李夢婷 董李晉川 陳 穎 張 紅 楊紫玉 楊 慶 劉 麗 閆思超 蔡維艷 李 琦 翁小剛 王婭杰 朱曉新

(中國中醫(yī)科學院中藥研究所,北京,100700)

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展,在過去的40年中果糖消耗量急劇增加,高果糖玉米糖漿以其廉價、甜度高的優(yōu)勢常用于飲料等食品加工領域[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)富含果糖的高熱量飲食方式是多種疾病產生的重要原因之一,如果糖攝入過多可導致代謝綜合征和非酒精性脂肪肝,還可能會誘發(fā)高血壓、痛風等疾病[2-5],出現(xiàn)血壓升高、高密度脂蛋白水平降低、三酰甘油水平升高和高血糖等癥狀[6]。10%果糖水長期喂飼可導致小鼠的血糖升高、血脂代謝紊亂和葡萄糖耐受不良等異常[7],并且引起小鼠腸道微生物群組成改變,腸上皮屏障受損以及海馬神經炎癥反應[8]。

青蒿素是由本研究所的屠呦呦團隊從菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.提取的含過氧橋的倍半萜內酯類化合物,是治療腦型瘧、惡性瘧的特效藥[9]。近年來,青蒿素類藥物在抗腫瘤、免疫疾病、抗炎等方面表現(xiàn)出顯著作用[10-12]。如青蒿琥酯能夠具有降血脂作用,可降低患高脂血癥兔的血漿膽固醇和三酰甘油[13]。蒿甲醚能夠顯著改善2型糖尿病小鼠體內葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗[14]。由此可見,青蒿素類藥物具有改善肥胖相關代謝紊亂,調節(jié)糖脂代謝的潛能[15]。但針對青蒿素干預高果糖飲食小鼠血清代謝組學的研究未見報道。本文旨在通過研究飲食果糖小鼠及青蒿素干預后小鼠代謝物的變化,探討青蒿素改善高果糖引起的小鼠代謝紊亂的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 40只2周齡斷乳雄性C57BL/6J小鼠,體質量8～10 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所動物室SYXK(京)2016-0021,SPF環(huán)境,溫度為(25±2)℃,相對濕度為(50±15)%,明暗周期12 h,自由飲水、攝食。實驗動物使用遵守3R原則。動物實驗部分獲得中國中醫(yī)科學院基礎理論研究所動物倫理委員會的批準(倫理審批號:20190722058)。

1.1.2 藥物 青蒿素(浙江海正藥業(yè)饋贈,批號:S181121),用羧甲基纖維素鈉水溶液配制為5 mg/mL溶液;二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號:ABG0233),用羧甲基纖維素鈉水溶液配制為20 mg/mL溶液。

1.1.3 試劑與儀器 葡萄糖(Glucose,GLU)測試盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司,批號:20201104037),三酰甘油(Triacylglycerol,TG)測試盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A110-1-1),總膽固醇(Total Cholesterol,T-CHO)測試盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A111-1-1),低密度脂蛋白膽固醇(Low-density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)測試盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A113-1-1),高密度脂蛋白膽固醇(High-density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)測試盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A112-1-1),普通飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司,貨號:LAD0011),標準熱量型35%高果糖模型飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司,貨號:TP04103),UHPLC-Q-TOF-MS/MS(AB SCIEX,美國,型號:Triple TOF 5600),高速離心機(Eppendorf,德國,型號:Centrifuge 5424R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為4組,每組10只,分別飼喂標準飲食(正常組)或35%高果糖飲食(模型組、青蒿素組、二甲雙胍組),正常飲水。

1.2.2 給藥方法 從第9周開始,青蒿素組小鼠的給藥劑量為0.1 mL/10 g,二甲雙胍組小鼠的給藥劑量為0.1 mL/10 g,1次/d,連續(xù)灌胃6周。在實驗過程中,每周記錄1次體質量。連續(xù)灌胃6周后,將小鼠禁食過夜,用戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)后取血,全血在573×g下離心10 min,分離血清,儲存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 小鼠血糖 取實驗小鼠血清,血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及總膽固醇濃度用標準診斷試劑盒檢測。

1.2.3.2 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜法分析 1)血清樣本處理:取實驗小鼠血清樣品100 L,加入400 L預冷甲醇乙腈溶液(1∶1,v/v),渦旋60 s,于-20 ℃放置1 h沉淀蛋白,在4 ℃下17 968×g離心20 min,取上清冷凍,-80 ℃保存樣本。2)色譜條件:采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜(Ultra High Performance Liquid Chromatography,UHPLC)HILIC色譜柱,流動相A:水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水,流動相B:乙腈。梯度洗脫程序:0～1 min,95%B;1～14 min,95%～65%B;14～16 min,65%～40%B;16～18 min,40%B;18～18.1 min,40%～95%B;18.1～23 min,95%B。流速0.3 mL/min,柱溫25 ℃。3)質譜條件:分別采用電噴霧電離(Electrospray Ionization,ESI)正離子和負離子模式進行檢測,Triple TOF 5600質譜儀進行質譜分析。ESI源參數(shù)如下:霧化氣(Gas1)為60 psi,輔助氣(Gas2)為60 psi,氣簾氣(CUR)為30 psi。溫度:600 ℃。噴霧電壓(ISVF)±5 500 V(正負2種模式)。TOF MS掃描范圍:60～1 000 Da。product ion掃描范圍:25～1 000 Da。TOF MS采樣速率為0.20 s/spectra,product ion采樣速率為0.05 s/spectra。二級質譜采用信息相關獲取(Information Dependent Acquisition,IDA)獲得,并且采用High Sensitivity模式,去簇電壓(Declustering Potential,DP):±60 V(正負2種模式),碰撞能:35±15 eV,IDA設置如下:Exclude Isotopes within 4 Da,Candidate Ions to Monitor per cycle:6。4)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計:原始數(shù)據(jù)經ProteoWizard轉換成.mzXML格式,然后采用XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。代謝物結構鑒定采用精確質量數(shù)匹配(<25百萬分比濃度)和二級譜圖匹配的方式,檢索實驗室自建數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)經Pareto-scaling預處理后,進行多維統(tǒng)計分析,包括無監(jiān)督主成分分析(Unsupervised Principal Component Analysis,UPCA)和正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA),OPLS-DA以VIP>1和P value<0.05為篩選標準,模型組與正常組、給藥組之間進行比較。單維統(tǒng)計分析包括Student′s t-test和變異倍數(shù)分析。

2 結果

2.1 小鼠體質量與血糖水平 實驗過程中各組小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。模型組小鼠血清中葡萄糖、總膽固醇、高密度脂蛋白含量顯著上升,三酰甘油含量升高;青蒿素組與模型組比較血清三酰甘油顯著降低;各組之間低密度脂蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果表明,模型組小鼠出現(xiàn)糖脂代謝紊亂,表現(xiàn)為高血糖及高三酰甘油血癥,青蒿素顯著改善了模型小鼠血清的三酰甘油水平。見圖2。

圖1 各組小鼠體質量變化

圖2 各組小鼠血糖血脂水平注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.2 代謝輪廓分析 采用XCMS軟件對代謝物離子峰進行提取,并將正常組(C)、模型組(M)、青蒿素組(ART)、QC組樣本提取到的峰經Pareto-scaling得到PCA模型。正離子模式(Positive Ion Mode,POS)和負離子模式(Negative Ion Mode,NEG)下QC樣本PCA得分圖見圖3。

圖3 正、負離子模式下樣本的PCA得分

OPLS-DA常用于差異代謝物的篩選,正常組與模型組OPLS-DA得分:正離子模式R2=0.991、Q2=0.789,負離子模式R2=0.996、Q2=0.939。青蒿素組與模型組OPLS-DA得分:正離子模式R2=0.996、Q2=0.434,負離子模式,R2=0.977、Q2=0.635。見圖4。

圖4 正、負離子模式下模型組與正常組、青蒿素組與模型組的OPLS-DA得分

2.3 差異代謝物分析 根據(jù)OPLS-DA模型篩選標準選出87個具有顯著性差異的代謝物,模型組與正常組共66個差異代謝物,給藥組與模型組共32個差異代謝物。見表1。

與對照組比較,模型組亞油酸、順式-9,10-環(huán)氧硬脂酸、3-吲哚丙酸、2,3-二羥基丙基(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸酯、1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿的水平顯著降低;棕櫚酸、D-喹諾酮糖、α-酮異戊酸、愈傷酸、1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、花生四烯酸(不含過氧化物)、L-古洛糖酸-γ-內酯的水平顯著升高。

青蒿素使亞油酸、順式-9,10-環(huán)氧硬脂酸、3-吲哚丙酸、2,3-二羥基丙基(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸酯,1-硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿的含量進一步下降；花生四烯酸(不含過氧化物)、L-古洛糖酸-γ-內酯的含量進一步升高。與模型組比較，青蒿素顯著下調了棕櫚酸、D-喹諾酮糖、α-酮異戊酸、愈傷酸、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿的水平。

2.4 差異代謝物京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 對上述差異代謝物進行KEGG通路富集分析,結果表明,高果糖喂養(yǎng)的模型小鼠亞油酸代謝,蛋白質的消化吸收,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等重要通路發(fā)生了顯著變化(均P<0.01)。青蒿素組與模型組之間主要涉及脂質代謝類通路改變,其中包括脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、亞油酸代謝等重要通路(均P<0.01)。見圖5～6,表2。

表2 模型組與正常組,青蒿素組與模型組差異通路

圖5 模型組與正常組KEGG通路富集分析

圖6 青蒿素組與模型組KEGG通路富集分析

3 討論

飲食高果糖動物模型目前主要用于研究脂質代謝、降糖作用及炎癥反應[16]。果糖的大量攝入可增加參與脂肪生成和炎癥反應途徑的酶和轉錄因子的表達,可導致果糖誘導的代謝綜合征[17],改變了葡萄糖代謝、胰島素敏感性和血脂濃度[16]。果糖主要被肝臟攝取代謝[18],不受到限速酶限制,不通過胰島素調控[19]。研究表明,果糖在肝臟中轉化為三酰甘油,大量進入血液循環(huán),長期的過量攝入可引起腦部的胰島素抵抗,導致中樞神經系統(tǒng)的能量代謝失衡和神經炎癥反應,從而神經突觸可塑性降低[20]。本實驗中喂飼高果糖飲食15周,與正常飲食組比較,小鼠體質量未發(fā)現(xiàn)明顯變化;但是高果糖飲食可使小鼠血糖及血清三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇升高。長期的高果糖飲食可引起嚙齒類動物的認知功能損傷和學習記憶障礙[21];高脂高果糖喂養(yǎng)的動物腦部小膠質細胞被激活[22]。果糖通過誘導大鼠腦組織中果糖轉運蛋白葡萄糖轉運子5(GLUT5)進而誘導產生中樞炎癥反應[17]。高果糖攝入引起海馬和背側海馬分子層白細胞介素-1b的顯著增加[23]。我們前期也發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物可通過直接調節(jié)中樞炎癥反應過程和抑制炎癥反應用于治療神經炎癥[24-25],有助于保護海馬細胞,下調炎癥反應信號通路,降低了炎癥介質的釋放[26];通過調節(jié)腸道免疫反應和循環(huán)炎癥介質間接調節(jié)神經炎癥反應。今后研究我們也將關注長期高果糖飼養(yǎng)小鼠是否會具有炎性改變,青蒿素及其衍生物是否有可能通過調節(jié)免疫系統(tǒng),抑制炎癥反應信號轉導。

在本研究中高果糖誘導的小鼠模型,青蒿素干預后可降低模型小鼠血清三酰甘油水平,對血糖、膽固醇水平沒有影響。為深入研究青蒿素對高果糖飲食誘導的小鼠血清代謝物的變化,我們對小鼠血清進行代謝輪廓分析,正、負離子模式下QC樣本緊密聚集在一起,表明分析方法重復性好;正、負離子模式下正常組與模型組、青蒿素組與模型組達到了很好的分離,證明模型穩(wěn)定,可用于下一步差異代謝物分析。根據(jù)單變量統(tǒng)計分析篩選差異代謝物,青蒿素干預后主要涉及脂肪酸類成分的變化。對差異代謝物進行KEGG通路富集,發(fā)現(xiàn)高糖飲食能夠引起小鼠脂肪酸、甘油磷脂、苯甲酸及其衍生物、糖醇、吡啶及其衍生物、異黃酮、氨基酸等相關代謝物水平變化;而青蒿素能夠回調α-酮異戊酸、愈傷酸、順式-9-棕櫚油酸等差異代謝物。α-酮異戊酸是一種具有興奮性神經毒性的支鏈氨基酸代謝物,使中樞神經系統(tǒng)發(fā)生改變,常對大腦造成損害,紋狀體內注射能夠引起大鼠驚厥[27]。血液中高濃度α-酮異戊酸會導致代謝酸中毒,發(fā)生代謝性疾病,如糖尿病等。在本研究中,青蒿素能夠顯著降低模型小鼠血清α-酮異戊酸含量,調節(jié)小鼠脂質代謝及中樞神經系統(tǒng)。棕櫚酸、愈傷酸和順式-9-棕櫚油酸等差異代謝物都與脂肪酸代謝相關。青蒿素給藥可使脂質類代謝物出現(xiàn)顯著變化,其中包括中長鏈脂肪酸、膽汁酸及亞油酸相關代謝物。亞油酸可轉化為具有代謝活性的花生四烯酸,具有誘導炎癥反應、脂肪生成和內源性大麻素系統(tǒng)調節(jié)作用[28]。較高的亞油酸生物標志物與2型糖尿病發(fā)病率負相關,提示青蒿素可能改善模型小鼠的亞油酸代謝紊亂[29]。多不飽和脂肪酸在體內往往發(fā)揮著有益的作用,而飽和脂肪酸能引起人體內膽固醇轉運系統(tǒng)的紊亂等一系列疾病[30]。

綜上所述,14周的高果糖飲食改變了小鼠的脂質、氨基酸、碳水化合物代謝及消化、神經系統(tǒng)等系統(tǒng)相關的代謝物水平。青蒿素給藥后可顯著調節(jié)小鼠脂質代謝及神經系統(tǒng)相關的代謝物紊亂;脂肪酸及不飽和脂肪酸生物合成通路在給藥后發(fā)生顯著改變。雖然本研究結果顯示青蒿素發(fā)揮了調節(jié)脂質代謝的作用,改善高果糖飲食引起的代謝紊亂,但是其發(fā)揮作用的特異性靶點和受體尚不明確,其潛在機制還有待進一步研究。

利益沖突聲明:作者聲明沒有利益沖突。