孫波, 周雷, 周東亞, 王小龍, 徐超, 呂瑩, 劉犇

(南京中醫(yī)藥大學(xué)沭陽附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 宿遷 223600)

肝癌是全球最常見的癌癥死亡原因之一,也是中國第4大最常見的癌癥死亡原因[1-2]。肝癌的預(yù)后很差,即使經(jīng)過手術(shù)切除和標(biāo)準(zhǔn)化治療,其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍然很高[3-4]。因此,深入研究肝癌防治的新靶點,對提高肝癌的早期診斷和臨床預(yù)后具有重要意義。長非編碼RNA(lncRNA)是一類非蛋白質(zhì)編碼RNA轉(zhuǎn)錄物,長度超過200個核苷酸,被認(rèn)為是癌癥生物學(xué)中的新型調(diào)控因子[5]。異常表達(dá)的lncRNA通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控影響癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、自我更新和凋亡,促進(jìn)多種癌癥類型的發(fā)生發(fā)展[6]。有證據(jù)表明lncRNA可能是癌癥檢測的有效生物標(biāo)志物,包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥類型的致瘤性都涉及各種lncRNA[7-8]。其中,LncRNA NNT-AS1是一種新鑒定的lncRNA,位于3個外顯子的5p12處,被認(rèn)為是肝癌致癌基因[9]。NNT-AS1在肝癌發(fā)展中的機(jī)制研究極為匱乏。lncRNA通過降低其靶miRNA的水平在人類腫瘤中發(fā)揮作用已被廣泛接受。據(jù)報道,NNT-AS1通過抑制miR-22-3p增強肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[10]。此外,lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1通過海綿miR-582-5p促進(jìn)肝癌進(jìn)展[11]。有研究表明,miR-582-5p在肝癌中表達(dá)降低[12],NNT-AS1是否通過調(diào)控miR-582-5p來影響肝癌進(jìn)展仍不明確。MCL1是抗凋亡BCL-2家族蛋白的關(guān)鍵成員,MCL1的獨特之處在于其有效的泛素化和破壞作用,并且具有促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的功能[13]。目前MCL1在肝癌進(jìn)展中的作用機(jī)制還不明確,是否由LncRNA/miRNA介導(dǎo)和調(diào)節(jié)也不清楚。因此本研究旨在探討NNT-AS1、miR-582-5p和MCL1對肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

選擇正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞和肝癌細(xì)胞MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B(購于ATCC,中國)進(jìn)行培養(yǎng)。置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號thromo3111,美國)中,用含10% 胎牛血清(Gibco,美國)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,美國)培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)基,3～4 d傳代。選擇處于對數(shù)生長期并且生長狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

取對數(shù)期生長的人肝癌Huh7細(xì)胞系 按1×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi),轉(zhuǎn)染前1 d用不含血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)將細(xì)胞分組并轉(zhuǎn)染:Control組(不做處理細(xì)胞)、si-NC組、si-NNT-AS1組、NC mimics組、miR-582-5p mimics組、si-NC+NC mimic、si-NNT-AS1+NC mimics、si-NC+miR-582-5p mimics組、si-NNT-AS1+miR-582-5p mimics組、si-NNT-AS1+oe-NC及si-NNT-AS1+oe-MCL1組,按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將50 ng si-NNT-AS1、miR-582-5p mimics、oe-NC或NC(上海吉瑪公司,中國)快速離心,與170 μL磷酸鹽緩沖液(賽默飛世爾,USA)混勻后,靜置5 min,加入Lipofectamine 2000 8 μL(thromo,美國),輕微震蕩充分混勻后,室溫下靜置20 min,5 μmoL/L DAPT添加后加入到6孔板中,輕輕混勻,8 h換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基(Gibco,美國)。轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1qRT-PCR檢測NNT-AS1、miR-582-5p、MCL1表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞,Trizol(貨號16096020,賽默飛世爾科技,紐約,美國;貨號B1802,哈爾濱新?；驒z測有限公司,中國)提取總RNA。TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer(Thermo scientific公司, USA)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(行知生物科技有限公司,中國)進(jìn)行熒光定量PCR檢測。依次加入以下組分: SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)25 μL, PCR上、下游引物各2 μL,ROX Reference Dye(50×)l μL, DNA模板4 μL, ddH2O16 μL。在ABI PRISM?7300(型號Prism?7300,上海坤科儀器設(shè)備有限公司,中國)系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)32次后72 ℃延伸1 min。ΔCt = CT(目的基因)-CT(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組),基因以U6為內(nèi)參,用2-ΔΔCt表示各目的基因相對表達(dá)量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2Western blot檢測 MCL1蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后,預(yù)冷的PBS洗3遍,使用含PMSF的RIPA裂解液(R0010,solarbio)提取細(xì)胞中總蛋白。BCA試劑盒(thromo,美國)測定蛋白濃度,去離子水調(diào)零。樣品與上樣緩沖液混合,100 ℃金屬浴煮10 min,點樣時加入50 μg蛋白樣品,以70 V恒壓電泳3 h。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(ISEQ00010,Millipore,Billerica,MA,USA)上,恒流150 mA轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉4 ℃室溫封閉2 h;棄去牛奶,TBST洗去牛奶,用一抗兔抗人MCL1(ab32087,1∶2 000)、GAPDH(ab8226,1∶2 000,Abcam,UK)4 ℃孵育過夜,TBST洗3次,每次6 min。HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司,1∶5 000稀釋)孵育2 h。TBST洗3次、每次6 min,洗后泡在TBS中。取ECL熒光檢測試劑盒(貨號BB-3501,Ameshame公司,英國)中A液和B液,等體積混勻,200 μL滴加在膜上,在凝膠成像儀中曝光成像。用Bio-Rad圖象分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)照相,用Image J軟件分析,以相應(yīng)蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

1.3.3RIP檢測NNT-AS1和miR-582-5p結(jié)合 采用RIP試劑盒(millipore,USA)檢測NNT-AS1和miR-582-5p結(jié)合情況。用預(yù)冷PBS洗神經(jīng)元后棄上清。用等體積的RIPA裂解液(P0013B,碧云天)冰浴5 min裂解細(xì)胞,14 000 r/min,4 ℃離心10 min取上清。細(xì)胞提取液一部分取出作為input,一部分與抗體孵育進(jìn)行共沉淀。具體步驟:每一個共沉淀反應(yīng)體系取50 μL磁珠清洗后重懸于 RIP Wash Buffer100 μL中,依據(jù)實驗分組加入5 μg抗體孵育以便結(jié)合。磁珠-抗體復(fù)合物經(jīng)清洗后與重懸于RIP Wash Buffer900 μL ,加入100 μL細(xì)胞提取液4 ℃孵育過夜。樣品置于磁座上收集磁珠-蛋白復(fù)合物。樣品及Input分別經(jīng)蛋白酶K消化后提取RNA,PCR檢測NNT-AS1和miR-582-5p結(jié)合。RIP所用抗體為:AGO2(ab32381,1∶1 000,Abcam,UK),室溫混勻30 min,IgG(1∶100,ab109489)作為陰性對照。

1.3.4生物信息學(xué)網(wǎng)站和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?首先經(jīng)過生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站(www.targetscan.org)進(jìn)行miR-582-5p與MCL1結(jié)合位點的分析。接下來通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-582-5p與MCL1的靶向關(guān)系。構(gòu)建靶基因MCL1雙熒光素酶報告基因載體與miR-582-5p結(jié)合位點突變的突變體:MCL1wt和MCL1mut。將Rellina質(zhì)粒和兩種報告質(zhì)粒分別與miR-582-5p mimics和NC mimics質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。將Rellina質(zhì)粒和兩種報告質(zhì)粒分別與miR-582-5p mimics質(zhì)粒和NC mimics質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,進(jìn)行雙熒光素酶檢測。首先將各組細(xì)胞裂解,裂解后以12 000 g離心1 min,去沉淀,收集上清液。雙熒光素酶報告試劑盒購自Promega,按照試劑盒操作,測量熒光素酶活性。操作步驟如下:將裂解后的細(xì)胞樣品吸入EP管中,每10 μL樣品中螢火蟲熒光素酶工作溶液100 μL,測得螢火蟲熒光素酶之后加入海腎熒光素酶工作溶液100 μL,測得海腎熒光素酶結(jié)果。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶。

1.3.5Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 采用trans-well培養(yǎng)系統(tǒng)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。使用涂有Matrigel(BD Biosciences Discovery Labware,Woburn,MA,USA)的上腔室的透孔膜;在37 ℃的培養(yǎng)箱中,用無血清培養(yǎng)基將小室再水化2 h。隨后將頂部室用200 uL細(xì)胞懸浮液(含有1×105個細(xì)胞)水合。在底部室中加入500 uL含有10%FBS作為化學(xué)吸引劑的培養(yǎng)基。在37 ℃下培養(yǎng)24 h后,將膜下表面的跨膜細(xì)胞在室溫下用甲醛固定5 min,用結(jié)晶紫染色20 min,用清水洗滌3次,并在顯微鏡下計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞系中NNT-AS1和miR-582-5p表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示,與肝細(xì)胞L-02比較,MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B細(xì)胞中NNT-AS1表達(dá)升高,miR-582-5p表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);其中Huh7細(xì)胞中NNT-AS1表達(dá)量最高,選擇該細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

注：(1)與肝細(xì)胞L-02比較,P<0.05。

2.2 沉默NNT-AS1和過表達(dá)miR-582-5p對肝癌細(xì)胞株Huh7侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

為探究NNT-AS1對肝癌細(xì)胞株Huh7侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,分別對Huh7細(xì)胞進(jìn)行NNT-AS1和miR-582-5p沉默和過表達(dá)處理,并通過transwell檢測各組細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-NNT-AS1組細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與NC mimics組比較,miR-582-5p mimics組細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為transwell轉(zhuǎn)移與侵襲圖(結(jié)晶紫染色,×200),B為各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析,C為各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析;(1)與si-NC組比較,P<0.05;(2)與NC mimics組比較,P<0.05。

2.3 NNT-AS1對海綿miR-582-5p的吸附情況

通過生信篩選發(fā)現(xiàn)LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p存在結(jié)合位點。為探究NNT-AS1和miR-582-5p之間的關(guān)系,RIP實驗驗證NNT-AS1與miR-183-5p的結(jié)合能力(圖3);與IgG(1.00±0.04)比較,AGO2(1.54±0.06)結(jié)合的miR-183-5p的量顯著增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示NNT-AS1可海綿吸附miR-582-5p。

注：A為transwell轉(zhuǎn)移與侵襲圖(結(jié)晶紫染色,×200),B為各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析,C為各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析;(1)與si-NC+NC mimic組比較,P<0.05;(2)與si-NNT-AS1+NC mimics組比較,P<0.05。

2.4 NNT-AS1吸附miR-582-5p在肝癌細(xì)胞株Huh7侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

transwell檢測各組肝癌細(xì)胞株Huh7的侵襲和轉(zhuǎn)移情況,結(jié)果顯示,與si-NC+NC mimic比較,si-NNT-AS1+NC mimics組Huh7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著減弱,si-NC+miR-582-5p mimics組Huh7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與si-NNT-AS1+NC mimics比較,si-NNT-AS1+miR-582-5p mimics組Huh7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.5 miR-582-5p靶向結(jié)合MCL1

生信網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)miR-582-5p與 MCL1存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告檢測發(fā)現(xiàn),miR-582-5p與突變的MCL1的3′-UTR共轉(zhuǎn)染后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而miR-582-5p與野生型的MCL1的3′-UTR共轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。結(jié)果提示,MCL1是miR-582-5p的下游靶基因。

注：(1)與NC mimics組比較,P<0.05。

2.6 miR-582-5p對MCL1表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示,與NC mimics(1.00±0.05)組比較,miR-582-5p mimics(0.24±0.03)組Huh7細(xì)胞中MCL1表達(dá)明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.7 肝癌細(xì)胞系中MCL1表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,與肝細(xì)胞L-02比較,MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B細(xì)胞MCL1表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為各組細(xì)胞MCL1的蛋白條帶圖,B為各組細(xì)胞MCL1的蛋白水平統(tǒng)計圖;(1)與肝細(xì)胞細(xì)胞L-02比較,P<0.05。

2.8 NNT-AS1/MCL1在肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用

將肝癌細(xì)胞株Huh7中NNT-AS1沉默后,再將MCL-1過表達(dá),采用transwell檢測沉默MCL1后細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示,與si-NNT-AS1+oe-NC組比較,si-NNT-AS1+oe-MCL1組Huh7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。提示MCL-1能夠恢復(fù)NNT-AS1沉默對肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的抑制。

注：A為transwell轉(zhuǎn)移與侵襲圖(結(jié)晶紫染色,×200),B為各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析,C為各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析;(1)與si-NNT-AS1+oe-NC組比較,P<0.05。

3 討論

肝癌細(xì)胞具有很強的轉(zhuǎn)移能力,并且在早期階段患者是沒有明顯癥狀的,一般發(fā)現(xiàn)時已有伴有淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[14-15]。而肝癌的致病原因難以追蹤,因而探究肝癌發(fā)生進(jìn)程中的分子機(jī)制以及研發(fā)出具有廣譜性的分子靶點和治療藥物是目前亟待解決的問題。隨著高通量RNA測序和生物信息學(xué)分析的發(fā)展,已經(jīng)報道了許多新發(fā)現(xiàn)的lncRNA在多種腫瘤發(fā)生過程中起癌基因或抑癌作用。例如,lncRNA SNHG1在肝癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào),并通過抑制miR-195促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖,侵襲和遷移[16]。LincRNA-p21在肝癌組織和細(xì)胞中被下調(diào),而lincRNA-p21的表達(dá)增強可以抑制Notch信號和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。miRNA是細(xì)胞正常發(fā)育過程中決定細(xì)胞命運的重要因素[18-19],MCL-1是一種獨特的抗凋亡Bcl2家族蛋白,在控制癌細(xì)胞凋亡和生存方面起著看門人的作用,目前已在多種癌癥中觀察到MCL-1受體及其配體在腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)[20]。目前多個報道證實,LncRNA NNT-AS1在癌癥中異常高表達(dá),且通過吸附miRNA,調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá),對腫瘤細(xì)胞生命活動發(fā)揮其影響。本研究選擇正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B,檢測NNT-AS1在正常細(xì)胞和5種肝癌細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)NNT-AS1在五種癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞表達(dá)明顯較高。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和生信分析,NNT-AS1可結(jié)合并吸附miR-582-5p,通過實驗發(fā)現(xiàn),miR-582-5p在5種癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞表達(dá)明顯較低,隨后干擾NNT-AS1并且過表達(dá)miR-582-5p發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞Huh7的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯被抑制,且同時作用時,抑制作用更強。為進(jìn)一步探討miR-582-5p下游的調(diào)控機(jī)制,通過生信預(yù)測到MCL-1是miR-582-5p的下游靶基因,并且從多個已發(fā)表文獻(xiàn)來看,MCL-1在腫瘤中高表達(dá),通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CMCL-1是miR-582-5p的下游靶基因,兩者之間確實存在靶向關(guān)系,并且通過將肝癌細(xì)胞株Huh7中NNT-AS1沉默后,將MCL-1過表達(dá),發(fā)現(xiàn)MCL-1能夠恢復(fù)肝癌細(xì)胞Huh7的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這與之前所報導(dǎo)的文獻(xiàn)結(jié)果一致。

本研究證明NNT-AS1可結(jié)合并吸附miR-582-5p介導(dǎo)MCL-1來抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此次研究,進(jìn)一步闡明了肝癌的發(fā)展機(jī)制和分子網(wǎng)絡(luò),為臨床肝癌的靶向治療和分子藥物的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。為進(jìn)一步確認(rèn)以上結(jié)果,還需進(jìn)一步進(jìn)行MCL-1的功能回補實驗和動物實驗。然而,到目前為止,MCL-1與肝癌之間的聯(lián)系還沒有被完全解釋清楚,LncRNA NNT-AS1對肝癌的影響是否還有其他路徑,MCL-1是通過何種分子機(jī)制實現(xiàn)對肝癌細(xì)胞發(fā)生影響目前尚未探究清楚,后續(xù)還有很多工作亟待開展。