王斐斐，李煒，賀禮琴，白昌儒，董明清，王娟毅*

1.西安交通大學附屬三二〇一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，陜西 漢中 723000

2.空軍軍醫(yī)大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，陜西 西安 710032

胃癌是我國發(fā)病率第5 位的腫瘤，也是導致腫瘤相關(guān)死亡的第3 大原因[1]。超過90%的胃癌患者在診斷時已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移[2]。放療、化療、靶向治療是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移胃癌的主要治療方法，但化療藥物特異性較低，且不良反應明顯[3-4]。因此，尋找更為安全高效的治療藥物具有重要意義。

氧化苦參堿是從苦參干燥根、果實中提取的一種醌類生物堿，是苦參堿的主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[5-6]。研究表明，氧化苦參堿是一種天然抗癌藥物，能夠顯著抑制癌細胞增殖、影響多種惡性腫瘤的發(fā)生和進展[6]。已證實，氧化苦參堿可對胃癌BGC-823 細胞及胃癌HGC-27細胞裸鼠移植瘤模型發(fā)揮抑制生長作用[7-8]。課題組組前期也報道了苦參堿可通過血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）/血管內(nèi)皮生長因子受體3（VEGFR3）和核因子-κB（NF-κB）/Toll 樣受體4（TLR4）信號通路保護大鼠的胃黏膜損傷[9]。最近研究表明，氧化苦參堿可以通過調(diào)節(jié)microRNA（miRNA）的表達來發(fā)揮其抗腫瘤作用[10-11]。miRNA 是內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，與靶miRNA 的3 個非翻譯區(qū)域結(jié)合，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達。研究表明，miR-155-5p 在肝癌、食管癌等消化系統(tǒng)腫瘤中高度表達，并且與預后不良相關(guān)[12-13]。然而，目前尚不清楚miR-155-5p 是否在胃癌中過度表達，以及氧化苦參堿是否可通過調(diào)節(jié)miR-155-5p 在胃癌中的表達以抑制腫瘤進展?；诖?，本研究探討了氧化苦參堿對胃癌細胞中miR-155-5p 表達、胃癌細胞生物學行為及miR-155-5p 靶基因?qū)Ψ忾]蛋白1（Claudin 1）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和c-Myc 表達的影響，為胃癌治療的新藥物研發(fā)和新靶點的確立提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人胃癌細胞系SGC7901、MGC803 和正常胃黏膜GES-1、AGS 細胞系購自中國科學院上海細胞庫。錯義序列siRNA、miR-155-5p-模擬物和miR-155-5p-抑制劑由寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司合成。RNA 分子序列如下：miR-155-5p 模擬物，5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’，miR-155-5p 抑制劑，5’-ACCCCUAUCACAUUAGCAUU AA-3’,錯義序列 siRNA，5’-CCCUAUCACAAUUA GCAUUAAUU-3’。氧化苦參堿購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號A111285，純度為分析標準品。

MTT 和0.1%結(jié)晶紫溶液染色購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司。Claudin 1 抗體（貨號ab211737）、c-Myc 抗體（貨號ab32072）、Cyclin D1 抗體（貨號ab16663）、抗B 細胞淋巴瘤/白血病基因2（Bcl-2）抗體（貨號ab203516）、抗胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體（貨號ab184787）購自Abcam 公司。ECL 試劑盒和Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購自美國Becton Dickinson 公司。4%多聚甲醛購自廣州碩譜生物科技有限公司。LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑、Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司，Transwell 小室、Matrigel 基質(zhì)膠購自美國Corning公司。

Image-Pro Plus 數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)購自北京麥克奧迪儀器儀表公司，CKX53 光學顯微鏡購自日本Olympus 公司，F(xiàn)ACSCanto 流式細胞儀購自買美國BD 公司。

1.2 組織收集

收集2020 年1 月—2022 月12 月西安交通大學附屬三二O 一醫(yī)院進行外科手術(shù)切除的50 例胃癌組織標本和健康癌旁組織，包括36 例男性和14 例女性，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療、靶向治療或其他抗癌治療。組織保存于液氮中備測。本研究經(jīng)西安交通大學附屬三二O 一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批號IRB20200017），患者均知情同意。

1.3 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

人胃癌細胞系SGC7901、MGC803 和正常胃黏膜上皮GES-1、AGS 細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每3 天更換1 次培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

將細胞分為空白組、轉(zhuǎn)染錯義序列siRNA 組、miR-155-5p 模擬物組、miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制物組。

1.4 qRT-PCR 法檢測細胞系和組織中miR-155-5p水平

根據(jù)操作說明，使用TRIzol 法提取組織標本和細胞系的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，并以此為模板進行實時熒光定量PCR 檢測靶基因的表達。使用靶基因Ct值法對基因相對表達進行定量。使用U6 作為內(nèi)參分析miR-155-5p 的表達。miR-155-5p 引物序列為5’-TTAATGCTAATCGTGA TAGGGGT-3’，U6 引物序列為5’-CTCGCTTCGGC AGCACATATACT-3’。

分別用miR-155-5p 模擬物轉(zhuǎn)染SGC7901、MGC803、GES-1、AGS 細胞，然后使用qRT-PCR篩選miR-155-5p 相對表達水平最高的細胞系進行后續(xù)實驗。并用不同濃度（25、50、100、200 μmol/L）氧化苦參堿干預轉(zhuǎn)染 miR-155-5p 模擬物的MGC803 細胞，在孵育24 h 后利用qRT-PCR 篩選出最佳氧化苦參堿干預濃度。

1.5 MTT 法測定檢測miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響

根據(jù)LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明，分別將轉(zhuǎn)染錯義序列siRNA、miR-155-5p 模擬物、miR-155-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染MGC803 細胞。氧化苦參堿＋miR-155-5p 模擬物組細胞為轉(zhuǎn)染miR-155-5p 模擬物的MGC803 細胞與氧化苦參堿孵育24 h 后進行測定。將空白組、轉(zhuǎn)染錯義序列siRNA 組、miR-155-5p 模擬物組、miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制物組生長良好的細胞接種到96 孔板（3 000 個細胞/孔）中。將0.1 mg/mL MTT 試劑加入到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后向細胞中加入DMSO（150 μL/孔），搖震10 min后，使用酶標儀測量490 nm 處吸光度（A）值，并計算細胞抑制率。

1.6 細胞集落形成實驗測定miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響

將空白組、錯義序列組、miR-155-5p 模擬物組、miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制物組的細胞接種在100 mm 培養(yǎng)皿（2 000 個細胞/皿）中，給藥同1.5 項下。每3天更換1 次培養(yǎng)基，并使細胞生長12 d 以形成菌落。細胞集落通過4%多聚甲醛固定，后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，計數(shù)細胞數(shù)＞50 的集落。

1.7 流式細胞法檢測miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞凋亡的影響

收集各組細胞并在4 ℃下使用PBS 漂洗2 遍。根據(jù)Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒操作說明，將各組細胞懸浮在100 μL Annexin V 緩沖液中，并將加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶染色液到細胞懸液中。在室溫下于黑暗中孵育20 min，然后使用FACSCanto 流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.8 Transwell 實驗檢測miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞遷移和侵襲作用的影響

在8 μm 濾膜孔的Transwell 小室中測量細胞侵襲作用。侵襲作用檢測：Transwell 過程按照操作說明進行，在包含Matrigel 基質(zhì)膠的Transwell 上室添加200 μL 細胞，上室和下室中分別加入200 μL無血清培養(yǎng)基和600 μL 20% FBS 的培養(yǎng)基并在37 ℃下孵育24 h。用PBS 洗滌后，用4%多聚甲醛固定1 h，并用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min。沖洗掉多余的染料，并在400倍的顯微鏡下隨機選擇5～10 個區(qū)域?qū)毎M行拍照。遷移實驗時不添加Matrigel 基質(zhì)膠。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測Claudin 1、c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Caspase-3 蛋白的表達

收集各組細胞，分別提取總蛋白質(zhì)，并用BCA法測定蛋白水平。其中蛋白質(zhì)樣品（20 μg）通過8%SDS-PAGE 分離，后恒流轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。再在室溫用5%脫脂牛奶封封閉條帶3 h，之后分別加入Claudin 1 抗體（1∶1 000）、Caspase-3 抗體（1∶1 000）、Bcl-2 抗體（1∶1 000）、c-Myc 抗體（1∶1 000）和GAPDH（1∶1000）在4 ℃下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h。以GAPDH 灰度值為內(nèi)參，用Image J 軟件對不同蛋白的相對表達量進行定量分析。

1.10 統(tǒng)計學分析

研究數(shù)據(jù)使用SPSS 22 軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用進行，多組間差異使用ANOVA方差分析進行，兩兩比較使用SNK 法。

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p 在胃癌組織和細胞中的表達情況

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與癌旁組織和胃黏膜細胞（GES-1 和AGS 細胞）相比，在胃癌組織和胃癌細胞系MGC803 中miR-155-5p 相對表達量顯著升高（P＜0.001），見圖1A、B。由于MGC803 細胞中miR-155-5p 相對表達量最高，因此后續(xù)研究使用此細胞進行。不同濃度氧化苦參堿與轉(zhuǎn)染miR-155-5p模擬物的MGC803 細胞培養(yǎng)24 h 后，miR-155-5p的表達隨著氧化苦參堿劑量增加而降低（P＜0.05、0.01、0.001），見圖1C。經(jīng)預實驗，氧化苦參堿干預MGC803 細胞的最佳濃度為100 μmol/L，此濃度下細胞抑制率為（47.34±2.44）%。

圖1 miR-155-5p 在胃癌組織、癌旁組織和不同細胞系中的表達差異（，n =3）Fig.1 miR-155-5p Expression differences in gastric cancer tissues,paracancer tissues,and different cell lines (,n =3)

2.2 氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響

MTT 實驗表明，與空白組、轉(zhuǎn)染錯義序列siRNA 組相比，miR-155-5p 模擬物的轉(zhuǎn)染后MGC803 細胞活力顯著增加（P＜0.05）；而miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組均可顯著抑制胃癌細胞和轉(zhuǎn)染miR-155-5p 模擬物細胞活力（P＜0.01、0.001），見圖2A。

圖2 氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響Fig.2 Effect of oxymatrine on proliferation of gastric cancer cells

細胞集落形成實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p 模擬物轉(zhuǎn)染后MGC803 細胞集落生成增加，而miR-155-5p抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組處理后的胃癌細胞與miR-155-5p 模擬物的轉(zhuǎn)染后MGC803 細胞相比，集落顯著被抑制，見圖2B。

2.3 氧化苦參堿對胃癌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染錯義序列siRNA 組相比，miR-155-5p 模擬組胃癌細胞凋亡率降低（P＜0.01），而miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組可顯著增加胃癌細胞凋亡比例，同樣可以增加轉(zhuǎn)染miR-155-5p-模擬物的胃癌細胞凋亡（P＜0.01、0.001），見圖3。

圖3 氧化苦參堿對胃癌細胞的凋亡作用Fig.3 Effect of oxymatrine on apoptosis of gastric cancer cells

2.4 氧化苦參堿對胃癌細胞遷移和侵襲的影響

Transwell 實驗結(jié)果顯示，與空白組、轉(zhuǎn)染錯義序列siRNA 組相比，miR-155-5p-模擬物組的細胞遷移和侵襲細胞數(shù)顯著增加（P＜0.001），而miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組細胞遷移和侵襲細胞數(shù)量降低（P＜0.001），見圖4。

圖4 Transwell 法檢測氧化苦參堿對MGC803 細胞的遷移和侵襲的影響（×400）Fig.4 Effects of oxymatrine on migration and invasion of MGC803 cells by Transwell assay (×400)

2.5 氧化苦參堿對miR-155-5p 靶基因和細胞周期蛋白表達的影響

使用蛋白質(zhì)印跡法檢測分析顯示，與空白組、錯義序列組相比，miR-155-5p 模擬組的Claudin 1、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2 相對表達量增加，而Caspase-3 相對表達量降低（P＜0.01、0.001）。miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組和氧化苦參堿＋miR-155-5p 模擬組的Claudin 1、c-Myc、Cyclin D1和Bcl-2 表達較miR-155-5p 模擬組下降，Caspase-3 表達增加（P＜0.001），見圖5。

圖5 氧化苦參堿對MGC803 細胞中miR-155-5p 靶基因蛋白的表達Fig.5 Expression of miR-155-5p target gene protein in MGC803 cells induced by oxymatrine

3 討論

胃癌是一種發(fā)病機制相對復雜的惡性腫瘤，其中遺傳因素涉及原癌基因激活、抑癌基因失活，以及相關(guān)信號通路的異常調(diào)節(jié)等多個方面[3]。對胃癌進展的機制研究有利于闡明其發(fā)病原因，并對開發(fā)更有效的新藥以提高療效具有重要意義。氧化苦參堿是一種多靶點抗腫瘤藥物，越來越多的研究已經(jīng)表明了其在不同腫瘤類型中的抗腫瘤作用[5,14-15]。目前已經(jīng)在體內(nèi)和體外研究中均證實了氧化苦參堿可抑制胃癌細胞生長、降低細胞的存活率、誘導胃癌細胞的凋亡[7-8]。近年來研究表明，苦參堿衍生物可在肝細胞癌中通過磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路抑制細胞生長，促進細胞凋亡[16]。還可通過Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/βcatenin）信號通路增加肺癌細胞的放療敏感性[17]。然而，氧化苦參堿能否直接抑制胃癌中的miR-155-5p 的表達仍未知。

人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近3 000 種miRNA，根據(jù)推測miRNA 可能調(diào)節(jié)人類一半以上的基因表達。在過去的幾十年里，miRNA 在癌癥生物學中的作用得到了廣泛的研究。一些miRNA 參與腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，而一些miRNA 則與癌癥患者的預后密切相關(guān)，因此miRNA 已經(jīng)成為腫瘤診斷和干預靶點的研究熱點[18]。本研究中探討了氧化苦參堿通過調(diào)節(jié)胃癌中的miR-155-5p 表達水平，干預胃癌細胞的生物學行為作用。通過比較miR-155-5p 在胃癌組織和癌旁組織、胃癌細胞系和正常胃黏膜細胞系中表達可見，胃癌細胞中miR-155-5p 表達顯著升高，這與既往研究類似[19]。本研究選用了胃癌細胞系中miR-155-5p 表達最高的MGC803 細胞進行了后續(xù)研究。

加速細胞周期進程是大多數(shù)實體瘤的共同特征。為了證明miR-155-5p 過表達可以加速細胞周期，本研究分析過表達或抑制miR-155-5p 表達對胃癌細胞影響可見，miR-155-5p 過表達可促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡。根據(jù)文獻報道，miR-155-5p 可能在胃癌細胞中作為腫瘤啟動子起作用[19]。而使用氧化苦參堿干預后發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可降低胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。此外氧化苦參堿可以降低miR-155-5p 模擬物對胃癌細胞的惡性生物學行為。

參考相關(guān)文獻后，本研究選擇了miR-155-5p 3個候選靶基因，即Claudin 1、Caspase-3、c-Myc。Claudin 1 是細胞緊密連接的重要組成部分，在許多不同的腫瘤中異常表達。在肝細胞癌中，角蛋白8和角蛋白18 的缺失通過上調(diào)Claudin 2 表達促進HepG1 細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。c-Myc 作為轉(zhuǎn)錄因子，在控制細胞生長、活力、凋亡和細胞轉(zhuǎn)化中起著重要的作用[21]。此外，細胞周期蛋白D1 在癌癥發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其上調(diào)表達驅(qū)動不受控制的細胞增殖[22]。在本研究結(jié)果中，與空白組相比，miR-155-5p 模擬物組中Claudin、cyclin D、c-Myc 的表達水平上調(diào)，表明miR-155-5p 在細胞周期的啟動和進展中起重要作用。當c-Myc 表達受到抑制時，細胞生長受阻，細胞在細胞周期的G0/G1期積累，導致細胞凋亡加速。細胞凋亡是一個平衡細胞存活和死亡的穩(wěn)態(tài)過程[23]。Caspase-3 的激活是細胞凋亡的關(guān)鍵過程，Caspase-3 活性增加被認為是細胞凋亡的標志物。Bcl-2 參與凋亡途徑，在控制細胞凋亡和增強細胞存活率方面具有一定意義[23]。本研究表明，氧化苦參堿可通過miR-155-5p 調(diào)節(jié)可抑制c-Myc、Caspase-3、Bcl-2 表達促進細胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了胃癌細胞中miR-155-5p 中過度表達，氧化苦參堿可能通過miR-155-5p分子靶點發(fā)揮抗腫瘤作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突