謝銀鳳，王斌之*，孫大勇，安可珍，張存良，馬煜，熊莉，譚金峰

(1.山東省濰坊生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 濰坊 261041；2. 山東省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250101；3.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，北京 100875；4. 四川省宜賓生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，四川 宜賓 644000)

0 引言

隨著海洋命運(yùn)共同體的提出，海洋生態(tài)環(huán)境越來(lái)越受到關(guān)注[1-3]。近年來(lái)，海水養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，大量養(yǎng)殖廢水的排放對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境造成了壓力。氨氮是養(yǎng)殖廢水的主要污染物[4-6]，對(duì)海洋環(huán)境和水生生物有嚴(yán)重影響，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確高效的監(jiān)測(cè)尤為必要。

氨氮是指水體中以離子銨(NH4+)和游離氨(NH3)形式存在的氮。海水氨氮的監(jiān)測(cè)方法主要有次溴酸鈉氧化法、靛酚藍(lán)分光光度法、氣相分子吸收法和流動(dòng)注射法等[7-10]。氣相分子吸收和流動(dòng)注射法儀器昂貴，成本高，不便于方法的普及；靛酚藍(lán)法所用試劑對(duì)環(huán)境不友好且分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。次溴酸鈉法不使用劇毒物質(zhì)，準(zhǔn)確度高，分析時(shí)間也較靛酚藍(lán)法短，因此是國(guó)控網(wǎng)海水水質(zhì)監(jiān)測(cè)的優(yōu)選方法。

國(guó)內(nèi)已有部分學(xué)者從不同的角度對(duì)海水氨氮次溴酸鈉法進(jìn)行了研究。呂曉潔等[7]從實(shí)驗(yàn)用水、次溴酸鈉和磺胺的加入速度、雜質(zhì)干擾等方面進(jìn)行了研究，明確了氨氮分析的注意事項(xiàng)。任妍冰等[11]對(duì)海水氨氮試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了溫度、氧化時(shí)間、次溴酸鹽用量和氨基酸等因素的影響。張健等[12]對(duì)次溴酸鈉法進(jìn)行了改良，通過(guò)將顯色劑和氧化劑濃度擴(kuò)大到原來(lái)的5倍，明顯提高了方法測(cè)定上限，特別適合氨氮濃度高于0.3 mg/L水樣的分析。但在對(duì)低濃度含氨廢水(小于0.3 mg/L)的測(cè)量上，改良法不如國(guó)標(biāo)法GB 17378.4—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》準(zhǔn)確[13]。而小于0.3 mg/L濃度的海水，超出了國(guó)標(biāo)法的校準(zhǔn)曲線范圍，需稀釋后才可測(cè)定。這一方面延長(zhǎng)了分析時(shí)間，另一方面氨的水溶性較強(qiáng)，分析時(shí)間的加長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致空氣中的氨部分溶入樣品中，影響分析結(jié)果。王文雷[14]在納氏試劑比色法測(cè)定水體中氨氮的研究中，對(duì)自配標(biāo)液進(jìn)行“比色前稀釋”和“比色后稀釋”比對(duì)，指出在一定濃度范圍內(nèi)“比色后稀釋”與“比色前稀釋”差別不大。

本文在前人工作的基礎(chǔ)上，采用次溴酸鈉氧化法，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)用水、不同光程比色皿的靈敏度響應(yīng)進(jìn)行了比對(duì)，并針對(duì)海水低濃度氨氮樣品(0.1～0.3 mg/L)開(kāi)展了顯色前和顯色后稀釋研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

T6新悅可見(jiàn)分光光度計(jì)、10 mm、20 mm和30 mm玻璃比色皿，100 mL比色管，MiliQ超純水機(jī)。其他實(shí)驗(yàn)室常用器具。

1.2 試劑和溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：離子色譜用銨離子溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)083341(北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)。試劑：氫氧化鈉，三氯甲烷，鹽酸，溴酸鉀，溴化鉀，磺胺，鹽酸萘乙二胺。所用試劑均按GB 17378.4—2007 《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》配制[13]，具體如下：

(1)氫氧化鈉溶液(400 g/L)：稱(chēng)取200 g氫氧化鈉溶于1000 mL水中，加熱蒸發(fā)至500 mL，盛于聚乙烯瓶中。

(2)溴酸鉀一溴化鉀貯備液：稱(chēng)取2.8 g溴酸鉀和20.0 g溴化鉀溶于1000 mL水中，貯存于棕色試劑瓶中4 ℃冷藏保存。

(3)次溴酸鈉溶液：量取溴酸鉀一溴化鉀貯備溶液1.0 mL于250 mL聚乙烯瓶中，加入49 mL水和3.0 mL 50%鹽酸溶液，蓋緊搖勻，置于暗處5 min后加入50 mL氫氧化鈉溶液，混勻。臨用前配制。

(4)對(duì)氨基苯磺酰胺溶液(2.0 g/L)：稱(chēng)取2.0 g磺胺，溶于1000 mL 50%鹽酸溶液中，貯存于棕色試劑瓶中，4 ℃冷藏保存。有效期為2個(gè)月。

(5)鹽酸萘乙二胺溶液：稱(chēng)取0.50 g鹽酸萘乙二胺，溶于500 mL水中，貯于棕色試劑瓶中，4 ℃冷藏保存。有效期為1個(gè)月。

(6)銨標(biāo)準(zhǔn)貯備液(以N計(jì)，77.8 mg/L)：移取10.00 mL 778 mg/L(以N計(jì))離子色譜用銨離子溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，加100 μL三氯甲烷后用水定容至刻線，混勻后貯存于棕色試劑瓶中，4 ℃冷藏保存。有效期為半年。

(7)銨標(biāo)準(zhǔn)使用液(以N計(jì)，7.78 mg/L)：移取10.00 mL氨標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液于100 mL容量瓶中，加水定容，混勻，臨用現(xiàn)配。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)用水對(duì)比

實(shí)驗(yàn)用水選用MiliQ新制超純水和新制蒸餾水，分別測(cè)定試劑空白和實(shí)驗(yàn)用水空白，各分析三個(gè)平行樣。

具體步驟如下：試劑空白—量取5 mL新配制的次溴酸鈉溶液于100 mL比色管中，立即加入5 mL磺胺溶液，混勻。放置5 min后加50 mL MiliQ新制超純水和新制蒸餾水，然后加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，15 min后用3 cm比色皿測(cè)定空白吸光度。

實(shí)驗(yàn)用水空白—分別移取50.0 mL MiliQ新制超純水和新制蒸餾水于100 mL比色管中，各加入5 mL次溴酸鈉溶液，混勻，放置30 min。各加入5 mL磺胺溶液，混勻，放置5 min。各加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，15 min后用3 cm比色皿上機(jī)測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和比色皿的選擇

銨標(biāo)準(zhǔn)使用液(以N計(jì))：7.78 mg/L。取6個(gè)200 mL容量瓶，分別加入0、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL銨標(biāo)準(zhǔn)使用液，加水定容至刻線，混勻。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為：0、0.00778、0.0156、0.0311、0.0467、0.0622 mg/L。按2.1實(shí)驗(yàn)用水空白分析步驟依次加入試劑，用1 cm、2 cm和3 cm比色皿分別上機(jī)測(cè)定。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)均做三個(gè)平行樣。

2.3 樣品測(cè)定

主要針對(duì)0.1～0.3 mg/L的自配制氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液和養(yǎng)殖海水實(shí)際樣品。分別采用顯色前和顯色后稀釋兩種方式處理，具體操作為：比色前處理是將待測(cè)樣品稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，取50 mL稀釋后樣品于比色管中，參照2.1實(shí)驗(yàn)用水空白分析步驟依次加入試劑反應(yīng)，用3 cm比色皿上機(jī)測(cè)定。比色后是移取50 mL待測(cè)原樣于比色管中，參照2.1實(shí)驗(yàn)用水空白流程依次加入試劑，顯色反應(yīng)完成后將溶液稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，用3 cm比色皿上機(jī)分析。所有樣品均平行分析三次。

2.4 方法檢出限測(cè)定

方法檢出限按照HJ 168—2010 《環(huán)境監(jiān)測(cè) 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》附錄A中檢出限的測(cè)定方法進(jìn)行[15]，即按樣品分析的全部步驟，對(duì)實(shí)驗(yàn)室空白樣品進(jìn)行十一次測(cè)定，計(jì)算十一次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按附錄A中公式計(jì)算方法檢出限。實(shí)驗(yàn)室空白樣品分析流程參照2.1實(shí)驗(yàn)用水空白步驟進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)用水

國(guó)標(biāo)法要求實(shí)驗(yàn)用水使用無(wú)氨蒸餾水或等效水。制取無(wú)氨蒸餾水步驟繁瑣，且蒸餾時(shí)空氣中氨也極易溶入制備水中，有時(shí)可導(dǎo)致蒸餾空白偏高。實(shí)驗(yàn)選用MiliQ新制超純水與新制蒸餾水進(jìn)行了對(duì)比(表1)，結(jié)果證明兩種水無(wú)差別，因此在做海水氨氮分析時(shí)可考慮用MiliQ新制超純水替代新制蒸餾水，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，提高效率。

表1 實(shí)驗(yàn)用水吸光度

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和比色皿的選擇

國(guó)標(biāo)方法推薦選用5 cm比色皿，但在實(shí)際工作中，采用5 cm比色皿測(cè)定有時(shí)會(huì)有超出儀器最佳吸光度范圍，導(dǎo)致線性不好、最高點(diǎn)上不去等問(wèn)題。而采用太小光程比色皿會(huì)導(dǎo)致低濃度樣品吸光度太低而無(wú)法準(zhǔn)確定量。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同光程比色皿對(duì)自配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值(表2)，從1 cm到3 cm光程，斜率呈線性變化，1 cm曲線線性差，不到三個(gè)九。2 cm和3 cm線性均達(dá)三個(gè)九以上，然光程越長(zhǎng)，靈敏度越高，最終選定3 cm比色皿作為吸收池。

表2 不同光程比色皿對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)

3.3 樣品測(cè)定

3.3.1 自配制標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定

次溴酸鹽氧化法測(cè)定氨氮的原理是在堿性條件下將海水中的氨氧化為亞硝酸鹽，反應(yīng)方程式：

在酸性條件下亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酰胺發(fā)生重氮化反應(yīng)，反應(yīng)方程式：

生成的重氮鹽再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色偶氮染料，反應(yīng)方程式：

其顏色與樣液中亞硝酸鹽含量成正比測(cè)定，扣除原有亞硝酸鹽氮的濃度，即得氨氮濃度。

在王文雷研究[14]的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用顯色前和顯色后兩種稀釋方式對(duì)比，探索出了一種高效準(zhǔn)確的海水氨氮低濃度(小于0.3 mg/L)樣品分析方法。顯色后稀釋?zhuān)环矫鍹iliQ純水中氨氮、亞硝酸鹽氮含量比較低，幾乎可忽略不計(jì)；另一方面，即使存在少量的氨氮和亞硝酸鹽氮，所有化學(xué)反應(yīng)已進(jìn)行完全，稀釋過(guò)程只是用實(shí)驗(yàn)空白水處理，并未引入其他試劑，再無(wú)條件進(jìn)行相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)。因此，整個(gè)稀釋過(guò)程只是反應(yīng)液顏色呈倍數(shù)的變淺，即吸光度相應(yīng)減小，故在一定濃度范圍內(nèi)顯色后稀釋和顯色前稀釋分析結(jié)果應(yīng)差別不大。

實(shí)驗(yàn)配制了濃度為標(biāo)準(zhǔn)溶液1(0.124 mg/L)、標(biāo)準(zhǔn)溶液2(0.249 mg/L)、標(biāo)準(zhǔn)溶液3(0.311 mg/L)、標(biāo)準(zhǔn)溶液4(0.389 mg/L)、標(biāo)準(zhǔn)溶液5(0.778 mg/L)氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照2.1實(shí)驗(yàn)用水空白步驟進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。結(jié)果顯示：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度低于0.311 mg/L時(shí)，顯色前和顯色后稀釋相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在允許范圍內(nèi)，兩種處理方式基本無(wú)差別。而0.389 mg/L和0.778 mg/L的樣品，從圖1和表3可明顯看出，顯色前稀釋和顯色后稀釋相對(duì)偏差增大，顯色前稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相對(duì)誤差較小，滿足要求，而顯色后稀釋測(cè)定結(jié)果偏小，相對(duì)誤差不在范圍內(nèi)。顯色后稀釋測(cè)定結(jié)果偏小的原因，可能是氧化劑或顯色劑等試劑含量不足，不能使高濃度樣品中的氨完全反應(yīng)。因此，暫定顯色后稀釋對(duì)象為0.1～0.3 mg/L濃度的樣品。

圖1 顯色前后稀釋結(jié)果對(duì)比

表3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定

3.3.2 實(shí)際樣品測(cè)定

為驗(yàn)證顯色后稀釋對(duì)實(shí)際樣品的分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)對(duì)養(yǎng)殖海水樣品進(jìn)行了測(cè)定，分析結(jié)果見(jiàn)表4。綜合標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際樣品結(jié)果可以看出，顯色前稀釋和顯色后稀釋差別不大，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在范圍內(nèi)。

表4 養(yǎng)殖海水樣品的測(cè)定

3.4 檢出限的測(cè)定

檢出限的測(cè)定按HJ 168—2010 《環(huán)境監(jiān)測(cè) 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》[15]附錄A中方法進(jìn)行，即按參照2.1實(shí)驗(yàn)用水空白步驟分析步驟，對(duì)實(shí)驗(yàn)室空白樣品進(jìn)行十一次測(cè)定，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，檢出限按MDL=t(n-1,0.99)×S計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 檢出限的測(cè)定

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用次溴酸鈉氧化法，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)用水、不同光程比色皿的靈敏度響應(yīng)進(jìn)行了比對(duì)，并針對(duì)海水低濃度氨氮樣品開(kāi)展了顯色前和顯色后對(duì)比分析。研究證明：

(1) MiliQ新制超純水可替代新制蒸餾水作為實(shí)驗(yàn)用水，其他廠家新制超純水若滿足要求也可替代蒸餾水，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

(2)依據(jù)靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性，選定3 cm比色皿作為吸收池。

(3)通過(guò)顯色前和顯色后兩種稀釋方式的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)樣品濃度≤0.3 mg/L左右兩種稀釋方式無(wú)差別，樣品濃度大于0.3 mg/L左右時(shí)，顯色后稀釋可能因?yàn)檠趸瘎┗蝻@色劑含量不足，樣品中氨氮不能完全氧化或者顯色，濃度較顯色前稀釋偏低。因此，顯色后稀釋適用于0.1～0.3 mg/L的海水低濃度氨氮樣品，有效縮短了分析時(shí)間。