林子涵, 崔杏, 何杰英, 石文瑩, 曾磊, 程鋮, 羅碧蘭, 湯磊,***

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術研究中心, 貴州 貴陽 550004)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是繼阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的第二大常見的癡呆類型[1]。VaD對老年患者的生活有重大影響,20%的65歲及以上人群受到影響,并且每年呈上升的趨勢[2-4]。盡管VaD發(fā)病率較高,但依然缺乏有效的治療藥物,目前主要側重于癥狀管理,臨床上常使用多奈哌齊、加蘭他敏和美金剛等治療AD藥物來治療VaD的相關癥狀[5-6],并通過控制高血壓和動脈粥樣硬化等血管危險因素來預防進一步的腦損傷[7-8]。缺氧、腦血流灌注不足是VaD的主要特征,研究表明腦血流低灌注誘導的缺氧會促進線粒體氧化分解功能障礙,導致ATP減少和離子泵紊亂[9-10],從而誘發(fā)大量自由基的產生,出現腦組織能量缺失導致的一系列連鎖反應,使得神經細胞趨向死亡[11]。海馬線粒體功能異常時,會嚴重影響大腦能量供應,使得學習記憶的關鍵腦區(qū)海馬、皮質受損,出現記憶力和認知功能下降[12-13],海馬是全腦缺血后最脆弱的腦區(qū)之一[14-15]。相關研究也證明,減少老年大鼠海馬CA1區(qū)細胞損傷,能改善老年大鼠的認知功能障礙以及學習和記憶能力[16-17]。磷酸肌酸廣泛地分布于身體內各組織,90%在肌肉組織中,用于維持ATP水平,通過開放合成通路和減少分解作用、保護肌纖維膜免受缺血損害[18]。磷酸肌酸可以把高能磷酸轉移給ADP生成ATP,因此磷酸肌酸是ATP的貯存形式,能夠維持細胞的活性及基本功能[19]。外源性磷酸肌酸作為重要的能量補充劑,在治療能量供應不足導致的機體病理變化中發(fā)揮著重要作用[20]。作為心肌保護劑的磷酸肌酸鈉,在進入體內后以磷酸肌酸的形式存在,臨床上常用來治療心臟疾病[21]。研究表明磷酸肌酸鈉能減輕脂質過氧化反應,組織清除自由基能力增強,減輕線粒體的損傷,對缺血再灌注損傷有顯著的保護作用[22],并且改善大面積腦梗死患者的神經功能[23]。因此,本研究通過建立老年大鼠雙側頸總動脈結扎模型,探討磷酸肌酸鈉對VaD老年大鼠學習、記憶功能障礙的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性SD老年大鼠(>20周齡)72只,體質量230～250 g,由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。在溫度為(20±2)℃、濕度60%的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周。實驗前禁食6～8 h,飲水自由。

1.1.2主要試劑及儀器 Morris水迷宮儀(成都泰盟生物軟件有限公司),包埋機和切片機(Leica Biosystems公司),磷酸肌酸鈉(實驗室自制),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶生物有限公司。全波長酶標儀購自美國Gene Company Limited,高速低溫離心機購自德國SIGMA公司。

1.2 VaD大鼠模型建立及分組

72只SD大鼠隨機均分為假手術組、模型組、磷酸肌酸鈉低(20 mg/kg)、高劑量(40 mg/kg)組,4組老年大鼠按照3.5×10-3mL/g腹腔注射10%水合氯醛麻醉、仰臥固定、備皮消毒,在頸部正中縱切口,鈍性分離雙側頸總動脈,后3組大鼠使用手術線在兩側頸總動脈近心端和遠心端結扎、確保血流被完全阻斷,假手術組僅分離雙側頸總動脈不結扎,縫合傷口。建模后24 h,磷酸肌酸鈉低劑量組腹腔注射20 mg/kg,高劑量組腹腔注射40 mg/kg,假手術組和模型組大鼠腹腔注射0.5 mL無菌生理鹽水,并連續(xù)給藥28 d。

1.3 觀察指標

1.3.1體質量和生長趨勢 每日觀察記錄各組大鼠的體質量及其生長狀況。

1.3.2大鼠學習記憶能力 4組大鼠在給藥第24 天時進行Morris水迷宮行為檢測。定位巡航實驗:一個圓形水池劃分成大小相等的4個象限,并在第四象限中間放置一個圓形平臺,浸沒在水下2 cm處。大鼠從第一象限,面向池壁放入水中,記錄大鼠從入水到游上平臺時間為逃逸潛伏期,以逆時針方向依次放入第二、第三、第四象限點;如大鼠60 s內沒有找到平臺者,將其引至平臺;該練習持續(xù)進行4 d。空間探索實驗:在第28 天時,將可移動平臺撤掉,把大鼠從第二象限,面向池壁放入水中,記錄大鼠在60 s內穿越平臺次數及原平臺象限所經歷的時間。

1.3.3海馬組織內ATP、SOD、MDA及GSH-PX水平 水迷宮實驗結束后,各組大鼠隨機選取6只,斷頭后冰上取出海馬組織,按照組織∶生理鹽水(g∶L)=1∶9的比例進行勻漿,3 500 r/min離心15 min,取上清液。采用BCA蛋白定量測定各組ATP、MDA、SOD、GSH-PX水平。

1.3.4海馬組織內IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平 水迷宮實驗結束后,各組大鼠隨機選取6只,按照3.5×10-3mL/g腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,沿腹中線剪開用PBS心臟灌注后、冰上取海馬組織,依據組織∶PBS(g∶L)=1∶9的比例、3 500 r/min離心15 min,取上清液加入至包埋好抗體的孔板內,ElISA法檢測IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.3.5HE染色 水迷宮結束后,各組大鼠隨機選取6只,按照3.5×10-3mL/g腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,沿腹中線剪開、4%多聚甲醛心臟灌注后,在冰上取海馬組織,4%多聚甲醛固定。將海馬組織依次放入不同濃度的乙醇進行梯度脫水,放入二甲苯中透明;石蠟包埋,制成厚度為5 μm 的切片進行染色。經過不同濃度的乙醇復水,蘇木素和伊紅染色,封片后在光學顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 體質量和生長趨勢

與假手術組比較,模型組大鼠的平均體質量在28 d內無明顯增長,且體質量波動較大;與模型組比較,磷酸肌酸鈉低、高劑量組大鼠的平均體質量在28 d內穩(wěn)定增長,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。該實驗結果表明磷酸肌酸鈉長期給藥(40 mg/kg以內)對大鼠體質量和生長趨勢無影響,具有較好的安全性。見圖1。

圖1 各組大鼠造模28 d內的體質量變化趨勢

2.2 定位巡航實驗

水密宮結果顯示,與假手術組比較,模型組大鼠潛伏期顯著增加(P<0.05),提示模型大鼠的學習能力降低;與模型組比較,磷酸肌酸鈉高劑量組大鼠的逃逸潛伏期時間減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。提示高劑量組大鼠的學習能力較模型組大鼠增高。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

圖2 各組大鼠定位巡航軌跡

2.3 空間探索實驗

與假手術組比較,模型組大鼠穿越平臺的次數減少(P<0.05),平臺所在象限的游泳時間減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示模型大鼠記憶能力降低;與模型組比較,酸肌酸鈉低、高劑量組大鼠穿越平臺的次數和停留在目標象限的時間均增加,特別是高劑量組大鼠穿越平臺的次數及呆在平臺所在象限的時間顯著增加(P<0.05),提示該組大鼠的記憶能力高于模型組。見表2、圖3。

表2 撤除平臺后大鼠空間探索試驗的穿越情況

圖3 撤平臺后各組大鼠60 s內活動軌跡

2.4 海馬組織內ATP、SOD、MDA及GSH-PX水平

與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織中ATP水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,磷酸肌酸鈉低、高劑量組大鼠海馬ATP水平升高,其中磷酸肌酸鈉高劑量組大鼠海馬ATP水平顯著升高(P<0.05);與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織內的MDA含量顯著增加,并且SOD和GSH-PX活性均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,磷酸肌酸鈉低、高劑量組大鼠海馬組織中MDA含量均顯著性減少,SOD和GSH-PX的活力顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織中ATP及相關氧化應激指標

2.5 海馬組織內IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平

與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、和TNF-α的含量顯著升高,IL-10的含量下降(P<0.05);與模型組比較,磷酸肌酸鈉低、高劑量組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、和TNF-α的含量顯著降低,高劑量組中IL-10的含量顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬組織中相關炎癥指標的含量

2.6 海馬HE染色

假手術組大鼠海馬神經元排列緊密,細胞形態(tài)飽滿,結構完整,大小正常,細胞核清晰且呈類圓形,細胞核核膜、細胞膜清晰。與假手術組比較,模型組大鼠海馬區(qū)細胞形態(tài)不規(guī)則,染色不均勻,細胞邊界模糊,數量減少,可見壞死的細胞,細胞核固縮,細胞膜、核膜不清晰。與模型組比較,磷酸肌酸鈉低劑量組大鼠海馬區(qū)細態(tài)較為完整,染色較均勻,細胞形態(tài)較為規(guī)則,但同時也還存在一些形狀不規(guī)則、壞死的細胞;磷酸肌酸鈉高劑量組神經元染色均勻,細胞形態(tài)規(guī)則完整,細胞核清晰呈類圓形,細胞膜、核清晰可見,細胞數量多。見圖4。

注：紅色箭頭為海馬區(qū)神經細胞。

3 討論

VaD是一種涉及學習、記憶和認知功能衰退的腦血管疾病[24],常常由于血管損傷阻塞導致血液供應減少,引發(fā)學習、記憶和認知功能下降。年齡、糖尿病、高血壓、腦卒中(特別是與缺血性腦卒中的聯系更為緊密)、以及代謝綜合征等都是引起VaD的危險因素[25]。目前VaD的治療是對癥而非治愈,臨床上常使用一些膽堿酯酶抑制劑、興奮性氨基酸受體拮抗劑等臨床藥物輔助治療[26]。研究表明,長期的慢性腦血流低灌注引起線粒體功能障礙是內環(huán)境紊亂的主要原因之一,包括氧化應激、神經炎癥、腦水腫、神經遞質系統(tǒng)功能的失調、脂質代謝障礙和生長因子改變等[27],從而引起內皮細胞損傷和血腦屏障功能障礙,海馬神經元減少和白質損傷等,最終導致學習和記憶功能減退[28]。ATP是生物體內最直接的能量來源,其水平降低易導致細胞凋亡或壞死[29]。已有研究證實,VaD與腦缺血再灌注損傷有很大的聯系,腦缺血再灌注損傷導致慢性腦灌注不足從而造成認知障礙[30],腦組織受損使得腦內ATP含量降低,Na+-K+-ATP酶降低,線粒體功能障礙,影響腦內ROS升高造成氧化應激損傷[31];小膠質細胞和星型膠質細胞等被激活,產生大量的促炎因子,造成神經炎癥以及神經細胞損傷凋亡[32]。實驗結果顯示大鼠通過雙側頸總動脈結扎造成腦血流灌注不足[33],海馬組織內ATP水平明顯降低(P<0.05),進而引發(fā)一系列的級聯反應:抗氧化應激酶SOD、GSH-PX活力降低(P<0.05),使得氧自由基過量,脂質過氧化產物MDA含量增加(P<0.05),造成腦組織自由基清除能力下降,產生氧化應激,同時海馬組織中促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高(P<0.05),抗炎因子IL-10降低(P<0.05)引發(fā)神經炎癥,從而造成海馬神經元病理性損傷,最終使得VaD老年大鼠的認知、學習和記憶功能產生障礙。在Morris水迷宮實驗中,模型組大鼠的認知功能、學習和記憶功能明顯下降,體現在逃逸潛伏期時間顯著性增加(P<0.05),穿越平臺次數和目標象限停留軌跡顯著減少(P<0.05)。此外,相比于假手術組,ATP含量減少和內環(huán)境紊亂的VaD老年大鼠海馬區(qū)組織結構發(fā)生明顯的異常,海馬區(qū)的細胞排列松散、雜亂、細胞呈現不規(guī)則狀態(tài),細胞核破裂,神經元收縮、脫色和淺染色。

磷酸肌酸鈉是新一代改善心肌能量代謝的藥物,它可以在心肌、骨骼肌和腦組織中儲存能量,促進ATP的再合成,減少心肌缺血再灌注損傷,改善心臟功能,并減少心臟病的發(fā)生已在臨床上廣泛應用[34-36]。本研究發(fā)現酸肌酸鈉進入老年大鼠體內可以分解成磷酸肌酸,促進VaD老年大鼠海馬組織中ATP的生成,提高受損海馬區(qū)組織的抗氧化應激酶SOD和GSH-PX的活力,降低VaD老年大鼠海馬組織中的脂質過氧化產物MDA;同時提高抗炎因子IL-10(P<0.05)的含量,降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成(P<0.05)。由此證明磷酸肌酸鈉能夠顯著改善VaD老年大鼠組織清除自由基能力,降低自由基蓄積水平,減緩神經炎癥的產生,并且有效改善線粒體功能障礙;磷酸肌酸鈉在高劑量的治療下改善海馬區(qū)神經元的組織結構異常,有效改善細胞的不規(guī)則形,使得海馬細胞形態(tài)趨于完整,細胞數量增加,從而提高認知、學習和記憶功能(增加VaD老年大鼠穿越平臺的次數,縮短VaD老年大鼠的逃逸潛伏期);并且,本研究還表明了磷酸肌酸鈉長期給藥對老年大鼠體重和生長趨勢無影響,具有較好的安全性。

本研究證明磷酸肌酸鈉通過提高ATP的產生,改善VaD海馬組織中的能量代謝障礙;增加VaD老年大鼠的抗氧化應激能力,從而減少模型制備后的脂質過氧化損傷,清除過量氧自由基;同時減少海馬受損組織區(qū)促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成,提高抗炎因子IL-10水平,抑制神經炎癥,進而達到神經保護的作用;通過保護VaD老年大鼠海馬神經元,從而改善VaD老年大鼠的認知、學習和記憶功能;并且磷酸肌酸鈉可作為長期注射給藥的選擇,具有較好的安全性?？傊?這些結果有效的證明磷酸肌酸鈉能減少VaD老年大鼠海馬神經元損傷,改善認知、學習和記憶功能障礙。也進一步探究并驗證雙側勁總動脈結扎手術致老年大鼠缺氧引發(fā)的能量缺失和海馬神經元內環(huán)境紊亂在VaD病理生理進程的作用,為今后臨床預防與改善血管性癡呆的治療提供新思路和有效途徑,進而提升患者生存質量。