文波, 羅芳, 付凌云, 徐旖旎, 陶玲, 張?zhí)? 林浩恒, 沈祥春**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 &貴州省高等學(xué)校天然藥理與成藥性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 貴州 貴陽(yáng) 550001)

糖尿病(diabetic mellitus, DM)是一種在全球范圍內(nèi)廣泛流行的體內(nèi)胰島素的相對(duì)或絕對(duì)分泌不足引起的糖、脂及蛋白質(zhì)代謝紊亂,伴有多種并發(fā)癥且尚無(wú)法根治的內(nèi)分泌疾病[1-4],其中2型糖尿病占DM總發(fā)病率的90%[5]。DM的病理生理機(jī)制主要包括胰島細(xì)胞受損和胰島素抵抗兩個(gè)方面。NIT-1細(xì)胞是胰島細(xì)胞的一種,通過(guò)分泌胰島素調(diào)節(jié)機(jī)體血糖,在DM的形成中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。胰島功能受損是2型糖尿病的主要特征之一[6],四氧嘧啶通過(guò)產(chǎn)生超氧自由基選擇性地破壞NIT-1細(xì)胞,使其數(shù)目減少、功能受損,從而胰島素分泌減少,進(jìn)一步導(dǎo)致DM的產(chǎn)生。因此,抑制胰島細(xì)胞數(shù)量減少和恢復(fù)胰島正常功能對(duì)治療DM及減少并發(fā)癥的發(fā)生有著重要作用。艷山姜源于姜科植物艷山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt.et Smith的干燥成熟果實(shí),主要含有揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)和二萜類(lèi)等成分[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室以往研究證實(shí),艷山姜揮發(fā)油(essential oil from fructusalpiniaezerumbet, EOFAZ)具有廣泛的抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗高尿酸等心血管藥理活性[9-14]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合DM發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵細(xì)胞的病變特征,探討EOFAZ對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)NIT-1胰島細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及可能的機(jī)制,以期為貴州民族藥艷山姜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠胰島細(xì)胞(NIT-1)株購(gòu)自于美國(guó)American Type Culture Collection公司。

1.1.2藥物 利用水蒸氣蒸餾法提取EOFAZ后,精密稱(chēng)取30 μL(約29 mg),加二甲基亞砜2.9 mL溶解,配制成10 g/L的母液,0.22 μm微孔濾膜除菌,放置4 ℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成不同濃度給藥。

1.1.3主要試劑 MTT(美國(guó)Sigma),四氧嘧啶(美國(guó)Aldrich),丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase dehydrogenase, LDH)以及胰島素檢測(cè)試劑盒(南京建成),RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶以及RIPA裂解液(美國(guó)Gibco),B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(BCL2-associated X, Bax)以及半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-9)抗體(美國(guó)Cell signaling Technology),羊抗鼠、羊抗兔IgG抗體(美國(guó)Santa Cruz),Z-VAD-FMK抑制劑(上海碧云天),ECL發(fā)光液(美國(guó)Thermo scientific)。

1.1.4主要儀器 SW-CJ2FD雙人單面凈化工作臺(tái)(浙江孚夏),BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊),170-3930垂直電泳系統(tǒng)、CFX凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad),ELX800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)伯騰),5424R低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendorf),CKX53倒置相差顯微鏡(日本Olympus),700-SERIES超低溫冰箱(美國(guó)Thermo scientific),MCO-18AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(蘇州凈化),IMS-50制冰機(jī)(常熟市雪科電器),Milli-Q型純水機(jī)(武漢天恒)。

1.2 研究方法

1.2.1NIT-1細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出NIT-1細(xì)胞立即放入37 ℃水浴中以迅速解凍。隨后接種于培養(yǎng)瓶中,加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37 ℃,5% CO2飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔夜換液。待其生長(zhǎng)約80%,用0.25%的胰酶消化,培養(yǎng)基中和后離心棄上清,計(jì)數(shù)后加新鮮培養(yǎng)基完成傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2四氧嘧啶誘導(dǎo)NIT-1細(xì)胞損傷濃度的篩選 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIT-1細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種到96孔板中,每孔100 μL。培養(yǎng)后24 h換液,待其長(zhǎng)滿(mǎn)后,加入濃度分別為0、1、4、10、20、40、60、80、100 mmol/L的四氧嘧啶,每種濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。各孔加入5 g/L MTT 20 μL,繼續(xù)孵育4 h,棄上清,每孔加 DMSO溶液150 μL,于低速搖床上震蕩10 min,使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值,根據(jù)每孔OD值計(jì)算各組細(xì)胞存活率,確定造模濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算公式如下:細(xì)胞存活率=(給藥組OD值-空白調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白調(diào)零組OD值)×100%。

1.2.3分組與給藥 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果確定EOFAZ的給藥劑量[9,15]。實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基)、模型組(40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ低劑量組(50 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ中劑量組(100 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)以及EOFAZ高劑量組(200 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)。機(jī)制研究分為5組:對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基)、模型組(40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ組(200 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)、Z-VAD-FMK組(10 μmol/L Z-VAD-FMK+40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ+Z-VAD-FMK組(200 μg/L EOFAZ+10 μmol/L Z-VAD-FMK+40 mmol/L四氧嘧啶)。按照對(duì)應(yīng)分組給藥,進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將細(xì)胞接種于96孔板中,待生長(zhǎng)密度約80%時(shí),按照方法“1.2.3”項(xiàng)處理,每組6個(gè)復(fù)孔;隨后按“1.2.2”項(xiàng)下MTT檢測(cè)步驟測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.5生化法檢測(cè)MDA、SOD和GSH-PX的含量 將細(xì)胞接種于96孔板中,按照方法“1.2.3.”項(xiàng)處理。收集細(xì)胞上清液后,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.2.6ELISA法檢測(cè)LDH和胰島素分泌量 將細(xì)胞接種于96孔板中,按照方法“1.2.3”項(xiàng)處理。收集細(xì)胞上清液后,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH的外漏量和胰島素的分泌量。

1.2.7Western Blot檢測(cè)分析Bcl-2、Bax以及Caspase-9蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板中,按照“1.2.3”項(xiàng)處理后,PBS潤(rùn)洗3次棄去孔內(nèi)液體,加入細(xì)胞裂解液與PMSF蛋白抑制劑裂解細(xì)胞,離心后收集上清,BCA法定量,變性分裝后采用SDS-PAGE法進(jìn)行電泳。充分分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,BSA封閉1.5 h,加入稀釋比為1∶1 000的Bax、Bcl-2、Caspase-9、β-actin抗體冰箱孵育過(guò)夜。次日回收一抗,清洗后加稀釋比為1∶10 000的二抗室溫孵育2 h,回收二抗,洗滌3次,ECL顯影,采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像和數(shù)據(jù)分析。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理,計(jì)算蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NIT-1細(xì)胞損傷模型

采用濃度為1、4、10、20、40、60、80、100 mmol/L的四氧嘧啶分別作用于NIT-1細(xì)胞后,細(xì)胞存活率呈濃度依耐性降低。與0 mmol/L的四氧嘧啶組細(xì)胞比較比較,從4 mmol/L四氧嘧啶濃度從4 mmol/L開(kāi)始,之后各濃度組細(xì)胞存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)選擇40 mmol/L(存活率為70.7%)為誘導(dǎo)細(xì)胞最佳損傷濃度。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度四氧嘧啶對(duì)NIT-1細(xì)胞存活率的影響

2.2 EOFAZ對(duì)NIT-1細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較,模型組NIT-1細(xì)胞存活率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,EOFAZ各劑量組NIT-1細(xì)胞存活率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：(1)與對(duì)照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.3 EOFAZ對(duì)NIT-1細(xì)胞MDA、SOD、GSH-PX和LDH水平的影響

與對(duì)照組比較,模型組NIT-1細(xì)胞中MDA和LDH含量增加,SOD和GSH-PX含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,除EOFAZ低劑量組MDA和SOD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05),其余劑量組MDA和LDH含量降低(P<0.05),SOD和GSH-PX含量升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：(1)與對(duì)照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.4 EOFAZ對(duì)NIT-1細(xì)胞胰島素分泌的影響

與對(duì)照組比較,模型組胰島素分泌減少(P<0.05);與模型組比較,EOFAZ各劑量組胰島素分泌增多(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：(1)與對(duì)照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.5 EOFAZ對(duì)NIT-1細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase 9蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,模型組 Bax和Caspase 9蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),Bax/Bcl-2升高(P<0.05);與模型組比較,除EOFAZ低劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05),其余劑量組Bax和Caspase 9蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),Bax/Bcl-2降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A為蛋白條帶圖,B-E分別為Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2及Caspase-9蛋白的定量表達(dá); (1)與對(duì)照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.6 Caspase抑制劑作用下EOFAZ對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)NIT-1細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,模型組Caspase 9蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,EOFAZ組Caspase 9蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與EOFAZ組、Z-VAD-FMK組分別比較,EOFAZ+Z-VAD-FMK組Caspase 9蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A為蛋白條帶圖,B為Caspase-9蛋白的定量表達(dá);(1)與對(duì)照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與EOFAZ組比較,P<0.05;(4)與Z-VAD-FMK比較,P<0.05。

3 討論

胰島細(xì)胞損傷、胰島素分泌不足是導(dǎo)致DM的關(guān)鍵病理過(guò)程。各種因素如外界刺激(如高糖高脂)、炎癥、氧化應(yīng)激等均可引起胰島細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變、細(xì)胞凋亡相關(guān)通路被激活,主要表現(xiàn)為細(xì)胞收縮、體積變小、胞質(zhì)密集、細(xì)胞器和染色質(zhì)聯(lián)系更為緊密、胞核碎裂以及凋亡小體形成[16]。四氧嘧啶是自由基活性劑,主要通過(guò)產(chǎn)生超氧自由基破壞胰島β細(xì)胞導(dǎo)致胰島素合成減少,從而使機(jī)體血糖升高。腹腔給予四氧嘧啶構(gòu)建糖尿病動(dòng)物模型的成功率在90%以上,因此可用于復(fù)制2型糖尿病模型[17-19]。機(jī)體通過(guò)維持氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡保證正常功能。LDH可反應(yīng)細(xì)胞損傷程度,當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí),細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物質(zhì)如ROS、MDA、CAT增多,而抗氧化物質(zhì)如SOD、GSH-PX等減少。本研究發(fā)現(xiàn),EOFAZ干預(yù)后,MDA含量和LDH外漏量具有不同程度減少,而SOD和GSH-PX增多,提示EOFAZ可通過(guò)加強(qiáng)細(xì)胞清除自由基的能力,減少細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,從而發(fā)揮保護(hù)作用。此外,胰島素檢測(cè)結(jié)果表明,EOFAZ作用后,胰島素分泌增多,提示其可通過(guò)減少損傷恢復(fù)胰島細(xì)胞功能促進(jìn)胰島素的釋放。

在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,凋亡蛋白分子發(fā)揮調(diào)控作用,Caspase蛋白的活化是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。Caspase-9是內(nèi)源性或線粒體凋亡途徑的凋亡起始蛋白酶,也是Caspase家族的重要代表,可啟動(dòng)和觸發(fā)內(nèi)在細(xì)胞凋亡信號(hào)然后傳遞到下游,誘導(dǎo)細(xì)胞級(jí)聯(lián)損傷,引起細(xì)胞死亡[20-21]。Bax與Bcl-2屬于同一家族,兩者之間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素[22],當(dāng)細(xì)胞損傷或凋亡時(shí),Bax表達(dá)異常增多,Bcl-2表達(dá)異常減少,從而導(dǎo)致Bax與Bcl-2的比值(Bax/Bcl-2)異常降低。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)EOFAZ預(yù)處理后能明顯增加細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平,減少Bax和Caspase-9凋亡蛋白的表達(dá)水平,且Bax與Bcl-2的比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果也證實(shí)了EOFAZ能改善兩者之間的異常表達(dá)狀態(tài)。為進(jìn)一步明確其作用與抑制凋亡是否相關(guān),本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用了凋亡蛋白有效抑制劑Z-VAD-FMK進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,當(dāng)采用EOFAZ聯(lián)用凋亡蛋白抑制劑后,Caspase-9表達(dá)進(jìn)一步降低。提示EOFAZ可協(xié)同Z-VAD-FMK抑制Caspase-9蛋白表達(dá),證實(shí)EOFAZ抑制四氧嘧啶誘導(dǎo)NIT-1的損傷與抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。盡管當(dāng)前研究對(duì)于EOFAZ保護(hù)NIT-1細(xì)胞損傷的作用和機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí),但仍不深入,是否通過(guò)其他信號(hào)通路發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究,有望有更多發(fā)現(xiàn)其可能具備潛在的降血糖的功能。

綜上所述,EOFAZ對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的NIT-1細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制與提高胰島細(xì)清除自由基的能力和抑制細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。