艾雅娜，張海娟，廖紅梅

（江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無(wú)錫 214122）

顏色是決定消費(fèi)者對(duì)食品接受程度的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)之一。對(duì)合成色素安全性的擔(dān)憂(yōu)導(dǎo)致越來(lái)越多的消費(fèi)者傾向于使用花青素、甜菜紅素、姜黃素、胡蘿卜素和葉綠素[1-5]等天然色素來(lái)替代之。目前，我國(guó)食用色素年產(chǎn)量約28 000 t，其中天然色素的產(chǎn)量約為25 000 t[6]。天然食用色素的使用量呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，市場(chǎng)需求增長(zhǎng)率一直保持在10%以上[7]。可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)天然食用色素成為食品工業(yè)的重要領(lǐng)域之一。

甜菜紅素是水溶性含氮色素，基本發(fā)色基團(tuán)是1，7-二偶氮庚甲堿[8]。其來(lái)源包括甜菜根、莧菜和紅肉火龍果[9]。然而，甜菜紅素易受熱、氧、光、pH 值、水活度、金屬離子和酶等的影響[9]，這限制了其在食品加工中的應(yīng)用。紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）是一種仙人掌科量天尺屬的熱帶/亞熱帶水果[8]，其紅紫色源于甜菜紅素。朱文嫻等[10]報(bào)道了4 個(gè)產(chǎn)地的紅肉火龍果肉中甜菜紅素含量為15.76～28.94 mg/100 g。Stinzing 等[11]的研究表明紅肉火龍果中甜菜紅素不僅可用作食用色素，還具有抗氧化和清除自由基等生物活性。此外，紅肉火龍果的果皮約占果實(shí)質(zhì)量18～24%[12]，通常被丟棄；然而，其果皮含150.46 mg/100 g（干重）甜菜紅素[13]。對(duì)果皮中甜菜紅素提取、純化，可充分利用植物資源，同時(shí)可減少環(huán)境污染源。

本文首先優(yōu)化紅肉火龍果果皮中甜菜紅素的提取條件，然后，分析果皮中甜菜紅素的結(jié)構(gòu)，最后評(píng)價(jià)金屬離子Cu2+和Fe2+對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響，以期為火龍果源甜菜紅素在食品加工中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）購(gòu)自本地歐尚超市；HCl、氫氧化鈉、氯化亞鐵、乙醇等，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸銅，購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司；AB-8 大孔吸附樹(shù)脂，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SRQ-7316 型破壁料理機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司；UV-1800 型紫外分光光度計(jì)，島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；DC801 型真空冷凍干燥機(jī)，大和科學(xué)株式會(huì)社；SQP 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5804 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；cs-820N 型色度計(jì)，杭州彩普科技有限公司；MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)沃特世公司；HL-2S 恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；RV 8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司。

1.3 甜菜紅素的提取優(yōu)化

收集紅肉火龍果果汁和果切加工中去除的果皮，去除鱗片，清洗風(fēng)干，切塊打漿制得果皮漿，待用。分別探究浸提液、料液比、浸提液pH 值、提取溫度和時(shí)間對(duì)提取紅肉火龍果果皮中甜菜紅素得率的影響。浸提液設(shè)置為：蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇；料液比設(shè)置為：1∶3，1∶4，1 ∶5，1 ∶6，1 ∶7；浸提液pH 值設(shè)置為：3.0，4.0，5.0，6.0，7.0；提取溫度設(shè)置為：30，45，60，75，90℃；提取時(shí)間設(shè)置為：15，30，45，60，75 min。探究一個(gè)因素變化對(duì)甜菜紅素得率影響時(shí)，其它因素設(shè)置為：蒸餾水提取，料液比1∶5，浸提液pH 4.0，提取溫度30 ℃，提取時(shí)間60 min。每組試驗(yàn)稱(chēng)取50.00 g 的紅肉火龍果果皮漿，提取液于4 ℃、8 000×g 離心15 min 獲得。

甜菜紅素得率[14]定義為單位質(zhì)量火龍果皮提取得到的甜菜紅素質(zhì)量（mg/100 g），由公式（1）和（2）計(jì)算[8，14]：

式中：C——提取液中甜菜紅素的質(zhì)量濃度，mg/100 mL；A——538 nm 下的吸光值；Mw——分子質(zhì)量（550 g/mol）；DF——稀釋倍數(shù)；ε——摩爾消光系數(shù)（65 000）；L——路徑長(zhǎng)度（1 cm）；Y——甜菜紅素的得率，mg/100 g；V——提取液體積，mL；M——火龍果皮質(zhì)量，g。

1.4 甜菜紅素的純化

按照如下流程純化果皮甜菜紅素：提取液通過(guò)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂柱充分吸附，先用蒸餾水洗脫，去除水溶性雜質(zhì)（果膠、糖等），再用60%乙醇溶液洗脫，得到甜菜紅素洗脫液。將洗脫液旋蒸濃縮（溫度40 ℃）并冷凍干燥，得到甜菜紅素提取物（粉末）。將制備的甜菜紅素提取物避光保存于-20 ℃。

1.5 甜菜紅素含量及結(jié)構(gòu)分析

將500 mg 甜菜紅素提取物溶解于100 mL 水中，在黑暗中放置30 min 后，測(cè)定溶液在538 nm處的吸光度。提取物中甜菜紅素含量由公式（3）計(jì)算[12]：

式中：A——樣品538 nm 下的吸光值；Mw——分子質(zhì)量（550 g/mol）；DF——稀釋倍數(shù)；V——溶液體積，mL；ε——摩爾消光系數(shù)（65 000）；L——路徑長(zhǎng)度（1 cm）；M——提取物質(zhì)量，g。

采用UPLC-MS 分析甜菜紅素單體，方法如下[8]：將甜菜紅素溶解于水中，質(zhì)量濃度為5 mg/mL。在4 ℃下10 000×g 離心15 min，收集上清液用于測(cè)試。具體檢測(cè)條件為：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；DAD 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為535 nm；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃；梯度洗脫，洗脫時(shí)間10 min。MS 條件參數(shù)為：ESI+離子掃描，m/z：20～1 000；脫溶劑溫度：400 ℃，脫溶劑氣體流量為700 L/h；碰撞能量25 eV，錐電壓30 V，霧化器壓力50 psi，毛細(xì)管電壓3 500 V。

1.6 金屬離子對(duì)甜菜紅素顏色穩(wěn)定性的影響

配制CuSO4和FeCl2溶液使之在甜菜紅素溶液（50 mg/L）中含量為0.00，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 mg/mL，室溫避光，于0，2，4，6，8，10，24 h 時(shí)在538 nm 處測(cè)定吸光值，拍攝記錄甜菜紅素溶液的顏色并采用色度計(jì)測(cè)定顏色值：L*、a*和b*值。ΔE 值根據(jù)下列公式（4）計(jì)算：

式 中，L*0、a*0和b*0值表示0 h 溶液的亮度值、紅綠值和黃藍(lán)值，L*、a*和b*值表示2，4，6，8，10，24 h 溶液的亮度值、紅綠值和黃藍(lán)值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，使用SPSS 23.0 進(jìn)行方差分析（ANOVA），采用Duncan 檢驗(yàn)，顯著性水平為P=0.05。所有圖使用Origin 9.0 繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜菜紅素的提取優(yōu)化

從圖1a 可知，浸提液中水和乙醇的比例顯著影響甜菜紅素的得率。蒸餾水提取得到了最高的甜菜紅素得率，隨著乙醇濃度的增加，甜菜紅素的得率顯著降低（P＜0.05）。甜菜紅素得率降低可能由于其結(jié)構(gòu)中有親水性的羧基和羥基，形成氫鍵，使其更易溶解在水中[16]。因此，選擇蒸餾水為提取溶劑。

料液比對(duì)甜菜紅素得率的影響如圖1b 所示。隨著料液比的增加，甜菜紅素的得率也隨著增大，料液比為1∶5 和1∶6 時(shí)，提取量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），料液比增加至1∶7，得率下降。這可能是由于料液比增加使果皮漿與溶劑接觸的面積增大，促進(jìn)自由擴(kuò)散，但料液比達(dá)到一定程度時(shí)，甜菜紅素接近全部溶出，增加料液比會(huì)降低甜菜紅素的濃度[17]。從生產(chǎn)成本以及后續(xù)處理考慮，選擇料液比為1∶5。

浸提液pH 值對(duì)甜菜紅素得率的影響如圖1c所示。隨著pH 值的增加，甜菜紅素得率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，pH 值為5 時(shí)，得率最高且與其它pH 值下的得率差異性顯著（P＜0.05）。這可能與甜菜紅素在不同pH 值下的穩(wěn)定性有關(guān)，Stinzing等[11]研究表明，在pH 值為5.0 時(shí)，火龍果中甜菜素的顏色穩(wěn)定性最好。因此選擇浸提液pH 值為5。

提取溫度對(duì)甜菜紅素得率的影響如圖1d 所示。30 ℃下甜菜紅素的得率最大，但與45 ℃下無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。隨著溫度的進(jìn)一步升高，得率顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果表明，甜菜紅素的熱穩(wěn)定性較差，較高的溫度導(dǎo)致其熱降解[18]。考慮到生產(chǎn)過(guò)程中的能源負(fù)擔(dān)，選擇提取溫度為30 ℃。

提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素得率的影響如圖1e 所示。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，甜菜紅素的得率增大。在提取時(shí)間為60 min 時(shí)，甜菜紅素的得率達(dá)到了最大值。超過(guò)60 min，得率開(kāi)始下降，可能是長(zhǎng)時(shí)間的提取，甜菜紅素降解[19]。因此選擇提取時(shí)間為60 min。

經(jīng)純化工藝流程獲得甜菜紅素提取物，提取物中甜菜紅素的含量為95.2 mg/g，遠(yuǎn)高于Cai等[20]報(bào)道的莧屬植物提取物中14～47 mg/g 的甜菜紅素含量。結(jié)果表明，紅肉火龍果果皮廢棄物可作為甜菜紅素的良好來(lái)源。

2.2 甜菜紅素的鑒定

通過(guò)UPLC-MS 對(duì)提取物中甜菜紅素單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，如圖2 所示，根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)譜圖等和已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比較[8，16，21-23]，分析出純化后的甜菜紅素提取物中具有6 種的單體結(jié)構(gòu)（表1）。Fathordoobady 等[16]用溶劑和超臨界流體法提取紅肉火龍果果皮中的甜菜紅素，純化后分別檢測(cè)到6 和8 種甜菜紅素單體。陽(yáng)辛鳳等[24]分析鑒定出紅肉火龍果果皮提取液中具有14 種甜菜紅素單體。表明不同的提取方法以及純化過(guò)程都會(huì)造成火龍果果皮中甜菜紅素單體測(cè)定的差異。

表1 提取物中甜菜紅素單體分析Table 1 Monomer analysis of betacyanins extract

圖2 甜菜紅素提取物的（a）UPLC 圖譜和（b）質(zhì)譜圖Fig.2 （a）UPLC profile and（b）corresponding MS of betacyanins extract

由表1 可知，丙二酰甜菜苷和甜菜苷為主要的甜菜紅素，二者占比分別為46.49%和34.35%。這與Fathordoobady 等[16]的研究結(jié)果一致。丁酰甜菜苷是紅肉火龍果皮提取物中另一種少量的甜菜紅素，在紅肉火龍果的果肉和果皮均存在[8，16]。不同來(lái)源的甜菜紅素其組成和含量存在差異。例如，朱文嫻[8]分析鑒定出濃縮紅肉火龍果汁中具有13種甜菜紅素單體，甜菜苷和丙二酰甜菜苷分別占比70%和15%左右；在藜科植物紅甜菜中以甜菜苷及其異構(gòu)體異甜菜苷為主，占75%～95%[25]；在莧屬植物中莧菜苷和異構(gòu)體異莧菜苷分別占80%和20%左右，基本不含其它甜菜紅素[20]。

2.3 金屬離子對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響

2.3.1 CuSO4對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響 由圖3所示，當(dāng)加入CuSO4時(shí)甜菜紅素溶液由紫紅色變成橘紅色，這是由于Cu2+與甜菜紅素發(fā)生絡(luò)合作用，金屬-色素復(fù)合物的形成導(dǎo)致其發(fā)生顏色變化[26]。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，甜菜紅素溶液的顏色變淺乃至轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色。如圖4 所示，添加CuSO4后，甜菜紅素溶液L*值顯著升高（P＜0.05），a*和b*值顯著降低（P＜0.05），導(dǎo)致色差值ΔE 增加；且CuSO4濃度越高變化趨勢(shì)越明顯。由圖5 可知，與未添加組相比，添加CuSO4使甜菜紅素溶液吸光度值顯著降低（P＜0.05），且其變化與CuSO4濃度正相關(guān)。故少至0.05 mg/mL CuSO4也會(huì)干擾甜菜紅素的穩(wěn)定性。這可能是由于CuSO4導(dǎo)致了甜菜紅素的氧化。Agnieszka 等[27]研究結(jié)果表明在Cu2+影響下甜菜苷脫氫生成新甜菜苷（黃色），新甜菜苷在Cu2+的作用下進(jìn)一步氧化，生成2-脫羧基-黃嘌呤新甜菜苷（黃色）。

圖3 CuSO4（0.00～1.00 mg/mL）對(duì)甜菜紅素溶液顏色的影響Fig.3 Influence of CuSO4（0.00-1.00 mg/mL）on the color of betacyanins solution

圖4 CuSO4 對(duì)甜菜紅素溶液色度值（a）L*、（b）a*、（c）b*和（d）△E 的影響Fig.4 Influence of CuSO4 on the chromaticity values（a）L*，（b）a*，（c）b* and（d）ΔE of betacyanins solution

圖5 CuSO4 對(duì)甜菜紅素溶液538 nm 處吸光值的影響Fig.5 Influence of CuSO4 on absorbance value of betacyanins solution at 538 nm

2.3.2 FeCl2對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響 如圖6所示，加入FeCl224 h 后甜菜紅素溶液顏色由紅色變?yōu)榛壹t色，并且出現(xiàn)少量白色懸浮物。這與Liu 等[28]的結(jié)果一致。如圖7 所示，加入FeCl2后溶液的L*、a*和b*值均降低，且隨FeCl2濃度增大而降低更明顯。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，添加超過(guò)0.10 mg/mL FeCl2的甜菜紅素溶液L*和b*值呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，a*值持續(xù)降低，導(dǎo)致ΔE 值增大。如圖8 所示，與未添加FeCl2相比，甜菜紅素溶液的A538nm值顯著降低（P＜0.05），且與FeCl2濃度正相關(guān)。因此FeCl2不利于甜菜紅素的穩(wěn)定性，當(dāng)其超過(guò)0.10 mg/mL 時(shí)對(duì)甜菜紅素的顏色影響加劇。

圖6 FeCl2（0.00～1.00 mg/mL）對(duì)甜菜紅素溶液顏色的影響Fig.6 Influence of FeCl2（0.00-1.00 mg/mL）on the color of betacyanins solution

圖7 FeCl2 對(duì)甜菜紅素溶液色度值（a）L*、（b）a*、（c）b*和（d）ΔE 的影響Fig.7 Influence of FeCl2 on the chromaticity values（a）L*，（b）a*，（c）b* and（d）ΔE of betacyanins solution

圖8 FeCl2 對(duì)甜菜紅素溶液538 nm 處吸光值的影響Fig.8 Influence of FeCl2 on absorbance value of betacyanins solution at 538 nm

3 結(jié)論

紅肉火龍果果皮廢棄物可作為甜菜紅素的良好來(lái)源，其優(yōu)化提取條件為：采用蒸餾水提取，料液比1∶5，pH=5，在30 ℃下提取60 min；提取物中甜菜紅素的含量為95.2 mg/g。提取物中含有6 種甜菜紅素單體，以丙二酰甜菜苷和甜菜苷為主，二者分別占比達(dá)46.49%和34.35%。CuSO4和FeCl2的存在不利于甜菜紅素穩(wěn)定性；即使0.05 mg/mL CuSO4也會(huì)造成溶液顏色變化和A538nm值降低，當(dāng)超過(guò)0.10 mg/mL FeCl2存在時(shí)會(huì)導(dǎo)致甜菜紅素溶液顏色變色加劇。故在以甜菜紅素為主要呈色劑/著色劑的食品加工貯藏中應(yīng)盡量避免與銅制、鐵制器具接觸。