劉暉杰, 彭榮, 許華

(1.湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院 腫瘤科, 湖北 襄陽 441021; 2.宜城市人民醫(yī)院 腫瘤科, 湖北 襄陽 441021; 3.湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院 審計處, 湖北 襄陽 441021)

肺癌發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中居首位,肺腺癌是肺癌的一種,屬于非小細胞癌類型,多發(fā)生于女性[1-2]。大多數(shù)肺腺癌患者在無法進行手術治療的情況下,均以順鉑藥物(DDP)進行化療治療[3],但患者在長期使用DDP時,會產(chǎn)生耐藥性,使得治療效果顯著降低[4-5],因此,改善和扭轉(zhuǎn)癌細胞對DDP的耐藥性,是目前臨床研究的重點。膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3)與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移、血管形成及耐藥性等功能有密切關系[6],且已發(fā)現(xiàn)其在肺腺癌、卵巢癌、胃癌等多種腫瘤細胞中呈較高表達[7]。近來研究發(fā)現(xiàn),有學者已將Annexin A3作為卵巢癌鉑類耐藥的標記蛋白[8],但Annexin A3是否也與肺腺癌鉑類耐藥性有關,目前仍未見報道。白楊素是一種天然黃酮類藥物,具有抗腫瘤、抗炎等作用,其衍生物可抑制人肺腺癌A549細胞生長[9],但其對肺腺癌細胞DDP耐藥性的作用并不清楚。因此本研究通過觀察白楊素對肺腺癌DDP耐藥性細胞A549/DDP對DDP敏感性的影響,并初步探討其機制,以期為臨床治療DDP耐藥型肺癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及主要試劑

人肺腺癌細胞A549(CC-Y2130)及人肺腺癌DDP耐藥細胞株A549/DDP(CC-Y1295)購自上海君潤生物,60只C57BL/6小鼠購自西安迪樂普生物醫(yī)學有限公司[許可證號SCXK(陜)2019-002],白楊素(CC-Y1294)購自上海酶研生物科技有限公司,10%胎牛血清、胰酶、DMEM培養(yǎng)基購自上海語純生物科技有限公司,Annexin A3 NC、Annexin A3 反轉(zhuǎn)錄病毒試劑盒購自南京銳真生物技術有限公司,Trizol試劑盒(15596026)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(4366597)、蛋白提取試劑盒(AM1556)、BCA試劑盒(23227)購自賽默飛世爾中國公司,cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR檢測試劑盒、PCR 引物序列購自日本TakaRa公司,兔抗人 Annexin A3抗體購自美國 Abcam 公司,兔抗 GAPDH美國 Cell Signaling Technolog,HRP標記的羊抗兔IgG購自中國中杉金橋公司,ECL化學發(fā)光劑試劑盒(P0018FA)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 將A549細胞、A549/DDP細胞快速解凍,并離心收集細胞,用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細胞并接種于細胞皿中,置恒溫培箱中進行常規(guī)傳代培養(yǎng)并計數(shù)。取對數(shù)期A549細胞、A549/DDP細胞,以每孔2×105密度種植于6孔板中適應性培養(yǎng)6 h后,用qRT-PCR及Western blot法測膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3)基因及蛋白表達。收集對數(shù)期A549細胞、A549/DDP細胞,以每孔2×105密度種植于六孔板中,在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0、5、25、50及100 mmoL/L的白楊素干預培養(yǎng)24、48、72 h,用CKK-8法檢測A549細胞、A549/DDP細胞存活情況,篩選出毒性較低(細胞活性>50%)的白楊素濃度,作為實驗時濃度。取A549/DDP細胞,以每孔2×105密度種植于6孔板中,設置為A549/DD組、白楊素組(50 mol/L)、Annexin A3過表達組(Annexin A3mimic組)、Annexin A3陰性對照組(Annexin A3 NC)及白楊素+Annexin A3mimic組;另取A549細胞作為A549組,每組設置6個復孔。A549/DD組選用A549/DD細胞進行干預培養(yǎng),白楊素組加入終濃度為50 mol/L白楊素,Annexin A3mimic組及Annexin A3 NC組按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法轉(zhuǎn)染Annexin A3mimic及Annexin A3 NC試劑,白楊素+Annexin A3mimic組轉(zhuǎn)染Annexin A3mimic的同時、加入終濃度為50 mol/L的白楊素進行干預培養(yǎng)。

1.2.2CKK-8檢測 收集各組細胞,加入胰蛋白酶消化,按照CKK-8試劑盒說明書步驟對細胞進行處理,用酶標儀檢測450 nm波長下吸光值,細胞生存率(%)=(藥物處理組吸光值/空白組吸光值)×100%。

1.2.3細胞半數(shù)生存濃度(IC50)及耐藥指數(shù)檢測 上述細胞加入終濃度為(0、5、15、20、30 mg/L)DDP繼續(xù)干預培養(yǎng)24 h,按CKK-8法測細胞在450 nm波長下的吸光值,繪制生存曲線,取細胞生存率為50%時的濃度為IC50,根據(jù)公式,耐藥指數(shù)=給藥組IC50/空白組IC50,計算各組細胞的耐藥指數(shù)。

1.2.4熒光實時定量PCR(qRT-PCR) 取細胞,棄去培養(yǎng)基,離心后收集細胞,用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應體系為10 μL(2 μL 5x Reaction mix,1 μL Random primer,0.6 μL逆轉(zhuǎn)錄酶,5 μLRNA樣品),置于42 ℃、60 min,85 ℃下5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性;將cDNA稀釋10倍按照實時熒光定量PCR試劑盒對Annexin A3進行擴增。反應體系為cDNA 10 μL,正向引物、反向引物各1 μL,SYBR Green/Flourescein qPCR Maxter Mix 10 μL,去離子水5.2 μL。反應條件:95 ℃,預熱3 min,95 ℃ 20 s ,60 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s,上述3步驟40次循環(huán),72 ℃ 5 min終止反應。Annexin A3以GAPDH為內(nèi)參基因,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt算法計算Annexin A3 mRNA相對表達量,實驗重復3次。Annexin A3正向引物5′-GCGGCAGCTGATTGTTAAGGA-3′,反向引物5′-GAGTCATAGGGCCACCATGAGA-3′;GAPDH正向引物5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,反向引物5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡 取各組細胞,棄去培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液裂解后提取總蛋白,用BCA試劑盒測定總蛋白濃度后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,加入適宜濃度的兔抗人一抗Annexin A3(1∶1 000),4 ℃孵育24 h、洗滌后加入HRP標記的二抗(羊抗兔IgG),室溫孵育1 h,洗滌,以GAPDH為內(nèi)參,通過ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)照相并分析灰度值。試驗重復3次。

1.2.6流式細胞儀監(jiān)測細胞凋亡 取培養(yǎng)48 h后的各組細胞,加入終濃度為5 g/L DDP培養(yǎng)48 h后,參照文獻[10]收集細胞,重懸制成單細胞懸液,加入50 mg/L異硫氰酸熒光素和碘化丙啶試劑各5 μL染色,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7小鼠荷瘤實驗驗證白楊素對細胞耐藥性的影響 取(20±2)g的C57BL/6小鼠60只,分為A549組、A549/DDP組、白楊素組(50 mol/L)、Annexin A3過表達組(Annexin A3mimic組)、Annexin A3陰性對照組(Annexin A3 NC)及白楊素+Annexin A3 mimic組,每組10只,A549組小鼠經(jīng)皮下注射0.2 mL/只(1×107個/mL)的A549細胞;7 d后,給予10 mg/kg DDP腹腔注射14 d,2次/d;A549/DDP組小鼠除注射細胞為A549/DDP細胞外,其余同A549組;白楊素組小鼠皮下注射等量A549/DDP細胞后7 d,給予10 mg/kg DDP腹腔注射的同時注射白楊素(50 mol/L,1 mL只)進行干預治療;Annexin A3 mimic組及Annexin A3 NC組小鼠分別皮下注射轉(zhuǎn)染Annexin A3mimic及Annexin A3 NC的A549/DDP細胞(0.2 mL/只,1×107個/mL)后7 d,給予相同劑量的DDP進行干預治療;白楊素+Annexin A3mimic組小鼠在Annexin A3mimic組基礎上給予白楊素(50 mol/L,1ml/只)進行干預治療。各組干預治療7 d后測量并計算瘤體體積。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 白楊素對A549、A549/DDP細胞毒性的影響

隨著白楊素濃度的上升,A549、A549/DDP細胞生存率逐漸降低、且白楊素5、25、50 mol/L組呈時效依賴性和劑量依賴性;用50 mol/L白楊素處理48 h時,A549、A549/DDP細胞生存率分別為51.36%、51.14%,接近IC50,因此將50 mol/L作為白楊素毒性適宜濃度,48 h作為最佳處理時間用于下游試驗。見圖1。

圖1 白楊素對A549、A549/DDP的IC50細胞毒性

2.2 Annexin A3基因及蛋白表達和DDP的IC50

與A549細胞組比較,A549/DDP細胞組Annexin A3基因及蛋白表達、對DDP的IC50升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與A549細胞組比較,P<0.05。

2.3 細胞耐藥性對DDP的影響

與A549組比較,A549/DDP組細胞IC50及耐藥指數(shù)升高(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組IC50及耐藥指數(shù)降低(P<0.05);Annexin A3 mimic組細胞IC50及耐藥指數(shù)進一步升高(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組細胞IC50及耐藥指數(shù)升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞的IC50及耐藥指數(shù)

2.4 Annexin A3 mRNA及蛋白表達

與A549組比較,A549/DDP組細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05);細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達進一步升高(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)。見圖3。

注：(1)與A549組比較,P<0.05;(2)與A549/DDP組比較,P<0.05;(3)與白楊素組比較,P<0.05。

2.5 細胞凋亡率

與A549組比較,A549/DDP組細胞凋亡率降低(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組細胞細胞凋亡率升高(P<0.05);Annexin A3 mimic組細胞凋亡率進一步降低(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組細胞細胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 各組細胞凋亡率比較

圖4 各組細胞凋亡檢測

2.6 荷瘤小鼠瘤體體積

DDP干預治療后,與A549組比較,A549/DDP組小鼠瘤體體積增大(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組小鼠瘤體體積減少(P<0.05);Annexin A3 mimic組小鼠瘤體體積增大(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組小鼠瘤體體積增大(P<0.05)。

表3 各組荷瘤小鼠瘤體體積

3 討論

肺腺癌是非小細胞型肺癌中發(fā)病率和死亡率最高的一類惡性腫瘤性疾病,目前,DDP化療仍是治療肺腺癌的主要手段,然而DDP耐藥問題越來越明顯,逐漸成為導致肺腺癌治療失敗的主要原因,大部分肺腺癌患者死亡與腫瘤細胞耐藥有著重要關系,因此如何解決腫瘤細胞對DDP藥物的耐藥性,提高化療藥物的療效,是國內(nèi)外研究的熱點和難點問題[11]。

白楊素為蜂膠中主要成分,也是一種天然的植物黃酮類化合物,具有抗腫瘤抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[12],其能夠抑制肺癌、肝癌、乳腺癌等多種癌細胞的增殖而受到國內(nèi)外研究的重視[13]。近來研究報道白楊素可增強卵巢癌細胞對放射治療的感性[14],基于其抗腫瘤及放射增敏作用,本研究認為用白楊素改善肺腺癌細胞對DDP的耐藥性,可能是解決肺腺癌鉑類耐藥問題的潛在藥物。A549/DDP細胞是一種DDP耐藥細胞,本研究發(fā)現(xiàn),白楊素不同濃度可呈劑量依賴性和時效性抑制A549、A549/DDP細胞的增殖能力,且用50 mol/L 濃度的白楊素處理A549/DDP細胞后,A549/DDP細胞對DDP的IC50由24.15 mg/L左右降至為6.57mg/L,耐藥指數(shù)由6.35左右降至1.75左右,提示白楊素可顯著降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。Annexin A3是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白[15],研究發(fā)現(xiàn),其不僅可調(diào)控細胞增殖、凋亡而參與多種癌細胞的惡性生物學過程[16],還可通過凋亡途徑調(diào)控癌細胞對DDP的敏感性[17]。孫佳等[18]發(fā)現(xiàn)Annexin A3基因可在結(jié)腸癌細胞中有較高表達,而下調(diào)Annexin A3基因表達后可抑制結(jié)腸癌的增殖、遷移過程,證實了Annexin A3與腫瘤惡性生物學關系密切。Xu等[19]發(fā)現(xiàn)下調(diào)大腸癌耐藥細胞株中Annexin A3表達可顯著降低耐藥細胞株的存活,本研究發(fā)現(xiàn)A549/DDP細胞耐藥性高于A549細胞的同時,其Annexin A3基因及蛋白表達也明顯高于A549細胞。用白楊素干預處理后,A549/DDP細胞對DDP的IC50及耐藥指數(shù)降低的同時,Annexin A3基因及蛋白表達也顯著降低,提示白楊素降低A549/DDP細胞對DDP耐藥性作用,可能與下調(diào)Annexin A3基因及蛋白表達有關。為了進一步探究白楊素降低A549/DDP細胞對DDP耐藥性作用,本研究上調(diào)A549/DDP中Annexin A3基因表達后,發(fā)現(xiàn)A549/DDP細胞對DDP的耐藥性及耐藥指數(shù)進一步升高,白楊素促進A549/DDP凋亡、降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性作用也明顯被削弱,提示Annexin A3基因高表達,可能是A549/DDP細胞耐藥性升高的關鍵機制。Annexin A3基因過表達可逆轉(zhuǎn)白楊素的降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性作用。另外小鼠體內(nèi)試驗,也證實一定濃度的DDP治療后,再進行白楊素干預治療,小鼠瘤體體積增長明顯低于單獨用DDP治療組,轉(zhuǎn)染Annexin A3基因高表達的A549/DDP細胞,再經(jīng)白楊素及DDP治療,其瘤體體積增長仍然加快,進一步證實,白楊素降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性作用,可能與抑制Annexin A3表達有關。

綜上所述,白楊素可能通過下調(diào)Annexin A3的表達,降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性,為治療DDP耐藥型肺癌提供方向。然而A549/DDP細胞耐藥性升高的作用,也可能與機體免疫逃逸的發(fā)生有關,白楊素也可能通過調(diào)節(jié)免疫來降低A549/DDP細胞對DDP耐藥性,這有待后續(xù)進一步探究。