撞能量下觀察到247.181 9、205.133 9、150.128 1、148.111 7、136.111 4、120.080 4等碎片離子;其中,m/z247.181 9為m/z265.191 2脫去一分子H2O而產生,接著m/z247.181 9發(fā)生電荷轉移并經過系列i裂解后生成205.133 9、150.128 1和148.111 7,其中148.111 7可進一步脫去C2H4生成120.080 4的碎片離子。見圖2。因此,經UNIFI靶向篩查并結合其母離子、碎片離子精確質量以及裂解特征,推測該化合物為氧化苦參堿。

圖2 氧化苦參堿的質譜圖(A)和裂解途徑(B)

3.3 CKI血中移行成分分析 利用UHPLC-ESI-QTOF/MSE檢測“2.3”項下獲得的CKI血漿樣品及空白血漿樣品。將“3.2”項下的20種CKI生物堿成分重新建庫并導入UNIFI,自動比對含藥血漿及空白血漿,靶向篩查出血中移行的生物堿類成分。共有17種成分能夠在血漿中被檢出,包括10種苦參堿型(5α,9α-二羥基苦參堿、9α-羥基苦參堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、14β-氧化槐定堿、槐醇堿、氧化槐定堿、槐定堿、苦參堿和槐果堿)、2種金雀花堿型(N-甲基金雀花堿、菱葉堿)、3種羽扇豆堿型(氧化黃葉槐堿、黃葉槐堿、lamprolobine)、2種苦豆堿型(鷹靛葉堿、羽扇烷寧)成分。

4 討論

多項臨床研究表明,CKI對惡性腫瘤如肝癌［10］、胃癌［11］、肺癌［12］、乳腺癌［13］具有較好的療效,腫瘤抑制作用可能與其抑制癌細胞增殖,誘導細胞周期阻滯,加速凋亡,抑制血管生成,抑制腫瘤轉移和侵襲有關［5,13］。已有研究［4］表明,苦參堿和氧化苦參堿等生物堿類成分是CKI的主要活性成分,它們對人肝癌細胞(SMMC-7721)、胃癌細胞(MKN45和SGC-7901)以及乳腺癌細胞系(MCF-7)有不同程度的抑制作用。然而,中藥制劑具有多成分、多靶點協同作用的特點,其血中移行成分是其發(fā)揮治療作用的潛在活性物質［9］。因此,有必要對CKI生物堿類組分及血中移行成分進行系統(tǒng)分析。

UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE模式是一種能夠實現高、低碰撞能量切換掃描的數據非依賴性采集技術,能在一次樣品采集過程中同時捕獲母離子和碎片離子的精確質量,并依據它們的色譜行為進行關聯和匹配［14-15］,降低了數據采集次數。由于中藥制劑化學成分具有多樣性和復雜性,傳統(tǒng)的手動提取離子流,依據母離子及碎片離子等信息進行人工解譜的過程復雜且耗時;在有基質干擾的情況下,響應信號小或含量低的成分在MSE采集模式下易發(fā)生漏判［15］。作為一種簡單高效的數據分析平臺,UNIFI能對UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE數據進行采集、峰提取、分子式確定,也能比對含藥樣品及空白樣品的差異并與庫中化合物進行匹配,依據碎片離子對化合物進行推導,最后輸出擬識別化合物的信息［16］。

本研究通過UHPLC-ESI-QTOF/MSE技術結合靶向篩查策略識別了CKI中20生物堿類成分及17種血中移行成分,為其藥效物質的系統(tǒng)闡明及質量控制體系的建立奠定了基礎。