邵金奇, 姚旌

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 疼痛科, 貴州 貴陽 550004)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)多見于交通事故、跌倒、違規(guī)或運動損傷,近年來脊髓損傷的發(fā)生率呈逐年升高趨勢[1],中樞性疼痛是脊髓損傷的頑固性并發(fā)癥之一,嚴重影響患者傷后的運動康復及感覺功能的恢復。由于脊髓損傷后造成的中樞性疼痛機制至今尚未完全清楚[2],因此缺乏有效的治療措施,主要以心理治療、手術治療、藥物治療等綜合治療為主,但是效果往往不理想[3]。本課題組在前期研究中發(fā)現星狀神經節(jié)阻滯對外周組織中促炎癥因子的釋放具有調節(jié)作用[4-5],亦有研究報道中樞神經系統(tǒng)的促炎癥因子在中樞性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[6]。本研究通過觀察星狀神經節(jié)阻滯對中樞性疼痛模型大鼠疼痛行為的影響,同時檢測模型大鼠脊髓組織中白細胞介素-1β(interleu-kin-1β,IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

C2500-R-230V微型高速離心機(美國Labnet公司生產),ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE生產),Multiskan MK3全自動酶標儀(Thermo scientific生產),YLS-6B智能熱板儀(北京眾實科技有限公司)。大鼠白細胞介素-6(interleukin,IL-6)、IL-1β、TNF-α、酶聯免疫吸附測定試劑盒(Elabscience生產)。

1.2 研究方法

1.2.1動物與分組 選取112只SPF級成年SD雄性大鼠,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,體質量200～250 g,許可證號SCXK(遼)2015-0001、SCXK(遼)2020-0001,在(23±1)℃、濕度(50±10)%的房間內,接受12 h/12 h的明暗環(huán)境適應性喂養(yǎng)2周,自由飲水和安全飲食,所有操作均符合動物倫理要求及實驗動物使用原則。大鼠適應性喂養(yǎng)兩周后,隨機分成空白組(不做任何處理)、假手術組(手術,但不損傷硬脊膜)、模型組(手術鉗夾法脊髓損傷造模)及治療組(手術造模后行星狀神經阻滯),每組28只。模型組、假手術組、治療組于造模成功后每天3次膀胱擠壓排尿直至排尿反射恢復5～7 d。各組動物如有死亡及時補充,保證每組28只。

1.2.2中樞性疼痛模型的制備 采用SCI手術制備大鼠中樞性疼痛模型[7-8]:模型組大鼠用4 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔內注射麻醉后,確定 T10部位,俯臥位固定,以T10為中心行后正中縱切口2～3 cm,手術將T9～T11椎板及棘突摘除并顯露硬膜兩側緣,同時注意保證硬脊膜完整性;手術區(qū)域止血后,用止血夾(標定力為100 g)完全鉗夾脊髓1 min,松開止血夾,可見鉗夾處硬脊膜出現鮮紅血腫,止血、消毒傷口、縫合傷口;術后使用烤燈取暖,至實驗大鼠自然蘇醒。脊髓損傷造模成功的標志:鉗夾部位脊髓損傷節(jié)段處硬脊膜充血水腫,尾巴出現痙攣性擺動,雙下肢及軀干出現遲緩性痙攣或抽搐擺動。假手術組僅咬除T9～T11椎板,顯露硬脊膜后,止血、消毒、縫合傷口。通過熱痛敏潛伏期縮短判斷大鼠脊髓損傷造模成功,通過脊髓損傷模型大鼠疼痛程度的加重判斷中樞性疼痛的造模成功。

1.2.3星狀神經節(jié)阻滯方法 治療組,大鼠脊髓損傷術后行全頸部備皮,碘伏消毒頸部正中切口,分離氣管右側結締組織,于右側頸總動脈分叉處背側面找到梭型的頸上神經節(jié), 在其斜向外下方約3 mm處見一個淡黃色團塊,即為頸交感神經干(右星狀神經節(jié)),將其近心端離斷,最后消毒、縫合傷口。造模成功的標志:大鼠清醒后出現典型的霍納綜合征,如右側眼瞼持續(xù)下垂、瞳孔縮小、眼裂變窄等[9-12]。

1.3 行為學觀察及運動功能學評價

1.3.1行為學觀察 術后第6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d及14 d時觀察大鼠對其后肢和身體尾部皮膚修飾、搔抓、舔咬及自發(fā)嘶叫等過度自殘行為,同時測定大鼠熱痛敏潛伏期(paw withdrawal latencies,PWL)。

1.3.2運動功能學評價 參照脊髓損傷評分標準(basso beattie bresnahan,BBB)運動功能評分進行雙盲測量評分[13]。BBB評分分為3個部分:第一部分為0～7分,評判雙下肢各個關節(jié)的活動;第二部分為8～13分,評判雙下肢步態(tài)的協(xié)調能力;第三部分為14～21分,評判運動中爪的精細動作能力[14]。將各組大鼠放置于100 cm×100 cm的開放區(qū)域內,觀察大鼠雙下肢肢體活動及評分。脊髓損傷后,模型組和治療組大鼠蘇醒后雙下肢呈遲緩性癱瘓、BBB評分<2分,說明造模成功,采用BBB評分對大鼠脊髓損傷后14 d內的后肢運動功能進行評估,正常為21分、后肢癱瘓為0分。

1.3.3PWL測定 PWL采用智能熱板儀進行測量,在室溫條件下,將熱板溫度設定在(50±0.2)℃,然后所有大鼠均于造模成功后第5、7 及14 d時分別置于底部3 mm厚熱板的透明玻璃罩中,并將大鼠雙前肢用細線固定使其脫離熱板表面,待其雙后肢足底貼附于熱板上時助手快速按下計時器按鈕,記錄大鼠從開始到出現縮足反應的時間,每只大鼠測量3次,每次間隔時間為5 min,取其平均值即為PWL;為防止燙傷,單次測定時間≤30 s。

1.3.4標本采集 造模后于6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d、14 d時,每組大鼠各4只麻醉成功后迅速取出T10損傷節(jié)段脊髓約6 mm,均分為2段,一段用于HE染色、另一段制備脊髓勻漿用于IL-1β、IL-6、TNF-α檢測。

1.3.5IL-1β、IL-6、TNF-α檢測 組織放入勻漿器中,以0.1 g∶0.9 mL冰生理鹽水制備脊髓組織勻漿液,以3 000 r/min離心10 min,取上清液分為3管,采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平,按試劑盒說明書操作,在450 nm波長測量吸光度(A),再根據標準曲線求出各標本中IL-1β、IL-6、TNF-α的實際濃度。

1.3.6HE染色 將脊髓標本固定于4 %多聚甲醛中12 h后,脫水、包埋、切片等處理,切片厚度約3 cm、HE染色,并于光學顯微鏡(×200)下觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 行為學和運動功能學評分

術后6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d、14 d時,假手術組大鼠后肢運動功能完全恢復;與假手術組比較,模型組大鼠后肢運動功能均受損,但隨著時間的延長后肢運動功能逐漸改善,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1);與模型組比較,治療組大鼠在各時點后肢運動功能改善均優(yōu)于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠術后各時點BBB評分

2.2 PWL

術后5 d、7 d、14 d時,空白組與假手術組大鼠PWL比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而模型組與治療組大鼠PWL均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與假手術組比較,模型組大鼠PWL降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1);與模型組比較,治療組大鼠PWL增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與假手術組比較, P<0.01;(2)與模型組比較, P<0.05。

2.3 IL-1β、IL-6、TNF-α含量

術后6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d、14 d時,假手術組大鼠脊髓組織勻漿中各炎癥因子水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組同時點比較,模型組大鼠在7個時點IL-1β、IL-6及TNF-α含量均出現不同程度的升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001或P<0.000 1);與模型組同時點比較,治療組大鼠在7個時點IL-1β、IL-6及TNF-α含量均低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為組織勻漿中IL-1β水平,B為組織勻漿中IL-6水平,C為組織勻漿中TNF-α水平;(1)與假手術組比較, P<0.01;(2)與模型組比較, P<0.05。

2.4 組織學改變

空白組和假手術組脊髓組織未見出血壞死及組織水腫現象。術后24 h時,模型組和治療組大鼠脊髓灰白質分界不清,灰質區(qū)域見片狀出血、組織水腫及細胞核固縮,但治療組較模型組稍輕微;術后第14天時,模型組和治療組大鼠受損部位脊髓組織的白質區(qū)域見明顯的壞死后形成的囊腔,但治療組較模型組囊腔稍小。見圖3。

注：A為空白組,B為假手術組,C為模型組術后24 h,D為模型組術后14 d,E為治療組術后24 h,F為治療組術后14 d。

3 討論

近年來,炎癥因子反應機制是中樞性疼痛的重要發(fā)病機制之一[15],過度的炎癥反應因子的釋放會加重中樞性疼痛的發(fā)生。已有研究表明,在急性脊髓損傷的早期,會釋放大量IL-1β、IL-6和TNF-α等多種炎性細胞因子[16-17],促使大部分的膠質細胞呈促炎M1型轉化,并聚集于脊髓損傷部位,分泌更多的炎性細胞因子,形成級聯瀑布效應,進一步加重局部炎癥反應,破壞殘存的神經元,形成脊髓空洞和膠質瘢痕,從而加重中樞性疼痛的發(fā)生。此外大量的研究結果顯示中樞神經系統(tǒng)中的炎癥反應機制和免疫機制共同參與神經病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展,當神經系統(tǒng)受到損傷時,機體的免疫細胞和炎癥細胞就會激活并產生和釋放多種炎癥因子,進一步使外周感受器的敏感性增加及傷害感受器的敏化,從而出現異常性疼痛及痛覺過敏[18]。研究表明,當敲除小鼠體內IL-1β后,其疼痛敏感性降低,但是對敲除IL-1β的小鼠神經損傷處注射外源性IL-1β時,則引起顯著的痛覺過敏[19]。Garraway等[20]通過建立脊髓損傷大鼠模型中發(fā)現脊髓損傷后TNF-α表達會增加,進而導致疼痛行為的發(fā)生。亦有學者發(fā)現在發(fā)生中樞性疼痛24 h內IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子會大量產生并加重神經病理性疼痛的發(fā)展[21-22]。此外,Fiore等[23]報道,在神經病理性疼痛模型中,干擾促炎性細胞因子或使用IL-1β、IL-6和TNF-α的阻滯劑均顯示出減輕痛覺過敏的作用。因此本次研究在造模成功后,即刻予以星狀神經節(jié)阻滯治療,從而減輕炎癥反應的發(fā)生發(fā)展,達到治療脊髓損傷后中樞性疼痛的目的。在此次實驗中,本研究發(fā)現治療組及模型組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α較假手術組明顯升高,同時其PWL也較假手術組大鼠降低,說明脊髓損傷后IL-1β、IL-6和TNF-α的含量會增加,同時伴隨著痛覺過敏的發(fā)生。星狀神經節(jié)又被稱作頸胸交感神經節(jié),是由C6-C7發(fā)出的頸下交感節(jié)以及T1交感神經節(jié)融合形成的。星狀神經節(jié)阻滯(stellate ganglion block,SGB)屬于一種臨床治療方法,將局部麻醉藥物注射在頸部交感神經或附近組織,局麻藥液彌散至支配頭面部、頸部、上肢及胸部的交感神經纖維即可進行有效的阻斷[24],能夠對機體內分泌系統(tǒng)、自主神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等積極的調節(jié),確保動態(tài)平衡狀態(tài)。Liu等[25]通過臨床試驗研究發(fā)現,早期對嚴重創(chuàng)傷病人進行SGB后,觀察到血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量較對照組顯著降低,提示SGB可通過抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表達從而參與調節(jié)早期炎癥反應。此外也有學者研究顯示,對帶狀皰疹后遺神經痛的患者予SGB治療后,其疼痛強度及持續(xù)時間均得到有效改善[24],故認為是由于SGB抑制了交感神經活性,從而增加了組織血流量,減輕炎癥反應,進一步降低了中樞敏化的發(fā)生。同時本課題組在前期研究中[4-5],也發(fā)現SGB能調節(jié)自主神經系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),有效改善外周炎癥反應,擴張外周血管,帶走體內炎癥介質或致痛物質,有效改善周圍性神經病理性疼痛的作用,因此被用于各類疼痛的治療,并且療效甚佳,如帶狀皰疹后遺神經痛、缺血性腦疾病、復雜區(qū)域疼痛綜合征、頸肩部疼痛等[26-27];但對于治療中樞性疼痛方面的研究報道目前較少,本研究通過構建中樞性疼痛模型研究SGB對中樞性疼痛的治療效果,并通過實驗證明了脊髓損傷后IL-1β、IL-6和TNF-α含量增加以及PWL縮短。與模型組比較,經過SGB治療后IL-1β、IL-6和TNF-α含量有所降低以及PWL有所改善,從而證明了SGB可降低受損脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,并推測降低IL-1β、IL-6和TNF-α含量后可減輕疼痛過敏的發(fā)生。本實驗通過脊髓損傷獲得中樞性疼痛模型,但由于脊髓損傷后早期大鼠后肢運動功能恢復欠佳,從而影響PWL測定結果,因此本研究于造模成功5 d后進行相關測定。本研究結果顯示,與假手術組相比,模型組大鼠出現不同程度的后肢和身體尾部皮膚修飾、搔抓、舔咬等自噬行為,且PWL縮短及BBB評分降低。但對中樞性疼痛大鼠進行SGB治療后,隨著時間的延長,PWL及BBB評分有所改善,根據該結果推測可能是SGB后IL-1β、IL-6和TNF-α的表達減少,從而降低了大鼠對傷害感受器的敏感性,減少了痛覺過敏的發(fā)生,因此加快了運動功能的恢復。與模型組比較,治療組大鼠脊髓組織學結構有所改善,提示了SGB治療后也能在一定程度上加速脊髓組織學結構的恢復,也能緩解中樞性疼痛的嚴重程度;此外通過分析模型組或治療組大鼠各個組間IL-1β、IL-6和TNF-α的變化趨勢,可以看出3種炎癥因子在造模后24 h左右存在一個高峰期,并隨著時間的延長,其含量會隨之降低,該結果也提示了對中樞性疼痛的治療時機盡量在炎癥因子高峰期前,盡早對脊髓損傷進行干預治療。

綜上所述,SGB可減輕中樞性疼痛模型大鼠的脊髓損傷及改善脊髓功能,其機制可能與降低脊髓損傷局部組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量有關。此次研究結果提示,SGB可作為脊髓損傷后中樞性疼痛大鼠的一個治療措施,但其治療作用與脊髓損傷后產生中樞性疼痛的具體轉導通路及作用機制仍有待進一步研究。