李茂宸,范 穎,李洪洲,畢東雨,林庶茹,劉 倩

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽 110847;2.通用技術(shù)遼油寶石花醫(yī)院中醫(yī)科,遼寧 盤錦 124010)

近年來,以糖尿病為基礎(chǔ)的心血管疾病的發(fā)病率顯著增加,合并癥中冠心病最為多見,而動脈粥樣硬化是引起糖尿病患者心血管病變的主要原因［1-2］。課題組前期研究［3-4］顯示,黃芪葛根湯具有降糖、降脂作用。研究［5-6］結(jié)果發(fā)現(xiàn),遠志湯中遠志與石菖蒲均具有降血脂、保護心血管的藥理作用?！妒備洝分杏涊d遠志湯可用于治療久心痛。研究［7-8］表明,內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化(endothelial-mesenchymal transition,EMT)是動脈粥樣硬化斑塊形成的主要原因,轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad是調(diào)節(jié)EMT的主要通路之一。本實驗將黃芪葛根湯與遠志湯合用,觀察黃芪葛根湯與遠志湯合方對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用,探究其延緩糖尿病動脈粥樣硬化的作用是否通過TGF-β/Smad通路調(diào)節(jié)EMT而實現(xiàn)。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠70只,體質(zhì)量(200±20)g,購自遼寧省長生生物技術(shù)有限公司［生產(chǎn)許可證號: SCXK(遼)2020-0001］,飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室［實驗室動物使用許可證號: SYXK(遼)2019-0004］,室溫(24±2)℃,濕度50%～70%,自由攝食、飲水。本實驗已通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn),實驗動物倫理審查編號為210000420210667。

1.2 藥物 黃芪(批號 28121025,產(chǎn)自內(nèi)蒙古)、葛根(批號 31921007,產(chǎn)自安徽)、遠志(批號 13621006,產(chǎn)自陜西)、石菖蒲(批號 06121007,產(chǎn)自安徽)均一次性從河北仁心藥業(yè)有限公司購買。糖脈康顆粒(國藥準(zhǔn)字 Z10970026,由黃芪、生地黃、赤芍、葛根、桑葉、淫羊藿組成):四川寶鑒堂藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 參照文獻［9］結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果復(fù)制糖尿病動脈粥樣硬化模型。第一步:采用高脂飼料飼養(yǎng)大鼠28 d;第二步:維持高脂飲食,第29天按30 mg/kg劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(濃度2%,采用pH 4.2的檸檬酸鈉緩沖液配制),復(fù)制高糖高脂模型。在注射鏈脲佐菌素第3天,測定隨機血糖值≥16.8 mmol/L表明模型復(fù)制成功。

2.2 黃芪葛根湯與遠志湯合方制備 查閱文獻,依據(jù)藥物的臨床用量制備合方1(黃芪、遠志、石菖蒲各10 g,葛根5 g);依據(jù)《證治匯補》《圣濟總錄》記載的用量制備合方2(黃芪、遠志、石菖蒲各30 g,葛根15 g)。將中藥飲片共同浸泡40 min,分別加10、8、6倍水,分別煎煮2.5、2.0、1.5 h,將3次藥液混合,濃縮至合方1組和合方2組含生藥量分別為0.315、0.945 g/mL,4 ℃冰箱存放備用。

2.3 動物分組及給藥 將70只SPF級SD大鼠按隨機血糖分為空白對照組、模型組、陽性對照組、黃芪葛根湯與遠志湯合方1組(簡稱“合方1組”)、黃芪葛根湯與遠志湯合方2組(簡稱“合方2組”)。空白對照組大鼠10只,其余各組大鼠15只。空白對照組采用普通飼料喂養(yǎng),其他組采用高脂飼料喂養(yǎng)。模型復(fù)制成功當(dāng)日開始連續(xù)灌胃給藥49 d。陽性對照組灌胃糖脈康顆粒溶液［10.5 g/(kg·d)］,合方1組、合方2組的給藥劑量分別為3.15、9.45 g/(kg·d),給藥劑量均相當(dāng)于60 kg成人臨床用量的6.3倍,空白對照組、模型組灌胃等容積生理鹽水,給藥第50天,向大鼠腹腔注射20%烏拉坦(1.2g/kg)麻醉后采集標(biāo)本。實驗過程中,模型組死亡2只,模型未復(fù)制成功2只;陽性對照組死亡2只,模型未復(fù)制成功3只;合方1組死亡3只,模型未復(fù)制成功4只;合方2組死亡3只,模型未復(fù)制成功4只。大鼠死亡原因可能與藥物劑量相關(guān)。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 血糖血脂水平檢測 灌胃后每周定時采用血糖儀檢測大鼠血糖。采集標(biāo)本前12 h禁食,正常飲水,20%烏拉坦(1.2 g/kg)溶液腹腔注射麻醉后采集大鼠腹主動脈血,檢測TG、TC、HDL-C、LDL-C、糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c,HbA1c)水平。

2.4.2 HE染色法觀察主動脈的組織形態(tài) 取大鼠主動脈,常規(guī)HE染色后顯微鏡下觀察主動脈形態(tài)并拍照。

2.4.3 RT-PCR法檢測大鼠主動脈Vimentin、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter-4,Glut-4)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)mRNA表達水平 先提取總RNA,再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照試劑盒說明書配置RT反應(yīng)液(42 ℃ 2 min,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,重復(fù)40個循環(huán))和PCR反應(yīng)液(95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,重復(fù)40個循環(huán))。采用2-ΔΔCT法計算各組Vimentin、Glut-4、AMPK、SREBP-1c mRNA相對表達水平。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠血清Vimentin、Twist1、TGF-β、Snail1水平 嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書檢測大鼠血清Vimentin、Twist1、TGF-β、Snail1水平。

2.4.5 Western blot法檢測大鼠肝臟SREBP-1c和主動脈Smad-2、Smad-3蛋白表達水平 取肝臟和主動脈組織各0.1 g于EP管中,加入1 mL裂解液,研磨后靜置30 min,在12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,取上清。嚴(yán)格按照BCA試劑盒說明書對蛋白進行定量分析,應(yīng)用Image J軟件(1.8.0.112)進行分析。

3 結(jié)果

3.1 5組大鼠血糖水平比較 模型復(fù)制前與高脂飲食28 d后,各組大鼠血糖水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥第50天,與空白對照組比較,模型組大鼠血糖明顯升高(P<0.05);與模型組比較,合方1組與合方2組大鼠血糖均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血糖水平比較

3.2 5組大鼠主動脈組織形態(tài)比較 空白對照組大鼠主動脈壁結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)皮細(xì)胞完整。模型組大鼠主動脈結(jié)構(gòu)紊亂,內(nèi)膜增厚,可見粥樣斑塊形成。合方1組與陽性對照組大鼠主動脈結(jié)構(gòu)紊亂,部分區(qū)域可見內(nèi)皮細(xì)胞破壞及粥樣斑塊形成。合方2組部分區(qū)域可見粥樣斑塊。見圖1。

注:A.空白對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.合方1組;E.合方2組

3.3 5組大鼠血清HbA1c和血脂水平比較 與空白對照組比較,模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HbA1c水平顯著升高,HDL-C水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,合方1組與合方2組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HbA1c水平顯著降低(P<0.05),HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。合方1組與合方2組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),合方2組血清HbA1c水平顯著低于合方1組(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠血清HbA1c、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較

3.4 5組大鼠主動脈Vimentin、Glut-4、AMPK、SREBP-1c mRNA表達水平比較 與空白對照組比較,模型組大鼠主動脈Vimentin、SREBP-1c mRNA表達水平顯著升高(P<0.05),Glut-4、AMPK mRNA表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,合方1組與合方2組大鼠主動脈Vimentin、SREBP-1c mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),Glut-4、AMPK mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與合方1組比較,合方2組大鼠主動脈Vimentin、SREBP-1c mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),AMPK mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠主動脈Vimentin、Glut-4、AMPK、SREBP-1c mRNA表達水平比較

3.5 5組大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1表達水平比較 與空白對照組比較,模型組大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,合方2組大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1水平顯著降低(P<0.05),合方1組僅Snail1水平顯著降低(P<0.05)。與合方1組比較,合方2組大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 5組大鼠血清Vimentin、TGF-β、Twist1、Snail1水平比較

3.6 5組大鼠主動脈Smad-2、Smad-3和肝臟SREBP-1c表達水平比較 與空白對照組比較,模型組大鼠主動脈Smad-2、Smad-3和肝臟SREBP-1c表達水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,合方1組與合方2組大鼠主動脈Smad-2、Smad-3和肝臟SREBP-1c表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖2、表6。

注:A.空白對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.合方2組;E.合方1組

表6 5組大鼠主動脈Smad-2、Smad-3和肝臟SREBP-1c表達水平比較

4 討論

糖尿病是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因之一,現(xiàn)代研究［10-11］證實,糖脂代謝異?？蓪?dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。因此,通過調(diào)節(jié)糖脂代謝,保護內(nèi)皮細(xì)胞,抑制EMT,可以有效控制糖尿病動脈粥樣硬化。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪、葛根具有降糖、降脂作用,遠志具有抗炎、保護心腦血管的作用［12］,石菖蒲具有保護心血管的作用［13］。研究［14］證實,黃芪葛根湯可以調(diào)控TGF-β/Smad通路?！妒備洝酚涊d,遠志湯可用于治療久心痛。黃芪葛根湯和遠志湯合用,可用于治療糖尿病心血管病變。

研究［15］表明,動脈粥樣硬化性病變是2型糖尿病患者發(fā)生心血管病變的病理生理基礎(chǔ)。EMT是內(nèi)皮細(xì)胞在高脂、高糖等因素作用下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特殊狀態(tài),高脂、高糖狀態(tài)下,內(nèi)皮細(xì)胞的物理屏障和維持血管狀態(tài)的功能均受到損害,加速動脈粥樣硬化斑塊形成,是導(dǎo)致糖尿病動脈粥樣硬化的主要原因［3-4］。高糖環(huán)境會導(dǎo)致TGF-β/Smad通路的激活。TGF-β通過調(diào)節(jié)Smad2/3/4向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移激活Snail、SIP1、Twist1等轉(zhuǎn)錄因子［16-17］,從而調(diào)節(jié)EMT。Vimentin蛋白是EMT的典型標(biāo)志物,也受到EMT轉(zhuǎn)錄因子的反向調(diào)節(jié),可反映EMT的情況。TGF-β/Smad通路下游的Smad2、Smad3能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist1基因表達。Twist1、Snail1是細(xì)胞核中與EMT密切相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子［16-17］,作為TGF-β/Smad通路的下游因子,Twist1、Snail1是調(diào)節(jié)EMT的重要靶點,與糖尿病動脈粥樣硬化密切相關(guān)。脂類代謝異?？蓪?dǎo)致動脈粥樣硬化中內(nèi)皮細(xì)胞損傷［18］。SREBP-1c是調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,SREBP-1c表達失調(diào)與血脂異常和2型糖尿病的發(fā)生關(guān)系密切［19］,可影響LDL-C與HDL-C的生成與代謝,二者不僅影響動脈粥樣硬化斑塊的形成,還影響EMT的進程［20-21］。AMPK磷酸化可間接抑制SREBP-1c表達［22］。黃芪葛根湯與遠志湯合方通過抑制AMPK和SREBP-1c表達,進而調(diào)節(jié)糖脂代謝,降低體內(nèi)血糖、血脂水平,保護血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而起到降糖、降脂,延緩動脈粥樣硬化的重要作用。

本實驗結(jié)果顯示,血糖、血脂升高與EMT密切相關(guān),黃芪葛根湯與遠志湯合方一方面通過TGF-β/Smad通路直接調(diào)控EMT,另一方面可以通過調(diào)控糖脂代謝達到抑制EMT的作用。其作用機制是黃芪葛根湯與遠志湯合方通過干預(yù)TGF-β/Smad信號通路,抑制Vimentin、Snail、Twist1、Smad3的表達,延緩EMT的進程;通過TGF-β上調(diào)HDL-C、Glut-4、AMPK蛋白表達水平,下調(diào)TG、TC、LDL-C、SREBP-1c蛋白及mRNA表達水平,調(diào)節(jié)糖脂代謝,抑制EMT。黃芪葛根湯與遠志湯合方從上述兩方面抑制EMT的發(fā)生,降低動脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險。本研究對黃芪葛根湯與遠志湯合方調(diào)控糖尿病動脈粥樣硬化的部分機制進行了解析,合方是否通過其他通路作用于EMT,以及黃芪葛根湯與遠志湯合方獨立作用的機制是否相同,尚需進一步研究。