陳璐, 倪明, 王力, 潘成云, 亢倩, 詹雲(yún), 趙鵬, 王季石,3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科, 貴州 貴陽 550001; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽 550004; 3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 國家血液病臨床研究中心, 江蘇 蘇州 215006)

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)術(shù)后可發(fā)生多種并發(fā)癥,其中較典型且嚴(yán)重的為移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GvHD)[1-3],Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ度急性GvHD(acute GvHD, aGvHD)患者的3年生存率分別為54%和26%[4]。隨著免疫學(xué)研究的不斷進(jìn)展,有學(xué)者認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)療法取代目前的免疫抑制療法是未來aGvHD治療所追求的目標(biāo)[5]。髓系來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群具有免疫抑制性的髓細(xì)胞,最主要的功能是抑制由固有免疫和獲得性免疫介導(dǎo)的反應(yīng)[6]。大量研究表明,MDSCs已成為癌癥、感染、慢性炎癥及自身免疫性疾病中的主要免疫抑制細(xì)胞,提示MDSCs可能有助于控制GvHD[7-8]。目前,針對各亞型MDSCs通過不同機(jī)制預(yù)防及控制aGvHD的研究基本僅限于動物模型[9-10],體外實驗也僅限于現(xiàn)象學(xué)觀察,缺乏相關(guān)機(jī)制學(xué)研究[6,11]。因此,本研究主要通過流式分選出allo-HSCT術(shù)后患者新鮮外周血中多形核的MDSCs(polymorphonuclear-MDSCs, PMN-MDSCs)及T淋巴細(xì)胞,采用共培養(yǎng)方式探究人PMN-MDSCs對T淋巴細(xì)胞增殖、經(jīng)典淋巴因子干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)分泌的免疫抑制作用,為臨床PMN-MDSCs作為aGvHD防治策略提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1樣本來源及分組 選取2022年11月—2023年1月allo-HSCT術(shù)后患者16例及健康供者8例,要求符合術(shù)前接受清髓治療、術(shù)后臨床確診巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus, CMV)感染,排除行自體造血干細(xì)胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation, AHSCT)術(shù)患者、臨床資料不完善者及患傳染性疾病(如乙肝、梅毒、艾滋病等)患者。取患者移植完成后第80天時及健康供者任意時間點新鮮外周血(未過夜)作為標(biāo)本來源。本研究已根據(jù)《赫爾辛基宣言》獲得了病人以及供者知情同意。

1.1.2主要試劑及儀器 抗分化簇14抗體-APC(anti-cluster of differentiation 14-APC, anti-CD14-APC)、抗人類白細(xì)胞抗原DR抗體(anti-human leukocyte antigen-DR, anti-HLA-DR)及anti-CD11b(美國Thermo Fisher Scientific公司),anti-CD3、anti-CD16、anti-CD14-FITC、anti-CD15、anti-CD33、anti-CD19及 anti-CD4(美國Beckman Coulter公司),anti-CD8(中國QuantoBio公司),anti-CD3、anti-CD56、紅細(xì)胞裂解液及細(xì)胞破膜液(美國BD Biosciences公司),羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒、CD3/28單抗偶聯(lián)磁珠(美國BioLegend公司),人白細(xì)胞介素-7(human interleukin-7, hIL-7)及人白細(xì)胞介素-15重組蛋白(human interleukin-15 recombinant protein, rhIL-15;美國Cell Signaling Technology公司),人外周血中性粒細(xì)胞分離液、瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色試劑盒及Tween20(中國Solarbio公司),Annexin V-APC/7-AAD熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(中國杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司),螢光酶聯(lián)免疫斑點(enzyme-linked immunospot, ELISpot)試劑盒、CMV肽段池(cytomegalovirus peptide pool, CMV pool;美國Mabtech 公司),7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)、標(biāo)準(zhǔn)透明96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板[中國愛必信(上海)生物科技有限公司],1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS;中國蘭杰柯科技有限公司),Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液(中國武漢普諾賽生命科技有限公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS;中國浙江天杭生物科技股份有限公司),完全培養(yǎng)基配方為RPMI-1640 45 mL+FBS 5 mL+青霉素-鏈霉素混合液500 μL,5 mL流式試管(墨西哥FALCON公司),流式分選儀和流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司),CX41型顯微鏡(日本OLYMPUS公司),熒光酶聯(lián)免疫斑點分析儀(德國BIO-SYS公司)。

1.2 研究方法

1.2.1血液標(biāo)本 抽取allo-HSCT術(shù)后患者移植完成后第80天時及健康供者任一時間點的空腹外周血。

1.2.2分離PMN-MDSCs與T細(xì)胞 2組受檢者新鮮外周血標(biāo)本置于50 mL試管中,加預(yù)先放置的中性粒細(xì)胞分離液10 mL,室溫下1 800 r/min離心30 min,吸出分層的2層細(xì)胞(包含了所有白細(xì)胞),1×PBS緩沖液洗滌2次(2 000 r/min離心5 min)。

1.2.3分選PMN-MDSCs與T細(xì)胞/PMN-MDSCs 取“1.2.2”項下2組受檢者白細(xì)胞置于5 mL流式試管中,室溫下2 000 r/min離心5 min,1×PBS緩沖液50 μL重懸,分別加PMN-MDSCs及T細(xì)胞的分選抗體組合,即對于PMN-MDSCs使用CD33、CD11b、HLA-DR及CD14-APC,對于T細(xì)胞則使用CD3、CD16、CD56、CD14、CD15、CD33及CD19進(jìn)行染色,常溫避光孵育15 min;1×PBS緩沖液500 μL洗滌細(xì)胞1次,加1×紅細(xì)胞裂解液1mL裂解紅細(xì)胞,常溫避光孵育10 min;1×PBS緩沖液洗滌,完全培養(yǎng)基重懸。遵循FACS Melody手冊建立無菌管路,使用無菌生理鹽水作為鞘液進(jìn)行分選,承接分選細(xì)胞的無菌流式管中預(yù)先加FBS 2 mL,收集細(xì)胞數(shù)上限為7.2×105個/管;分選結(jié)束后立刻迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.2.4瑞氏-姬姆薩(Weigert-Giemsa, WG)染色 取“1.2.3”項下2組受檢者PMN-MDSCs混勻滴至載玻片、推片、常溫晾干,使用移液器懸滴WG染色液(A液)至載玻片、覆蓋涂片區(qū)、常溫孵育3～5 min;滴加等量WG緩沖液(B液),晃動玻片與A液均勻混合,再使用60 mL洗耳球充分混勻A、B液,常溫孵育3～5 min;生理鹽水洗去染色劑,玻片于常溫晾干;用顯微鏡閱片(放大倍數(shù)為100倍),比較allo-HSCT術(shù)后患者及健康供者PMN-MDSCs形態(tài)學(xué)差異。

1.2.5檢測PMN-MDSCs凋亡(Annexin V-APC/7-AAD法) 取“1.2.3”項下allo-HSCT術(shù)后患者PMN-MDSCs于室溫2 000 r/min離心5 min,用預(yù)冷1×PBS 1 mL洗滌,2 000 r/min離心5 min;ddH2O稀釋5×Binding Buffer為1×工作液,取1×Binding Buffer 500 μL重懸細(xì)胞;5 mL流式試管中加Annexin V-APC 5 μL和7-AAD 10 μL,渦旋混勻,室溫避光孵育5 min;運用BD FACSLyricTMFlow Cytometer進(jìn)行0 h細(xì)胞凋亡檢測及分析,后續(xù)按12 h、24 h、48 h時間點對PMN-MDSCs凋亡情況各檢測1次。

1.2.6CFSE染色 96孔U形板每孔加1 mg/L抗CD3/28抗體50 μL,鋁箔包裹96孔板,4 ℃孵育過夜;取出96孔板,吸出殘留的抗體,每孔加完全培養(yǎng)基200 μL,37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min,孵育的同時取“1.2.3”項下allo-HSCT術(shù)后患者T細(xì)胞于室溫下2 000 r/min離心5 min;用1 mL含有5 μmol/L CFSE染液的 1×PBS緩沖液重懸并染色T細(xì)胞,室溫避光孵育5 min;加5倍體積的完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)后于室溫下洗滌T細(xì)胞,2 000 r/min離心5 min,重復(fù)上述洗滌2遍,重懸T細(xì)胞至2.0×109個/L備用;96孔板孵育結(jié)束后吸出培養(yǎng)基,根據(jù)實驗設(shè)計加入不同比例(即T細(xì)胞∶PMN-MDSCs=1∶0,1∶1,1∶5,1∶10)CFSE染色完畢的T細(xì)胞及“1.2.3”項下allo-HSCT術(shù)后患者PMN-MDSCs,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)5 d;共培養(yǎng)的第2天,每孔加10 μg/L IL-7和IL-15增殖培養(yǎng);共培養(yǎng)結(jié)束后收集各孔細(xì)胞,置于5 mL流式試管,按照細(xì)胞表面標(biāo)志物染色流程進(jìn)行抗CD4、CD8及7-AAD染色后流式上機(jī)判斷T細(xì)胞增殖、分裂情況,采用Flowojo 10.6.2(美國BD Bioscience公司)軟件進(jìn)行量化比較。

1.2.7ELISpot實驗 35%酒精20 μL/孔加至ELISpot板中,室溫避光孵育1 min;去酒精,每孔中加1×PBS緩沖液200 μL洗滌,重復(fù)5次;加抗IFN-γ抗體(1-D1K)100 μL,鋁箔包裹ELISpot板,4 ℃孵育過夜;取出ELISpot板,甩去殘留抗體,每孔加1×PBS緩沖液200 μL 洗滌2遍,加含10% FBS的1×PBS封閉液,常溫避光孵育2 h;甩去封閉液,每孔加1×PBS緩沖液200 μL洗滌5遍;各孔加“1.2.3”項下allo-HSCT術(shù)后患者5.0×104個T細(xì)胞[實驗組加5.0×104個PMN-MDSCs(即T細(xì)胞∶PMN-MDSCs=1∶1),對照組不加入PMN-MDSCs(即T細(xì)胞∶PMN-MDSCs=1∶0)],再加刺激物2 mg/L CMV 1 μL、1 mg/L可溶性CD3/28 50 μL(2種刺激物下的各組均設(shè)置3個孔),將ELISpot板置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)36 h;甩去細(xì)胞,含0.05% Tween20的1×PBS緩沖液20 μL,洗滌5次,每孔加1 mg/L 7-B6-1-biotin 100 μL,室溫避光孵育2 h;含0.05% Tween20的1×PBS緩沖液20 μL,洗滌5次,每孔加1 mg/LHRP 100 μL,室溫避光孵育1 h;含0.05% Tween20的1×PBS緩沖液洗滌4次,1×PBS洗滌1次;每孔加1∶1 000稀釋的AEC 50 μL,室溫下避光孵育5 min,用流動自來水終止反應(yīng);采用ELISpot分析儀對各孔IFN-γ分泌情況進(jìn)行拍照解讀。

2 結(jié)果

2.1 PMN-MDSCs形態(tài)特征

allo-HSCT術(shù)后患者PMN-MDSCs大多呈不成熟粒細(xì)胞表型,細(xì)胞核占胞質(zhì)比例大,無明顯分葉;健康供者PMN-MDSCs則呈成熟粒細(xì)胞表型,細(xì)胞核所占比例小,有明顯分葉。見圖1。

患者 健康供者

2.2 PMN-MDSCs凋亡檢測

allo-HSCT術(shù)后患者部分PMN-MDSCs于24 h時出現(xiàn)早期凋亡,48 h時出現(xiàn)晚期凋亡,但大部分PMN-MDSCs于48 h時仍處于存活狀態(tài)。見圖2。

圖2 allo-HSCT術(shù)后患者PMN-MDSCs不同時間點的凋亡檢測(Annexin V-APC/7-AAD)

2.3 PMN-MDSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)

CFSE染色實驗結(jié)果顯示(圖3), allo-HSCT術(shù)后患者PMN-MDSCs可抑制由在CD3/CD28單抗偶聯(lián)磁珠刺激下所引起的T細(xì)胞非特異性增殖,且這種抑制作用(以T細(xì)胞分裂指數(shù)表示)隨著T細(xì)胞與PMN-MDSCs比例的升高而增強(qiáng)。ELISpot檢測結(jié)果顯示(圖4),allo-HSCT術(shù)后患者PMN-MDSCs可抑制T淋巴細(xì)胞在CD3/28或CMV pool刺激下IFN-γ的釋放。

注：A為共培養(yǎng)后熒光圖,B為T細(xì)胞分裂曲線圖。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),多形核MDSCs有著粒細(xì)胞來源的特性,既不能凍存,也不能使用人外周血淋巴細(xì)胞分離液(human lymphocyte separation medium, FICOLL)進(jìn)行分離[12-13]。鑒于MDSCs的臨床標(biāo)本不易保存,因此對MDSCs的大量研究尚停留于動物模型階段[9-11,14-15]。目前,圍繞MDSCs并結(jié)合 allo-HSCT后病人的臨床預(yù)后及轉(zhuǎn)歸資料進(jìn)行的探索屈指可數(shù),而針對PMN-MDSCs與allo-HSCT的研究尚比較缺乏。Wang等[11]在動物模型體內(nèi)圍繞MDSCs所展開的一系列研究發(fā)現(xiàn)HLA-DR-/lowCD33+CD16-early-MDSCs對預(yù)防人源化小鼠aGvHD能夠起到一定作用;Messmann等[16]在小鼠移植的同時回輸MDSCs,結(jié)果表明MDSCs可改善GvHD嚴(yán)重程度,并使GvHD 評分從90%下降至30%。T淋巴細(xì)胞可分為CD4+輔助T淋巴細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[17]。一般認(rèn)為,在aGvHD中主要發(fā)揮作用的是CD8+T淋巴細(xì)胞[18-19]。一方面,T淋巴細(xì)胞受到抗原刺激后可發(fā)生增殖、分化,幼稚的CD4+和CD8+T細(xì)胞分化為大量效應(yīng)細(xì)胞,進(jìn)入外周血并遷移到炎癥組織以對抗感染或腫瘤[20-21];另一方面,T淋巴細(xì)胞被抗原激活后立即行使殺傷、釋放細(xì)胞因子等功能[22]。前一方面的作用,本研究采用CFSE染色觀察PMN-MDSCs對T淋巴細(xì)胞增殖情況的影響,結(jié)果表明PMN-MDSCs可抑制由CD3/28非特異性誘導(dǎo)的 CD8+T細(xì)胞的增殖,而對CD4+T細(xì)胞并無明顯抑制作用;后一方面的作用,本研究使用ELISpot進(jìn)行評價,結(jié)果亦表明,PMN-MDSCs可同時抑制由CD3/28非特異性誘導(dǎo)及CMV pool特異性誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的釋放。總之,上述結(jié)果可以說明PMN-MDSCs具有免疫抑制功能,這和廣泛的動物研究結(jié)果認(rèn)為MDSCs具有免疫抑制功能相符合[8,11]。

綜上所述,本研究表明PMN-MDSCs具有抑制allo-HSCT術(shù)后患者自身T淋巴細(xì)胞增殖及激活的功能。因此,可以預(yù)見PMN-MDSCs在患者移植后早期可能降低了aGvHD發(fā)生率,并且緩解了aGvHD嚴(yán)重程度。這也就使得PMN-MDSCs在臨床工作中作為aGvHD防治策略成為可能。