王斐斐，李煒，賀禮琴，白昌儒，董明清，王娟毅*

1.西安交通大學附屬三二〇一醫(yī)院 腫瘤內科，陜西 漢中 723000

2.空軍軍醫(yī)大學 基礎醫(yī)學院，陜西 西安 710032

胃癌是我國發(fā)病率第5 位的腫瘤，也是導致腫瘤相關死亡的第3 大原因[1]。超過90%的胃癌患者在診斷時已出現遠處轉移[2]。放療、化療、靶向治療是出現轉移胃癌的主要治療方法，但化療藥物特異性較低，且不良反應明顯[3-4]。因此，尋找更為安全高效的治療藥物具有重要意義。

氧化苦參堿是從苦參干燥根、果實中提取的一種醌類生物堿，是苦參堿的主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[5-6]。研究表明，氧化苦參堿是一種天然抗癌藥物，能夠顯著抑制癌細胞增殖、影響多種惡性腫瘤的發(fā)生和進展[6]。已證實，氧化苦參堿可對胃癌BGC-823 細胞及胃癌HGC-27細胞裸鼠移植瘤模型發(fā)揮抑制生長作用[7-8]。課題組組前期也報道了苦參堿可通過血管內皮生長因子-C（VEGF-C）/血管內皮生長因子受體3（VEGFR3）和核因子-κB（NF-κB）/Toll 樣受體4（TLR4）信號通路保護大鼠的胃黏膜損傷[9]。最近研究表明，氧化苦參堿可以通過調節(jié)microRNA（miRNA）的表達來發(fā)揮其抗腫瘤作用[10-11]。miRNA 是內源性單鏈非編碼RNA，與靶miRNA 的3 個非翻譯區(qū)域結合，可以在轉錄后水平調節(jié)基因表達。研究表明，miR-155-5p 在肝癌、食管癌等消化系統腫瘤中高度表達，并且與預后不良相關[12-13]。然而，目前尚不清楚miR-155-5p 是否在胃癌中過度表達，以及氧化苦參堿是否可通過調節(jié)miR-155-5p 在胃癌中的表達以抑制腫瘤進展?；诖?，本研究探討了氧化苦參堿對胃癌細胞中miR-155-5p 表達、胃癌細胞生物學行為及miR-155-5p 靶基因對封閉蛋白1（Claudin 1）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和c-Myc 表達的影響，為胃癌治療的新藥物研發(fā)和新靶點的確立提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人胃癌細胞系SGC7901、MGC803 和正常胃黏膜GES-1、AGS 細胞系購自中國科學院上海細胞庫。錯義序列siRNA、miR-155-5p-模擬物和miR-155-5p-抑制劑由寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司合成。RNA 分子序列如下：miR-155-5p 模擬物，5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’，miR-155-5p 抑制劑，5’-ACCCCUAUCACAUUAGCAUU AA-3’,錯義序列 siRNA，5’-CCCUAUCACAAUUA GCAUUAAUU-3’。氧化苦參堿購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號A111285，純度為分析標準品。

MTT 和0.1%結晶紫溶液染色購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司。Claudin 1 抗體（貨號ab211737）、c-Myc 抗體（貨號ab32072）、Cyclin D1 抗體（貨號ab16663）、抗B 細胞淋巴瘤/白血病基因2（Bcl-2）抗體（貨號ab203516）、抗胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體（貨號ab184787）購自Abcam 公司。ECL 試劑盒和Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購自美國Becton Dickinson 公司。4%多聚甲醛購自廣州碩譜生物科技有限公司。LipofectAMINE 2000 轉染試劑、Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司，Transwell 小室、Matrigel 基質膠購自美國Corning公司。

Image-Pro Plus 數碼醫(yī)學圖像分析系統購自北京麥克奧迪儀器儀表公司，CKX53 光學顯微鏡購自日本Olympus 公司，FACSCanto 流式細胞儀購自買美國BD 公司。

1.2 組織收集

收集2020 年1 月—2022 月12 月西安交通大學附屬三二O 一醫(yī)院進行外科手術切除的50 例胃癌組織標本和健康癌旁組織，包括36 例男性和14 例女性，所有患者術前均未接受放療、化療、靶向治療或其他抗癌治療。組織保存于液氮中備測。本研究經西安交通大學附屬三二O 一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批號IRB20200017），患者均知情同意。

1.3 細胞培養(yǎng)、轉染和分組

人胃癌細胞系SGC7901、MGC803 和正常胃黏膜上皮GES-1、AGS 細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每3 天更換1 次培養(yǎng)液，取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

將細胞分為空白組、轉染錯義序列siRNA 組、miR-155-5p 模擬物組、miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制物組。

1.4 qRT-PCR 法檢測細胞系和組織中miR-155-5p水平

根據操作說明，使用TRIzol 法提取組織標本和細胞系的總RNA，使用反轉錄試劑盒生成cDNA，并以此為模板進行實時熒光定量PCR 檢測靶基因的表達。使用靶基因Ct值法對基因相對表達進行定量。使用U6 作為內參分析miR-155-5p 的表達。miR-155-5p 引物序列為5’-TTAATGCTAATCGTGA TAGGGGT-3’，U6 引物序列為5’-CTCGCTTCGGC AGCACATATACT-3’。

分別用miR-155-5p 模擬物轉染SGC7901、MGC803、GES-1、AGS 細胞，然后使用qRT-PCR篩選miR-155-5p 相對表達水平最高的細胞系進行后續(xù)實驗。并用不同濃度（25、50、100、200 μmol/L）氧化苦參堿干預轉染 miR-155-5p 模擬物的MGC803 細胞，在孵育24 h 后利用qRT-PCR 篩選出最佳氧化苦參堿干預濃度。

1.5 MTT 法測定檢測miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響

根據LipofectAMINE 2000 轉染試劑說明，分別將轉染錯義序列siRNA、miR-155-5p 模擬物、miR-155-5p 抑制劑轉染MGC803 細胞。氧化苦參堿＋miR-155-5p 模擬物組細胞為轉染miR-155-5p 模擬物的MGC803 細胞與氧化苦參堿孵育24 h 后進行測定。將空白組、轉染錯義序列siRNA 組、miR-155-5p 模擬物組、miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制物組生長良好的細胞接種到96 孔板（3 000 個細胞/孔）中。將0.1 mg/mL MTT 試劑加入到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后向細胞中加入DMSO（150 μL/孔），搖震10 min后，使用酶標儀測量490 nm 處吸光度（A）值，并計算細胞抑制率。

1.6 細胞集落形成實驗測定miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響

將空白組、錯義序列組、miR-155-5p 模擬物組、miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制物組的細胞接種在100 mm 培養(yǎng)皿（2 000 個細胞/皿）中，給藥同1.5 項下。每3天更換1 次培養(yǎng)基，并使細胞生長12 d 以形成菌落。細胞集落通過4%多聚甲醛固定，后用0.1%結晶紫溶液染色，計數細胞數＞50 的集落。

1.7 流式細胞法檢測miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞凋亡的影響

收集各組細胞并在4 ℃下使用PBS 漂洗2 遍。根據Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒操作說明，將各組細胞懸浮在100 μL Annexin V 緩沖液中，并將加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶染色液到細胞懸液中。在室溫下于黑暗中孵育20 min，然后使用FACSCanto 流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.8 Transwell 實驗檢測miR-155-5p 和氧化苦參堿對胃癌細胞遷移和侵襲作用的影響

在8 μm 濾膜孔的Transwell 小室中測量細胞侵襲作用。侵襲作用檢測：Transwell 過程按照操作說明進行，在包含Matrigel 基質膠的Transwell 上室添加200 μL 細胞，上室和下室中分別加入200 μL無血清培養(yǎng)基和600 μL 20% FBS 的培養(yǎng)基并在37 ℃下孵育24 h。用PBS 洗滌后，用4%多聚甲醛固定1 h，并用0.1%結晶紫溶液染色15 min。沖洗掉多余的染料，并在400倍的顯微鏡下隨機選擇5～10 個區(qū)域對細胞進行拍照。遷移實驗時不添加Matrigel 基質膠。

1.9 蛋白質印跡法檢測Claudin 1、c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Caspase-3 蛋白的表達

收集各組細胞，分別提取總蛋白質，并用BCA法測定蛋白水平。其中蛋白質樣品（20 μg）通過8%SDS-PAGE 分離，后恒流轉至PVDF 膜上。再在室溫用5%脫脂牛奶封封閉條帶3 h，之后分別加入Claudin 1 抗體（1∶1 000）、Caspase-3 抗體（1∶1 000）、Bcl-2 抗體（1∶1 000）、c-Myc 抗體（1∶1 000）和GAPDH（1∶1000）在4 ℃下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯的二抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h。以GAPDH 灰度值為內參，用Image J 軟件對不同蛋白的相對表達量進行定量分析。

1.10 統計學分析

研究數據使用SPSS 22 軟件進行統計分析。計量數據采用進行，多組間差異使用ANOVA方差分析進行，兩兩比較使用SNK 法。

2 結果

2.1 miR-155-5p 在胃癌組織和細胞中的表達情況

qRT-PCR 結果顯示，與癌旁組織和胃黏膜細胞（GES-1 和AGS 細胞）相比，在胃癌組織和胃癌細胞系MGC803 中miR-155-5p 相對表達量顯著升高（P＜0.001），見圖1A、B。由于MGC803 細胞中miR-155-5p 相對表達量最高，因此后續(xù)研究使用此細胞進行。不同濃度氧化苦參堿與轉染miR-155-5p模擬物的MGC803 細胞培養(yǎng)24 h 后，miR-155-5p的表達隨著氧化苦參堿劑量增加而降低（P＜0.05、0.01、0.001），見圖1C。經預實驗，氧化苦參堿干預MGC803 細胞的最佳濃度為100 μmol/L，此濃度下細胞抑制率為（47.34±2.44）%。

圖1 miR-155-5p 在胃癌組織、癌旁組織和不同細胞系中的表達差異（，n =3）Fig.1 miR-155-5p Expression differences in gastric cancer tissues,paracancer tissues,and different cell lines (,n =3)

2.2 氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響

MTT 實驗表明，與空白組、轉染錯義序列siRNA 組相比，miR-155-5p 模擬物的轉染后MGC803 細胞活力顯著增加（P＜0.05）；而miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組均可顯著抑制胃癌細胞和轉染miR-155-5p 模擬物細胞活力（P＜0.01、0.001），見圖2A。

圖2 氧化苦參堿對胃癌細胞增殖的影響Fig.2 Effect of oxymatrine on proliferation of gastric cancer cells

細胞集落形成實驗中發(fā)現，miR-155-5p 模擬物轉染后MGC803 細胞集落生成增加，而miR-155-5p抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組處理后的胃癌細胞與miR-155-5p 模擬物的轉染后MGC803 細胞相比，集落顯著被抑制，見圖2B。

2.3 氧化苦參堿對胃癌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，與轉染錯義序列siRNA 組相比，miR-155-5p 模擬組胃癌細胞凋亡率降低（P＜0.01），而miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組可顯著增加胃癌細胞凋亡比例，同樣可以增加轉染miR-155-5p-模擬物的胃癌細胞凋亡（P＜0.01、0.001），見圖3。

圖3 氧化苦參堿對胃癌細胞的凋亡作用Fig.3 Effect of oxymatrine on apoptosis of gastric cancer cells

2.4 氧化苦參堿對胃癌細胞遷移和侵襲的影響

Transwell 實驗結果顯示，與空白組、轉染錯義序列siRNA 組相比，miR-155-5p-模擬物組的細胞遷移和侵襲細胞數顯著增加（P＜0.001），而miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組、氧化苦參堿＋miR-155-5p 抑制劑組細胞遷移和侵襲細胞數量降低（P＜0.001），見圖4。

圖4 Transwell 法檢測氧化苦參堿對MGC803 細胞的遷移和侵襲的影響（×400）Fig.4 Effects of oxymatrine on migration and invasion of MGC803 cells by Transwell assay (×400)

2.5 氧化苦參堿對miR-155-5p 靶基因和細胞周期蛋白表達的影響

使用蛋白質印跡法檢測分析顯示，與空白組、錯義序列組相比，miR-155-5p 模擬組的Claudin 1、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2 相對表達量增加，而Caspase-3 相對表達量降低（P＜0.01、0.001）。miR-155-5p 抑制劑組、氧化苦參堿組和氧化苦參堿＋miR-155-5p 模擬組的Claudin 1、c-Myc、Cyclin D1和Bcl-2 表達較miR-155-5p 模擬組下降，Caspase-3 表達增加（P＜0.001），見圖5。

圖5 氧化苦參堿對MGC803 細胞中miR-155-5p 靶基因蛋白的表達Fig.5 Expression of miR-155-5p target gene protein in MGC803 cells induced by oxymatrine

3 討論

胃癌是一種發(fā)病機制相對復雜的惡性腫瘤，其中遺傳因素涉及原癌基因激活、抑癌基因失活，以及相關信號通路的異常調節(jié)等多個方面[3]。對胃癌進展的機制研究有利于闡明其發(fā)病原因，并對開發(fā)更有效的新藥以提高療效具有重要意義。氧化苦參堿是一種多靶點抗腫瘤藥物，越來越多的研究已經表明了其在不同腫瘤類型中的抗腫瘤作用[5,14-15]。目前已經在體內和體外研究中均證實了氧化苦參堿可抑制胃癌細胞生長、降低細胞的存活率、誘導胃癌細胞的凋亡[7-8]。近年來研究表明，苦參堿衍生物可在肝細胞癌中通過磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路抑制細胞生長，促進細胞凋亡[16]。還可通過Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/βcatenin）信號通路增加肺癌細胞的放療敏感性[17]。然而，氧化苦參堿能否直接抑制胃癌中的miR-155-5p 的表達仍未知。

人類已經發(fā)現了近3 000 種miRNA，根據推測miRNA 可能調節(jié)人類一半以上的基因表達。在過去的幾十年里，miRNA 在癌癥生物學中的作用得到了廣泛的研究。一些miRNA 參與腫瘤細胞侵襲和轉移，而一些miRNA 則與癌癥患者的預后密切相關，因此miRNA 已經成為腫瘤診斷和干預靶點的研究熱點[18]。本研究中探討了氧化苦參堿通過調節(jié)胃癌中的miR-155-5p 表達水平，干預胃癌細胞的生物學行為作用。通過比較miR-155-5p 在胃癌組織和癌旁組織、胃癌細胞系和正常胃黏膜細胞系中表達可見，胃癌細胞中miR-155-5p 表達顯著升高，這與既往研究類似[19]。本研究選用了胃癌細胞系中miR-155-5p 表達最高的MGC803 細胞進行了后續(xù)研究。

加速細胞周期進程是大多數實體瘤的共同特征。為了證明miR-155-5p 過表達可以加速細胞周期，本研究分析過表達或抑制miR-155-5p 表達對胃癌細胞影響可見，miR-155-5p 過表達可促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡。根據文獻報道，miR-155-5p 可能在胃癌細胞中作為腫瘤啟動子起作用[19]。而使用氧化苦參堿干預后發(fā)現，氧化苦參堿可降低胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。此外氧化苦參堿可以降低miR-155-5p 模擬物對胃癌細胞的惡性生物學行為。

參考相關文獻后，本研究選擇了miR-155-5p 3個候選靶基因，即Claudin 1、Caspase-3、c-Myc。Claudin 1 是細胞緊密連接的重要組成部分，在許多不同的腫瘤中異常表達。在肝細胞癌中，角蛋白8和角蛋白18 的缺失通過上調Claudin 2 表達促進HepG1 細胞的增殖、侵襲和轉移[20]。c-Myc 作為轉錄因子，在控制細胞生長、活力、凋亡和細胞轉化中起著重要的作用[21]。此外，細胞周期蛋白D1 在癌癥發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用，其上調表達驅動不受控制的細胞增殖[22]。在本研究結果中，與空白組相比，miR-155-5p 模擬物組中Claudin、cyclin D、c-Myc 的表達水平上調，表明miR-155-5p 在細胞周期的啟動和進展中起重要作用。當c-Myc 表達受到抑制時，細胞生長受阻，細胞在細胞周期的G0/G1期積累，導致細胞凋亡加速。細胞凋亡是一個平衡細胞存活和死亡的穩(wěn)態(tài)過程[23]。Caspase-3 的激活是細胞凋亡的關鍵過程，Caspase-3 活性增加被認為是細胞凋亡的標志物。Bcl-2 參與凋亡途徑，在控制細胞凋亡和增強細胞存活率方面具有一定意義[23]。本研究表明，氧化苦參堿可通過miR-155-5p 調節(jié)可抑制c-Myc、Caspase-3、Bcl-2 表達促進細胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現了胃癌細胞中miR-155-5p 中過度表達，氧化苦參堿可能通過miR-155-5p分子靶點發(fā)揮抗腫瘤作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突