陳昕, 杜琎, 高磊, 闞晨靜, 黃項(xiàng)鳴, 徐興聞, 朱軍, 楊平印, 石開(kāi)虎**

(1.溧陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院 介入科, 江蘇 溧陽(yáng) 213300; 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 心胸外科, 江蘇 南京 210038; 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院, 江蘇 南京 210038)

心肌纖維化是多種心臟疾病共同的病理過(guò)程,是心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)之一。心肌細(xì)胞凋亡增加,心肌膠原蛋白分泌增多、膠原纖維不斷沉積、心肌組織發(fā)生不同程度的纖維化,久之心臟順應(yīng)性降低、結(jié)構(gòu)改變,從而引發(fā)心律不齊、心力衰竭等心臟疾病[1]。有研究指出,Toll樣受體4/髓樣分化因子88(toll like receptor 4/recombinant myeloid differentiation factor88,TLR4/MyD88)信號(hào)通路在延緩纖維化進(jìn)程中有重要作用,其主要是通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡達(dá)到干預(yù)心肌纖維化進(jìn)程的目的[2]。中藥“人參”在臨床上參與很多心臟疾病的治療,而人參皂苷Rg1(ginsenoside rg1, GRg1)作為其主要效用成分,有強(qiáng)心、抗休克、對(duì)抗心律失常、減輕心肌缺血缺氧再灌注損傷、促進(jìn)心肌血管再生等重要作用,臨床多用于治療心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、心律失常等多種疾病[3]。申文宇等[4]研究指出,人參皂苷Rg1能夠調(diào)控內(nèi)源性線(xiàn)粒體凋亡途徑,抑制細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)釋放,降低凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinases 3,caspase 3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinases 9,caspase 9)表達(dá)水平,減少大鼠心肌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)心律、保護(hù)心肌。關(guān)于人參皂苷Rg1是否通過(guò)TLR4/MyD88通路干預(yù)心肌纖維化的研究較少,本研究旨在探索人參皂苷Rg1通過(guò)調(diào)控TLR4/MyD88通路干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡、影響心肌纖維化的機(jī)制,以期對(duì)臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用成年雄性C57BL/6J 小鼠30 只,由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)指南,無(wú)菌喂養(yǎng),飲用水和飼料均經(jīng)過(guò)高溫消毒,環(huán)境溫度約在24 ℃,濕度42%～48%。本實(shí)驗(yàn)研究獲得江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[許可證號(hào)SYXK(蘇)2021-0025)]。

1.1.2主要試劑 人參皂苷Rg1藥物采購(gòu)于南京草本源生物科技有限公司,TLR4(貨號(hào) 14358S)、Bax(貨號(hào)14796S)、MyD88(貨號(hào)4283S)、膠原蛋白1(collagen-I, COL-1,貨號(hào) 72026S)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA貨號(hào)19245S)、β-actin(貨號(hào)D191048)抗體購(gòu)買(mǎi)于Cell Signaling公司,Bcl-2(貨號(hào)ab32124)、GAPDH(貨號(hào) ab9485)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(貨號(hào) ab97051)購(gòu)買(mǎi)于abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1建模與給藥方案 取30只成年雄性C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rg1組,對(duì)照組皮下注射0.9%氯化鈉溶液,模型組皮下注射異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)5 mg/kg,治療組皮下注射ISO 5 mg/kg、同時(shí)予以人參皂苷Rg1 20 mg/kg灌胃,1次/d,連續(xù)干預(yù)14 d。給藥期間所有小鼠均正常飼養(yǎng),自由飲水。

1.2.2觀察心肌組織病理學(xué)改變 建模結(jié)束后,用1%的戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射,取血;后打開(kāi)胸腔,游離心臟、離斷主動(dòng)脈,取出小鼠心臟用4%的福爾馬林溶液浸泡,脫水、石蠟包埋、切0.4 μm薄片、烤片、脫蠟、烘干,分別馬松染色(Masson)、蘇木精-伊紅染色法(HE)染液染色,電子顯微鏡下觀察。

1.2.3免疫印跡試驗(yàn)(WB)檢測(cè)凋亡相關(guān)通路蛋白的表達(dá) 取出凍存的心肌組織研磨,RIPA裂解液提取總蛋白,BCA檢測(cè)蛋白總量,用分離膠和濃縮膠進(jìn)行分離蛋白后,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加入抗體TLR4(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、COL-1(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,經(jīng)ECL顯影后,使用軟件對(duì)PVDF膜蛋白條帶進(jìn)行掃描分析,計(jì)算灰度值,GAPDH為內(nèi)參。

1.2.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)TLR4、MyD88、兔抗人單克隆抗體(Bcl2-associated X, Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)表達(dá) 引物由生工生物在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)(表1),采用trizol(Invitrogen)提取心肌組織總RNA于A260 nm/A 280 nm≥1.8鑒定RNA純度。取2 μg總RNA為模板,參照TAKARA公司的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。20 μL PCR反應(yīng)體系,實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,以β-actin為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn),進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)等。

表1 PCR檢測(cè)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌組織學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則正常,細(xì)胞間排列順序整齊;ISO組中纖維化后的小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,體積明顯增大,組織間水腫明顯,細(xì)胞排列紊亂;人參皂苷Rg1組小鼠心肌細(xì)胞排列稍規(guī)則,細(xì)胞體積稍有增大,細(xì)胞排列恢復(fù)正常。見(jiàn)圖1。Masson染色結(jié)果顯示,對(duì)照組中,心肌細(xì)胞形態(tài)正常、排列整齊,而ISO組中心肌細(xì)胞排列雜亂、大量膠原纖維聚集;人參皂苷Rg1組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)接近正常、排列尚齊,偶可見(jiàn)少量藍(lán)紫色聚集的膠原纖維聚集。見(jiàn)圖2。

對(duì)照組 ISO組 人參皂苷Rg1組

對(duì)照組 ISO組 人參皂苷Rg1組

2.2 凋亡相關(guān)通路蛋白的表達(dá)

WB結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,ISO組小鼠心肌組織中α-SMA、COL-1纖維化蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示造模成功;與ISO組比較,Rg1組小鼠心肌組織中COL-1、α-SMA的表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示Rg1對(duì)心肌纖維化有干預(yù)作用。見(jiàn)圖3。與對(duì)照組比較,ISO組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax蛋白表達(dá)明顯升高,Bcl-2表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ISO組比較,Rg1組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax的表達(dá)明顯降低,Bcl-2表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 各組COL1及α-SMA小鼠心肌纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)

圖4 各組小鼠心肌組織中TLR4TLR4、MyD88、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3 TLR4、MyD88、Bcl-2、Bax的基因表達(dá)

PCR結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,ISO組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax的mRNA明顯升高,Bcl-2mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ISO組比較,Rg1組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax的mRNA明顯降低,Bcl-2mRNA表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠心肌組織中 TLR4、MyD88、Bcl-2及Bax的基因表達(dá)

3 討論

心肌纖維化是多種心臟疾病發(fā)生心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)的關(guān)鍵病理基礎(chǔ),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為心肌細(xì)胞外基質(zhì)不斷沉積在心肌纖維化中起重要作用[5]。而心肌組織中膠原纖維不斷沉積,膠原比率失調(diào)、細(xì)胞排列紊亂是心肌纖維化的標(biāo)志,其中含量最多的是COL-1[6],在心臟瘢痕組織中高表達(dá)。當(dāng)膠原沉積增多,各型膠原比率失調(diào)和排列紊亂使心肌發(fā)生纖維化,并且纖維化發(fā)生會(huì)誘導(dǎo)更多的炎癥因子釋放,會(huì)進(jìn)一步加重纖維化的過(guò)程[7-8]。大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),TLR4/MyD88通路作為經(jīng)典的信號(hào)通路能夠通過(guò)細(xì)胞凋亡、程序性壞死、焦亡等多種途徑,減輕心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、控制心肌細(xì)胞炎癥、減少細(xì)胞凋亡等途徑調(diào)控心肌纖維化發(fā)展[9-11]。因此通過(guò)有效手段干預(yù)心肌纖維化進(jìn)程有望能夠用于臨床心臟疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)用COL-1以及α-SMA作為心肌纖維化的檢測(cè)指標(biāo),本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),皮下注射異丙腎上腺素組的小鼠心肌組織中COL-1、α-SMA蛋白表達(dá)增加,說(shuō)明心肌纖維化模型建立的成功,而通過(guò)人參皂苷Rg1干預(yù)后COL-1、α-SMA蛋白表達(dá)恢復(fù)到正常組水平,說(shuō)明人參皂苷Rg1能夠減輕ISO誘導(dǎo)的心肌纖維化損傷。本實(shí)驗(yàn)造模方法選用皮下注射ISO(5 mg/kg)建立小鼠心肌纖維化模型[5],HE染色結(jié)果顯示心肌細(xì)胞體積增大,排列紊亂,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞間質(zhì)不均勻增多,Masson染色模型組心肌纖維排列紊亂,結(jié)構(gòu)破壞,組織增生嚴(yán)重,并伴有細(xì)胞壞死,瘢痕出現(xiàn),均提示皮下注射異丙腎上腺素能夠建立心肌纖維化模型,人參皂苷Rg1干預(yù)后細(xì)胞體積變小,排列恢復(fù)一定次序均說(shuō)明人參皂苷Rg1對(duì)ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化有明顯的改善作用,能夠干預(yù)心肌纖維化進(jìn)程。

Toll樣受體中的經(jīng)典受體TLR4是一種膜蛋白受體,其主要是通過(guò)識(shí)別細(xì)菌脂多糖,結(jié)合可溶性穿梭蛋白LBP和LPS,繼而激活下游MyD88及NF-kB信號(hào)通路,激活機(jī)體免疫應(yīng)答,炎癥因子IL-β、IL-8、TNF-α大量釋放,引起心肌損傷[12-15]。細(xì)胞凋亡存在于多種有心肌纖維化的心臟疾病中,有人認(rèn)為多種病毒可以觸發(fā)細(xì)胞凋亡從而加快了心肌纖維化進(jìn)程, 細(xì)胞凋亡可能是引起病毒性心肌炎向心肌病轉(zhuǎn)變的第3種機(jī)制[16]。我國(guó)古典醫(yī)籍《本草經(jīng)》中談到人參具有“主五臟、安精神、定魂魄、止驚悸”的作用[17]。人參皂苷Rg1作為中藥人參的主要成分,有增強(qiáng)心肌收縮力,穩(wěn)定心率,改善心肌代謝等功能。彭程飛等[18]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1能夠有效抑制大鼠急性心肌梗塞后的心肌纖維化發(fā)生。細(xì)胞凋亡途徑有兩種途徑,分為線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑,細(xì)胞外途徑主要是死亡受體分子活化后,caspase酶原募集,凋亡酶體激活,pro-caspase8水解活化后,caspase8活化,激活下游caspase3,引起目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生凋亡;線(xiàn)粒體途徑是激活bcl-2、Bax、Bak等促凋亡細(xì)胞,引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-23]。Luo等[24]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1能夠干預(yù)TLR4通路,緩解LPS誘導(dǎo)的心肌損傷,恢復(fù)心肌部分功能。此外,研究發(fā)現(xiàn),平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA在大部分平滑肌肌型細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)較高,而心肌纖維化的主要標(biāo)志之一[25]。本實(shí)驗(yàn)在ISO組以及人參皂苷Rg1組中檢測(cè)了TLR4、MyD88的表達(dá),與對(duì)照組比較ISO組中TLR4、MyD88的表達(dá)無(wú)論在RNA水平還是蛋白水平都明顯升高,而人參皂苷Rg1組較ISO組呈現(xiàn)出明顯下降,說(shuō)明Rg1灌胃在ISO誘導(dǎo)的心肌纖維化模型中能降低TLR4、MyD88的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)ISO組較對(duì)照組小鼠心肌組織中Bax的表達(dá)明顯升高,Bcl-2的表達(dá)則明顯降低;而人參皂苷Rg1組與ISO組比較,Bax表達(dá)明顯降低,Bcl-2的表達(dá)則升高明顯,也證實(shí)了人參皂苷Rg1能明顯改善心肌纖維化組織中的細(xì)胞凋亡水平。

綜上所述,人參皂苷Rg1可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88信號(hào)通路活化,改善小鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡水平,從而延緩心肌纖維化進(jìn)程,發(fā)揮心臟保護(hù)作用。