梁璽, 覃淇, 張藝馨, 袁嘯天, 吳寧, 吳遵秋*, 吳昌學(xué)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 化學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA),一種炎癥性、破壞性、慢性、可侵犯關(guān)節(jié)滑膜組織的疾病[1],主要特點(diǎn)為多關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)血管翳生成、成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖導(dǎo)致滑膜內(nèi)襯層增生,最終引起骨組織破壞和軟骨退化;RA臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫熱痛的炎癥反應(yīng)、功能下降、畸形等[2],世界范圍內(nèi)患病率0.4%～1.3%,患者2年致殘率50%,3年致殘率為70%,現(xiàn)已躍升為醫(yī)學(xué)界的難治疾病[3]。有研究表明,RA患者Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥體軸過(guò)度激活,將產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子引起一系列的炎性反應(yīng),加劇RA病情[4]。NLRP3炎性體(一種多蛋白復(fù)合體),由受體蛋白、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1前體(pro cysteinyl aspartate specific proteinase,pro-Caspase-1)、細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associate speck-like protein, ASC)3部分組成,屬于炎性體軸的關(guān)鍵蛋白并參與人體固有免疫[5];當(dāng)NLRP3炎性體激活,形成ASC斑點(diǎn)或焦亡小體,在自催化活化近距離誘導(dǎo)下,可致Caspase激活,從而促進(jìn)白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β),IL-18等致炎癥因子的成熟及分泌,最終導(dǎo)致周圍組織炎癥反應(yīng)加重[6]。在RA的藥物治療方面,新的生物制劑如托珠單抗、IL-1拮抗劑、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)拮抗劑等,不僅價(jià)格高昂,還易發(fā)生感染等不良反應(yīng);非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、改善風(fēng)濕病情藥物(disease modifying antirheumatic drugs,DMARDs)及糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GCs)等常用臨床治療藥物,則因療效不佳、不良反應(yīng)較明顯等問(wèn)題難以達(dá)到患者的期望[7]。當(dāng)前,從中醫(yī)藥出發(fā),研究療效更顯著、毒副作用更小的新藥日漸成為研究熱點(diǎn)。苗藥驗(yàn)方“四大血”(sidaxue,SX)組成為4味藤本藥材雞血藤(仰嗟嘎,nangx dlob ghat)、黑骨藤(萵蒙棱,vob mongb dlenb)、見(jiàn)血飛(嘎龔布梭學(xué),ghab jongx bel sob xok)及五花血藤(梭向,hsob hx-angt),有通氣散血、行瘀止痛之功[8]。本課題組前期結(jié)果表明,SX給藥后的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠(collagen induced arthritis in rats, CIA)表現(xiàn)出良好的治療療效、關(guān)節(jié)滑膜的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可被明顯抑制、關(guān)節(jié)腫脹得到緩解、IL-1β表達(dá)下調(diào)[9]。本研究以NLRP3炎癥體軸為切入點(diǎn),通過(guò)復(fù)刻CIA模型大鼠,對(duì)比不同劑量SX治療前后大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及病理變化,并分析大鼠滑膜組織的NLRP3及Caspase-1的蛋白及mRNA水平和血清IL-18含量的變化,評(píng)估SX的抗炎效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1藥材來(lái)源 SX組成藥材雞血藤、黑骨藤、五花血藤及見(jiàn)血飛由貴州中醫(yī)藥大學(xué)苗醫(yī)藥教研室提供,經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)田振華副教授鑒定為正品。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 42只8～9 周齡、體質(zhì)量(200±20)g的健康Sprague Dawley(SD)大鼠,雌雄各半,由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXF(黔)2018-0001]。本研究已獲得學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(2200095),且嚴(yán)格遵守倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.1.3主要藥物與試劑 雷公藤多苷片(tripterygium glycosides,GTW;黃石飛云制藥公司),弗式不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司),牛Ⅱ型膠原(美國(guó)Chondrex公司),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、RIPA(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、蘇木素、TRIzol及伊紅由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供,大鼠IL-18 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司),大鼠NLRP3抗體(美國(guó)abcam公司),Caspase-1抗體(華安生物技術(shù)有限公司),辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)-羊抗兔免疫球蛋白G(immune globulin G,IgG;美國(guó)ABclonal公司),高靈敏性染料法定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由南京諾唯贊生物科技有限公司提供,其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 研究方法

1.2.1藥物的制備 取2 000 g苗藥五花血藤、雞血藤、見(jiàn)血飛及黑骨藤組成SX,按15∶22∶15∶8的比例取藥材600 g,加適量水用大火、中火及小火分別煮1 h、30 min及30 min,合并濃縮液500 mL作為受試藥,濃度為4 kg/L(按生藥量計(jì)),質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為每制150 mL;SX水煮液原藥材五花血藤不低于150 g、雞血藤不低于220 g,見(jiàn)血飛不低于150 g及黑骨藤不低于80 g;制備完成的中藥水煎液密封避光,4 ℃冰箱備用(保存1周)。

1.2.2造模及分組 42只SD大鼠于無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,按體質(zhì)量隨機(jī)均分為空白組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組及10 g/kg(低劑量)SX組、20 g/kg(中劑量)SX組、40 g/kg(高劑量)SX組。取適量2 g/L牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑于冰上混合,并完全乳化至其滴于水中不擴(kuò)散;將模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及高、中、低劑量SX組大鼠于尾根部皮下注射乳化劑200 μL誘導(dǎo)免疫反應(yīng),1周后再次注射乳化劑100 μL加強(qiáng)免疫;空白組大鼠于尾根部皮下注射同量生理鹽水。造模期間每日觀察并拍照記錄大鼠關(guān)節(jié)紅腫及畸形等情況,每隔7 d觀察并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分(arthritis index score,AI),AI評(píng)分>2分即可視為造模成功[10]。

1.2.3給藥方案 造模成功2 d后,高、中、低劑量SX組分別按照體質(zhì)量40 g/kg、20 g/kg、10 g/kg給予SX濃縮液4 000 g/L、2 000 g/L、1 000 g/L(按生藥量計(jì)),陽(yáng)性對(duì)照組按體質(zhì)量 40 g/kg給予GTW4 000 g/L,空白組及模型組給予等量生理鹽水(normal saline,NS),1次/d,持續(xù)給藥21 d。

1.2.4一般情況的觀察和AI評(píng)分 給藥期間觀察各組大鼠的飲食量、精神狀態(tài)、踝關(guān)節(jié)形態(tài)、被毛情況及活動(dòng)情況等。分別于造模前1天、灌胃給藥前1天及灌胃給藥1周、2周、3周時(shí),采用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)各組大鼠足趾大小,記錄AI評(píng)分;足趾腫脹指標(biāo)判斷以大鼠造模前后的足趾容積變化為準(zhǔn),雙后足累積得分作為總分。

1.2.5標(biāo)本采集 末次給藥次日,各組大鼠經(jīng)100 g/L水合氯醛麻醉,麻醉處死大鼠,取仰位固定,沿膝關(guān)節(jié)正中將皮膚縱行切開(kāi)、暴露3 cm×3 cm以膝關(guān)節(jié)為中心的區(qū)域,齒鑷提起髕骨,從上緣0.5 cm處沿兩側(cè)向下分離,膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見(jiàn)附著的薄層滑膜組織,呈淡黃色、平滑、光亮,小心剝離后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗,液氮速凍,-80 ℃保存,并提取滑膜組織的總RNA及蛋白供后續(xù)研究。

1.2.6病理組織切片制備 取各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織,中性甲醛固定24 h,常規(guī)梯度脫水后依次進(jìn)行浸蠟、包埋、切片與貼片、脫蠟水化、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,脫蠟水化、脫苯、復(fù)水、常規(guī)梯度染色、梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片,在顯微鏡下觀察滑膜組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)法檢測(cè)血清IL-18的表達(dá) 各組大鼠心臟取血后離心并取上層血清,采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清 IL-18含量,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,配置標(biāo)準(zhǔn)品液,每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品100 μL,洗板后加一抗于37 ℃放置20 min,再次洗板并加酶標(biāo)抗體于37 ℃放置10 min),洗板并加底物工作液于7 ℃放置15 min,最后加終止液并混勻,測(cè)量酶標(biāo)儀450 nm處吸光值。

1.2.8即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)法檢測(cè)滑膜組織NLRP3及Caspase-1 mRNA的含量 取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織勻漿,利用Trizol法提取總RNA并吸取澄清的trizol至新的微型離心管(eppendorf,EP)內(nèi),依次測(cè)定 RNA 樣品濃度、純度,逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)并進(jìn)行 Real-time PCR 擴(kuò)增(反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 30 s、循環(huán) 40 次)。用 2-ΔΔCt法計(jì)算 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量,3次平行實(shí)驗(yàn)后,對(duì)目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)NCBI Primer-blast 網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物,由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成引物,GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列見(jiàn)表 1。

表1 各基因的引物序列

1.2.9Western bolt檢測(cè)滑膜組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá) 取各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織,置于已加放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液2 mL的研磨管,充分研磨,4 ℃靜置裂解30 min,4 ℃下12 000 r/min 離心15 min取上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度;依次制備10%聚丙烯酰胺凝膠,上樣20 μg,80～120 V電泳2 h,300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h,5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜,HRP 辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,經(jīng)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)工作液顯色及曝光成像。采用條帶分析軟件處理?xiàng)l帶,并計(jì)算灰度值,蛋白的表達(dá)量為條帶與各組內(nèi)參β-actin灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 足趾外觀及雙后肢足腫脹度的AI評(píng)分

CIA大鼠足趾外觀結(jié)果顯示,給藥21 d后,各給藥組較模型組大鼠雙后肢紅腫情況存在不同程度的降低,其雙后肢膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)和趾間關(guān)節(jié)紅腫均有不同程度的減輕。給藥前,空白組的AI評(píng)分為0分,其余各組AI評(píng)分均為4分;根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(達(dá)2分及以上即可判斷造模成功)可判斷本次造模情況達(dá)標(biāo)。連續(xù)灌胃給藥1周后,高、中劑量SX組大鼠雙后肢足腫脹度較模型組下降(P<0.05);灌胃給藥2周后,各劑量SX和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠后肢腫脹程度較模型組均有較多降低(P<0.05);到給藥3周時(shí),各劑量SX和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠雙后肢足腫脹度和足趾外觀表現(xiàn)較模型組均有明顯減小(P<0.05)。且除模型組AI評(píng)分為3分,其余各組均為0分(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

空白組 陽(yáng)性對(duì)照組 模型組 低劑量SX組 中劑量SX組 高劑量SX組

表2 各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠雙后肢足腫脹度的AI評(píng)分

2.2 組織學(xué)特征

光鏡下觀察時(shí)可見(jiàn),空白組大鼠未見(jiàn)明顯滑膜增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);相比空白組,模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織可見(jiàn)踝關(guān)節(jié)組織軟骨表面粗糙不平、破骨細(xì)胞增多,軟骨細(xì)胞壞死,襯里下層細(xì)胞壞死,襯里層的滑膜細(xì)胞存在壞死或增生,且存在浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞、增生性纖維組織、形成新生毛細(xì)血管等病理改變;與模型組相比,各給藥組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理改變均有所減輕,其中低劑量SX組、中劑量SX組仍可見(jiàn)較多浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞、組織水腫;陽(yáng)性對(duì)照組大鼠浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞明顯減少,表示踝關(guān)節(jié)組織炎癥有一定程度減輕;高劑量SX組大鼠明顯緩解,偶見(jiàn)極少量散在分布的炎性細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

注：綠色、藍(lán)色黃色及橙色箭頭分別表示淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及纖維細(xì)胞。

2.3 血清IL-18水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明(表3),與空白組比較,模型組大鼠血清IL-18水平升高(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和SX高劑量組大鼠的血清IL-18水平下降(P<0.01),SX中、低劑量組大鼠血清IL-18水平下降、但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,SX高劑量組大鼠的血清IL-18水平比較、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠的血清IL-18 水平

2.4 NLRP3和Caspase-1 mRNA的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖3),給藥21 d后,與空白組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA明顯上調(diào)(P<0.01);與模型組比較,高劑量SX組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA下調(diào),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),中劑量SX組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA明顯下調(diào)(P<0.01),SX低劑量組NLRP3 mRNA下調(diào)(P<0.05),提示中、低劑量SX組對(duì)CIA大鼠的NLRP3和Caspase-1 mRNA下調(diào)效果良好。

注：A、B分別為NLRP3和Caspase-1 mRNA的定量表達(dá); (1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與陽(yáng)性對(duì)照組比較,P<0.05。

2.5 NLRP3和Caspase-1蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示(圖4),與模型組比較,空白組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),中、低劑量SX組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),中劑量SX組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)下調(diào)與陽(yáng)性對(duì)照組作用相當(dāng)(P>0.05),提示中劑量SX組對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3和Caspase-1蛋白下調(diào)效果良好。

注：A為Caspase-1、NLRP3蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果,B、C分別為Caspase-1、NLRP3蛋白的定量結(jié)果;(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與陽(yáng)性對(duì)照組比較,P<0.05。

3 討論

RA屬一種自身免疫性疾病,主要病變特征為侵蝕性關(guān)節(jié)炎,最終可導(dǎo)致肢體殘疾,影響生活質(zhì)量[11]。我國(guó)RA患病率約為0.42%[12]。RA基本病理變化為關(guān)節(jié)滑膜炎形成、腔內(nèi)具有浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞、骨侵蝕及軟骨破壞,其中炎癥反應(yīng)是RA主要的發(fā)病機(jī)制之一,多種炎癥因子與之密切相關(guān),促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18及TNF-α等)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是RA滑膜病變發(fā)生發(fā)展的重要原因[13]。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路調(diào)控NLRP3炎癥體軸的激活[14]。有研究表明,RA患者外周血細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的增加表達(dá)[15];小鼠 Caspase-1下游因子焦孔素家族蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)的缺失可以明顯緩解CIA小鼠的滑膜炎和臨床表現(xiàn)[16]。綜合以上表明,RA中存在NLRP3炎癥體軸的過(guò)度激活,但NLRP3炎癥體軸對(duì)RA炎癥反應(yīng)影響的具體機(jī)制仍有待證實(shí)。參與細(xì)胞死亡及炎癥反應(yīng)是Caspase家族主要作用,且炎癥小體在Caspase-1的活化過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[17]。炎癥小體是由pro-Caspase-1蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associate speck-like protein, ASC)、受體蛋白3部分組裝而成的多蛋白復(fù)合體[18];其最具特征的亞型之一是由NLRP3作為受體蛋白的NLRP3炎癥小體,主要依靠結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合激活Caspase-1[19];GSDMD作為Caspase-1下游的關(guān)鍵因子,可直接實(shí)施損傷細(xì)胞,其活性的N端結(jié)構(gòu)可破壞細(xì)胞膜的完整性并形成孔道,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20];pro-IL-18、pro-IL-1β的成熟與活化依賴于Caspase-1的活化,待其分泌至細(xì)胞外,將進(jìn)一步誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子、粘附分子及趨化因子等的合成,從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[21]?；贜LRP3炎癥體軸使用SX治療RA的研究,尚且未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,因此,本研究旨在探究苗醫(yī)驗(yàn)方SX是否能通過(guò)干預(yù)NLRP3炎癥體軸發(fā)揮抗炎作用。苗藥驗(yàn)方SX有4味藤本藥材:見(jiàn)血飛、雞血藤、黑骨藤及五花血藤,具通氣散血、行瘀止痛的功效,是RA治療的貴州苗族地區(qū)特色藥方[18]。從本研究結(jié)果來(lái)看,與空白組相比,模型組大鼠足趾腫脹明顯,組織切片提示滑膜細(xì)胞明顯增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,血清IL-18水平存在明顯上調(diào),滑膜組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA水平和蛋白表達(dá)升高,提示模型制備成功;NLRP3過(guò)度表達(dá)可引起過(guò)度激活NLRP3炎癥體軸的表現(xiàn)。NLRP3炎癥體軸的正常激活可以保護(hù)正常組織器官避免內(nèi)源性損害及感染,過(guò)度激活則可能引發(fā)病理性炎癥[22]。過(guò)度表達(dá)的NLRP3炎癥小體,可激活Caspase-1,促進(jìn)IL-1β、IL-18的成熟與分泌,引起細(xì)胞內(nèi)容物、炎癥因子IL-1β及IL-18的大量釋放,加重周圍組織炎癥反應(yīng);IL-1β的刺激,又可促進(jìn)滑膜細(xì)胞的過(guò)度增殖、血管翳的形成[23]。經(jīng)過(guò)SX或GTW治療后,大鼠足趾腫脹度相對(duì)改善,關(guān)節(jié)滑膜組織中的細(xì)胞增生程度較輕,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,提示SX可抑制RA中的炎癥反應(yīng),其中四大血高劑量組較低、中劑量組炎癥反應(yīng)緩解更加明顯;與模型組相比,四大血中劑量組大鼠滑膜組織的NLRP3、Caspase-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯下調(diào),其余治療組表達(dá)輕度下調(diào);四大血陽(yáng)性對(duì)照組及高劑量組血清中IL-18水平降低;可見(jiàn)SX具有抑制NLRP3炎癥小體的可能,從而抑制NLRP3炎癥體軸的激活[24]。

綜上所述,CIA大鼠滑膜組織的炎性增生可能與過(guò)度激活的NLRP3炎癥體軸有關(guān);SX可下調(diào)NLRP3表達(dá),減弱了NLRP3炎癥信號(hào)通路的活化,下游Caspase-1的表達(dá)則被抑制,從而緩解RA大鼠滑膜組織中被過(guò)度激活的NLRP3炎癥體軸、抑制滑膜炎癥,起到治療RA的作用。因此,本研究提示SX減輕炎性癥狀的作用與NLRP3炎癥體軸密切相關(guān),具有重要的藥用價(jià)值。同時(shí),為SX治療RA的作用靶點(diǎn)的研究搭建了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但仍需進(jìn)一步深入研究具體機(jī)制。