陳茜, 王海燕, 劉憲, 劉佳

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科, 陜西 西安 710061; 2.陜西省腫瘤醫(yī)院 胸外科, 陜西 西安 710061)

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢,嚴(yán)重威脅女性健康[1]。目前,對宮頸癌仍采用以手術(shù)和放療為主、化療為輔的綜合治療方法,其中化療主要用于晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者。近年也采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)前新輔助化療可縮小腫瘤病灶及控制亞臨床轉(zhuǎn)移、亦可用于放療增敏,順鉑為常用化療藥物之一[2-3]。宮頸癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性會嚴(yán)重地影響化療藥物的治療效果。因此,探討預(yù)測宮頸癌化療敏感性的生物學(xué)指標(biāo),增強(qiáng)化療藥物敏感性,尋求逆轉(zhuǎn)化療耐藥的新方法及靶向治療為宮頸癌化療耐藥的處理提供新的思路。EZH2是多梳家族蛋白(polycomb-group proteins,PcGs)的重要組分,被認(rèn)為與多種癌癥類型有關(guān),其突變、擴(kuò)增和、或過表達(dá)與癌癥進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。有研究表明EZH2的高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥,如在乳腺癌中EZH2 過表達(dá)降低了腫瘤細(xì)胞對他莫西芬的藥物敏感性[7],靶向作用于EZH2可能成為解決癌治療化療耐藥的一個新策略。關(guān)于EZH2 在宮頸癌化療耐藥中的作用和機(jī)制研究較少,本研究通過在宮頸癌細(xì)胞中抑制或過表達(dá)EZH2基因,觀察其對宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥功能的影響及可能機(jī)制,為宮頸癌的化療耐藥問題提供理論支持,增強(qiáng)化療藥物敏感性,報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa購于美國ATCC細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific),胎牛血清(美國Hyclone),青霉素、鏈霉素、MTT(美國Sigma),順鉑(山東齊魯制藥),GSK343(上海Selleck,工作濃度10 umol/L),Lipofectamine2000(美國Invitrogen),EZH2-sh質(zhì)粒及其control 質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)公司),兔抗人EZH2單克隆抗體(美國CST),鼠抗人單克隆抗體ABCG2和GAPDH(美國Santa Cruz),二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Heraeus),光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS),酶標(biāo)儀(美國Epoch)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書將構(gòu)建的EZH2真核表達(dá)質(zhì)粒和對照轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞、EZH2 shRNA和對照轉(zhuǎn)染至HeLa和SiHa細(xì)胞,篩選穩(wěn)定的陽性克隆細(xì)胞,用Western blot鑒定作為實驗的工具細(xì)胞[8]。

1.2.2宮頸癌細(xì)胞對腫瘤藥物順鉑的耐藥性 將處于對數(shù)生長期過表達(dá)或干擾EZH2的細(xì)胞通過胰酶消化后,制成單細(xì)胞懸液,按照4×104(或1×104)的細(xì)胞濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入200 μL 的培養(yǎng)基,待細(xì)胞貼壁后、更換為含有不同濃度包括3、6、12、24、48 mg/L(或4 mg/L)順鉑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)48 h(或24 h、48 h、72 h)后,吸棄各孔內(nèi)的培養(yǎng)基,分別加入5 g/L MTT(100 μL),37 ℃孵育4 h后吸棄各孔中的上清液,分別加入DMSO(100 μL),于搖床震蕩10 min后,用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處每孔的光密度值(D),每組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP建立 將處于對數(shù)生長期的HeLa(SiHa)細(xì)胞通過胰酶消化后接種于35 mm培養(yǎng)皿中,細(xì)胞密度生長至50%時,加入0.1 mg/L順鉑持續(xù)處理15 d時、分別于0.2、0.3、0.4、0.5(SiHa細(xì)胞0.4、0.8、1、2)mg/L的順鉑中培養(yǎng)1周,獲得穩(wěn)定生長且對順鉑耐藥的細(xì)胞株分別命名為HeLa-DDP和SiHa-DDP細(xì)胞,以終濃度為0.5(SiHa細(xì)胞 2)mg/L順鉑中長期培養(yǎng),以維持細(xì)胞的耐藥性。

1.2.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR) TRIzol 法提取細(xì)胞中的總RNA、并反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR,GAPDH為內(nèi)參。引物序列:GAPDH-F為GCACCGTCAAGGCTGAGAAC,GAPDH-R為TGGTGAAGACGCCAGTGGA,ABCG2-F為CAAGAGCAGGCAGGAAGGAA,ABCG2-R為GTGTGACGCTGGAAGCAAAG,EZH2-F為TGCGACTGAGACAGCTCAAG,EZH2-R為GCGCAATGAGCTCACAGAAG。按照SYBR?Premix Ex TaqTM說明書操作,反應(yīng)條件為Step1(1 Cycle)95 ℃ 30 s,Step2(40 Cycles)95 ℃ 5 s 60 ℃ 30 s,Step3 Dissociation(1 Cycle),實驗重復(fù)3次。

1.2.5Western blot 分析 從細(xì)胞中提取蛋白,以BCA 蛋白定量法測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳,應(yīng)用Bio-Rad濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,加入5%脫脂牛奶稀釋的一抗(1∶1 000 稀釋的兔抗人EZH2、鼠抗人ABCG2和鼠抗人GAPDH抗體)在4 ℃孵育過夜,與相應(yīng)的1∶10 000 稀釋的二抗在室溫孵育1 h,加ECL 發(fā)光劑,用Western Blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)一體機(jī)進(jìn)行曝光,采用ImageJ2×軟件進(jìn)行吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EZH2對順鉑IC50的影響

抑制EZH2 蛋白表達(dá)后,在HeLa與SiHa細(xì)胞中順鉑的IC50 低于對照組;HeLa細(xì)胞中過表達(dá)EZH2后,IC50高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為HeLa-shEZH2細(xì)胞活力所占百分比,B為SiHa-shEZH2細(xì)胞活力所占百分比,C為HeLa-EZH2細(xì)胞活力所占百分比;(1)與對照組比較,P<0.05。

2.2 EZH2對宮頸癌細(xì)胞增殖率的影響

4 mg/L順鉑處理72 h后,HeLa-shEZH2組細(xì)胞活力率低于對照組;處理48 h后,SiHa-shEZH2組細(xì)胞活力率低于對照組;而處理72 h后,HeLa-EZH2組細(xì)胞活力率高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為HeLa-shEZH2細(xì)胞增殖率,B為SiHa-shEZH2細(xì)胞增殖率,C為HeLa-EZH2細(xì)胞增殖率;(1)與對照組比較,P<0.05。

2.3 EZH2抑制劑GSK343增強(qiáng)過表達(dá)細(xì)胞對順鉑的敏感性

10 μmol/L GSK343+ HeLa-EZH2組順鉑IC50低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);順鉑處理48 h后,10 μmol/L GSK343+ HeLa-EZH2組細(xì)胞活力率低于HeLa-EZH2組。見圖3。提示GSK343是一種有效的、選擇性EZH2抑制劑。

注：A為GSK343+HeLa-EZH2細(xì)胞活力所占百分比,B為GSK343+HeLa-EZH2細(xì)胞增殖率;(1)與對照組比較,P <0.05。

2.4 ABCG2和EZH2 mRNA的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示,與對照組比較,抑制EZH2表達(dá)后,ABCG2的mRNA水平降低;過表達(dá)后其mRNA水平升高;在HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2的mRNA表達(dá)均高于對照組;在HeLa-DDP和SiHa-DDP中ABCG2的mRNA表達(dá)也高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為改變EZH2細(xì)胞表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中ABCG2 mRNA水平,B為HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2和ABCG2 mRNA水平,GAPDH為內(nèi)參;與對照組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.5 ABCG2和EZH2蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,與對照組比較,抑制EZH2表達(dá)后,ABCG2的蛋白水平降低;過表達(dá)后其蛋白水平升高; 在HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2和ABCG2的蛋白表達(dá)均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：A、B為改變EZH2細(xì)胞表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中ABCG2 蛋白水平,C、D為HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2和ABCG2蛋白水平;(1)與對照組比較,P <0.01。

3 討論

宮頸癌是次于肺癌、乳腺癌的第三大女性常見惡性腫瘤,早期以手術(shù)治療為主,有高危因素者術(shù)后需補(bǔ)充放化療;中晚期患者以同步放化療為主。對于復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)移性、難治性宮頸癌患者,化療是常用的姑息治療手段,因此化療在宮頸癌的治療中越來越重要,然而隨著腫瘤化療耐藥性的產(chǎn)生,耐藥已經(jīng)成為導(dǎo)致化療失敗、疾病復(fù)發(fā)的主要原因。探討預(yù)測宮頸癌化療敏感性的生物學(xué)指標(biāo),增強(qiáng)化療藥物敏感性,逆轉(zhuǎn)化療耐藥及靶向治療將為宮頸癌化療耐藥的治療提供新的前景[9-12]。研究表明,腫瘤細(xì)胞系中EZH2 擴(kuò)增可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和血管生成,并導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。雖然不同腫瘤中EZH2 的作用方式及機(jī)制不同,但是該基因存在往往預(yù)示著癌癥預(yù)后不佳[13-16]。EZH2 作用于抗腫瘤藥物敏感基因,可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。在小細(xì)胞肺癌中,CDYL/EZH2/CDKN1C 軸促進(jìn)了小細(xì)胞肺癌的化療耐藥,應(yīng)用EZH2 抑制劑GSK126聯(lián)合化療能夠一定程度上克服耐藥,從而提高患者受益[17]。在肝細(xì)胞癌,EZH2-miRNA-IGF1 R 調(diào)節(jié)軸可能通過改變患者體內(nèi)miRNA 的變化,改變IGF1 R 的表達(dá),從而介導(dǎo)索拉非尼耐藥。應(yīng)用IGF1 R 抑制劑可顯著逆轉(zhuǎn)EZH2 誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥[18]。順鉑,是一種含鉑的細(xì)胞非特異性抗癌藥物,能與DNA結(jié)合,引起交叉聯(lián)結(jié),從而破壞DNA的功能,并抑制細(xì)胞有絲分裂[19]。本研究結(jié)果表明,抑制EZH2表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對順鉑敏感性而降低其耐藥性,表現(xiàn)為順鉑的IC50降低,細(xì)胞增殖抑制率顯著增加。應(yīng)用EZH2抑制劑GSK343于過表達(dá)EZH2細(xì)胞,能夠提升細(xì)胞對順鉑的敏感性。結(jié)果說明EZH2基因參與宮頸癌對順鉑的耐藥。為闡明EZH2影響宮頸癌對順鉑耐藥的分子機(jī)制,接著建立對順鉑耐藥的HeLa、SiHa細(xì)胞耐藥細(xì)胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP,進(jìn)一步分析效應(yīng)分子變化。ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族耐藥蛋白之一,其功能是將大部可能分的化療藥泵出細(xì)胞外,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度降低,參與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性[20]。研究發(fā)現(xiàn)ABCG2與結(jié)直腸癌[21]、乳腺癌[22]耐藥密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,抑制EZH2后,ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低;過表達(dá)后明顯升高。HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2、ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高,說明EZH2 可能通過調(diào)控細(xì)胞耐藥基因ABCG2誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞對順鉑的耐藥。

綜上所述,EZH2基因可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞耐藥基因ABCG2的表達(dá)而調(diào)控著順鉑對宮頸癌化療的敏感性。而作用的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究,EZH2有望成為宮頸癌化療耐藥的作用靶點(diǎn)。