伍東立 喬新華 韓文生 謝 婷 時 暢 黃雨云飛 孫傳鑫丁 侃 陳 暢1，*

（1）西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州 646000；2）中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點實驗室，北京 100101；3）中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；4）中國科學(xué)院上海藥物研究所受體研究重點實驗室，藥物研究國家重點實驗室，上海 201203）

枸杞子是中國傳統(tǒng)名貴中藥，在歐美及亞洲很多國家有“長壽果”之稱?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》把它列為上品，歷代本草均有記載。作為典型的藥食同源中藥［1-2］，枸杞子一直被納入在國家衛(wèi)健委發(fā)布的食藥同源（既是食品又是中藥材）的物質(zhì)目錄中?！侗静菥V目》中記載枸杞子具有“久服堅筋骨，輕身不老，耐寒暑，易顏色，變白”的功效，在“堅筋骨”方面，前期工作已經(jīng)進(jìn)行了科學(xué)解讀和機制研究［3-5］，但枸杞抗衰老及美白的科學(xué)內(nèi)涵和機制尚不完全清楚。從枸杞子中已分離出多種具有生物活性的成分，如多糖、類胡蘿卜素、類黃酮和酚類等，研究表明枸杞多糖具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡和細(xì)胞保護(hù)等作用［6］。研究表明，枸杞粗多糖可以通過提高果蠅的抗氧化能力延長壽命［7］。枸杞粗提物可以延長線蟲的壽命并提高線蟲對百草枯、紫外線誘導(dǎo)的氧化和熱應(yīng)激的耐受性水平［8］。枸杞粗多糖可以提高D-半乳糖造模的衰老小鼠的認(rèn)知，降低大腦中脂質(zhì)過氧化及脂褐質(zhì)的水平［9］，還可以提高皮膚超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低皮膚丙二醛（MDA）含量［10］。在皮膚美白和保護(hù)方面，枸杞根提取物能有效抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性，降低黑色素含量［11］。皮膚長時間暴露在紫外線輻射下，會導(dǎo)致表皮和真皮的過早老化，紫外線照射誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，導(dǎo)致膠原降解。枸杞糖復(fù)合物（LbGp）具有抗凋亡和抗氧化的作用，其中的一種提取物L(fēng)bGp5，可以促進(jìn)人成纖維細(xì)胞的活力，提高I 型膠原的含量［12］。枸杞多糖組分（LBPF）可以保護(hù)小鼠皮膚由于紫外照射導(dǎo)致的膠原纖維斷裂的損傷［13］。枸杞延緩衰老及美白的機制目前大多數(shù)研究集中在其抗氧化的功能中，如枸杞可以提高SOD 和過氧化氫酶（CAT）活性，丙二醛水平降低。枸杞抗衰老涉及到的相關(guān)信號通路主要為絲裂原活化蛋白激酶MAPK 信號通路的激活［11］，其他方面的機制研究得很少。

維持適當(dāng)自噬水平的機體更加健康和長壽［14］，飲食限制和鍛煉部分是通過適度激發(fā)自噬產(chǎn)生延緩衰老的作用［15］。自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體清除異常蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要代謝過程，自噬過程中細(xì)胞能處理一些對細(xì)胞健康有損傷的物質(zhì)［16］。轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）是自噬-溶酶體途徑的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它正向調(diào)節(jié)自噬和溶酶體生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)自噬體形成、自噬體-溶酶體融合以及自噬降解［17］。研究還發(fā)現(xiàn)TFEB通過溶酶體胞吐作用促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有害底物的清除，此系統(tǒng)功能的下降會導(dǎo)致疾病，年老的帕金森病模型小鼠自噬-溶酶體系統(tǒng)受損導(dǎo)致腎臟中脂褐素顆粒異常堆積［18］。脂褐素是一種老年色素，由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物組成，含量隨著年齡的增長而增加，并導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。脂褐素在皮膚中的過量和異常分布會導(dǎo)致黑斑的出現(xiàn)，是皮膚衰老的一個標(biāo)志物［19］。衰老過程中神經(jīng)元最顯著的形態(tài)學(xué)變化之一是脂褐素聚集體以及神經(jīng)松弛素色素的積累，這些會導(dǎo)致神經(jīng)元損失、神經(jīng)膠質(zhì)增殖和激活［20］。衰老的另一個顯著特征是衰老相關(guān)分泌表型（SASP），SASP 是一種和衰老相關(guān)的促炎反應(yīng)，包括促炎因子、蛋白酶、促纖維化因子和干擾組織微環(huán)境的生長因子，如白介素-1β（IL-1β）、IL-6 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 等［21-22］。轉(zhuǎn)錄因子GATA4是一個新的衰老調(diào)節(jié)基因，是SASP所必需的，GATA4可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB以啟動SASP并促進(jìn)衰老。正常情況下GATA4 會被p62 介導(dǎo)的選擇性自噬降解，但這種調(diào)節(jié)在衰老過程中會受到抑制，因為衰老過程中自噬水平的下降導(dǎo)致p62的積累從而穩(wěn)定了GATA4。GATA4 在多種組織中積累，包括老化的大腦、皮膚，并可能導(dǎo)致衰老及其相關(guān)的炎癥［23］。因此，該工作旨在研究枸杞子是否可以通過激活TFEB 提高自噬水平降低衰老的SASP，同時降低細(xì)胞內(nèi)脂褐質(zhì)，從而延緩衰老及具有潛在美白效應(yīng)。

我們從枸杞子中獲得一種組分多糖LBP1C，在人成纖維細(xì)胞及線蟲水平對其延緩衰老和清除脂褐質(zhì)的功能和機制進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)LBP1C 可以通過增加TFEB 入核從而提高自噬水平，降低SASP 可以延緩人成纖維細(xì)胞的衰老，提高線蟲的運動能力，并降低細(xì)胞及線蟲的脂褐質(zhì)水平，從而促進(jìn)健康衰老。本研究揭示了LBP1C 抗衰老和清除脂褐質(zhì)的功效及其機制，為枸杞抗衰老及產(chǎn)品研發(fā)提供了新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 LBP1C的制備

取5 kg干燥的枸杞子藥材，用粉碎機粉碎。取枸杞粉末（1.0 kg）加入到20 L 去離子水中，于55℃下分別加入30 g 纖維素酶、5 g 木瓜蛋白酶及10 g 淀粉酶，攪拌提取1 h。將溶液溫度升高至100℃使酶失活后，4 000 r/min 離心10 min，上清液加熱濃縮后流動水透析1~2 d，再加熱濃縮透析內(nèi)液、4 000 r/min 離心10 min。上清液加入5 倍體積的95%工業(yè)乙醇并且不斷攪拌，靜置過夜。4 000 r/min離心10 min并收集沉淀，無水乙醇和丙酮交替洗滌3次，置于50~60℃烘箱中烘干，得酶-水聯(lián)提枸杞粗多糖（LBP1）。

采用DEAE SepharoseTMFast Flow分離粗多糖。取約6 g LBP1 溶解于60~80 ml 去離子水中，4 000 r/min離心10 min除去不溶物，取上清上樣于DEAE Sepharose TM Fast Flow 柱，依次用去離子水和不同離子強度的NaCl 溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mol/L）進(jìn)行梯度洗脫，自動收集器收集樣品，流速為12 ml/15 min，硫酸-苯酚法檢測多糖含量，測定其在490 nm 處的吸光度值（A490），繪制洗脫圖，合并相同組分，減壓濃縮、透析、冷凍干燥，得到0.05 mol/L 洗脫組分LBP1A1，0.1 mol/L洗脫組分LBP1B，0.2 mol/L洗脫組分LBP1C。LBP1C 為下一步實驗用的組分多糖。

細(xì)胞處理：用培養(yǎng)液配制干粉LBP1C 終濃度為0.4 g/L 處理約20 代次細(xì)胞，處理2 個代次，約6 d；線蟲處理：將5 g/LLBP1C 混合進(jìn)OP50 菌液中喂食線蟲，從第1 天（Day1）開始處理，處理10 d。

1.2 人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

人成纖維細(xì)胞（human dermal fibroblasts，HDF）（美國細(xì)胞科學(xué)研究中心（ScienCell Research Laboratories），編號：2320）用于細(xì)胞衰老的實驗研究。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco，貨號：10099-141），加入100 U/ml 青霉素，100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在5%的CO2，37°C，95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 線蟲培養(yǎng)

N2 野生型線蟲溫度為20℃，濕度為約50%的條件下培養(yǎng)線蟲，使用大腸桿菌菌株OP50 喂養(yǎng)線蟲。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）

用5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上樣緩沖液（loading buffer）制備電泳樣品后，用8%的SDS-PAGE 膠進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)移到NC膜。膜用5% 的脫脂奶粉（TBST 配制，tris buffered saline+Tween 20）室溫封閉1.5 h（當(dāng)檢測蛋白是帶biotin 標(biāo)簽時不用牛奶封閉，直接用TBST封閉）。用相應(yīng)的一抗在4°C孵育過夜。使用HRP 偶聯(lián)的二抗標(biāo)記一抗，用增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒和ChemiDoc XRS+（BioRad）儀器進(jìn)行顯色，顯色發(fā)光液為超敏發(fā)光液（Thermo Scientific，89880）?？贵w：Anti-iNOS antibody（Santa Cruz，sc-7271）， Anti-LC3B antibody （Cell Signaling Technology，2775S），Anti-P62 antibody （MBL，PM045）。

1.5 實時熒光定量PCR

用SYBR Green法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。反應(yīng)體系見表1。

Table 1 The reaction system for Q-RCR

在ABI7500 上進(jìn)行定量PCR 檢測，引物見表2。對于每個待檢測樣品，選取3 個獨立制備的RNA樣本反轉(zhuǎn)錄cDNA，并且每個cDNA樣品重復(fù)檢測3次，最后所得的Ct值取平均值，并將目的基因與內(nèi)參基因做歸一化處理后，用2-△△Ct法計算相應(yīng)基因mRNA 的相對變化。定量PCR 條件：94°C變性10 min；40 個循環(huán)；94°C 變性10 s、60°C 退火15 s和72°C延伸20 s，72°C延伸90 s；同時檢測產(chǎn)物的溶解曲線。

Table 2 Sequences of primers used for the amplification of qPCR

1.6 SA-β-gal染色

吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 或HBSS 洗滌1 次，加入1 ml β半乳糖苷酶（β-gal）染色固定液，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細(xì)胞3 次，每次3 min，然后吸除PBS 或HBSS，每孔加入1 ml染色工作液。37oC孵育12~16 h后用普通光學(xué)顯微鏡下觀察。每孔細(xì)胞取上、下、左、右、中5個視野，統(tǒng)計被染為藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)，每孔計數(shù)>200個。

1.7 脂褐質(zhì)檢測

細(xì)胞：蘇丹黑染色法，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗1遍，加4%多聚甲醛（PFA），室溫固定15 min，PBS 洗3 次，每次2 min。70%乙醇孵育2 min 后用70%乙醇配置0.7%的蘇丹黑（現(xiàn)配現(xiàn)用），孵育2~8 min，顯微鏡下實時觀察染色效果，防止沉淀生成。去除蘇丹黑，50%乙醇孵育2 min。蒸餾水洗3次，每次2 min，后加入40%甘油，普通顯微鏡下觀察、拍照。

線蟲：體內(nèi)熒光光譜法是檢測線蟲脂褐質(zhì)的經(jīng)典方法［24］。線蟲在340 nm激發(fā)和430 nm發(fā)射下線蟲腸道的自發(fā)熒光為脂褐質(zhì)，用高速轉(zhuǎn)盤活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)Andor 進(jìn)行成像，圖像熒光用Imaris 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 免疫熒光染色

人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于玻璃底皿，去掉培養(yǎng)基后用PBS洗3次。用4%的多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 洗3 次，每次5 min。細(xì)胞用0.5%的Triton X-100（PBS 配）室溫通透10 min，用PBS 洗3 次每次5 min。封閉：1% BSA（PBS+0.05% Tween配制）室溫封閉1 h 后，一抗（Anti-TFEB antibody（CST，D2O7D）4°C 孵育過夜。用PBST 洗滌3次，每次10 min，去除非特異性結(jié)合后，細(xì)胞與帶有熒光素標(biāo)記的二抗在室溫結(jié)合1 h。PBST 洗滌3次，每次10 min，用激光共聚焦顯微鏡63 倍油鏡觀察。

1.9 線蟲運動檢測

在未涂菌的3.5 cm NGM培養(yǎng)基上滴1滴M9緩沖液，挑取一只待檢測的線蟲放置于M9 的液滴中，讓線蟲適應(yīng)30 s，然后在體式顯微鏡下統(tǒng)計線蟲30 s 之內(nèi)身體彎曲（body bend）的次數(shù)；在線蟲自然進(jìn)食條件下對其30 s 之內(nèi)吞咽次數(shù)（pumping）進(jìn)行統(tǒng)計，每次實驗統(tǒng)計15只線蟲。

1.10 統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s 表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LBP1C延緩成纖維細(xì)胞衰老

枸杞成分復(fù)雜，各組分可能發(fā)揮的功能不同，LBP1C是從枸杞子中提取的組分多糖（圖1a）。首選利用干燥成熟的枸杞果實通過酶（纖維素酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶）-水聯(lián)合提取的方法獲得枸杞粗多糖（LBP1），枸杞的干燥成熟果實（5.0 kg）經(jīng)酶-水聯(lián)合提取，并用5 倍體積的95%工業(yè)乙醇沉淀后得到LBP1（129 g，得率為2.58%）。枸杞粗多糖LBP1 采用陰離子交換法（DEAE）以及凝膠過濾色譜法（Sephacryl S-200 HR 及Sephacryl S-300 HR）分離純化得到組分多糖LBP1C，LBP1經(jīng)陰離子交換柱梯度洗脫后，得到0.05 mol/L NaCl洗脫組分LBP1A1（11.9 g，得率為9.22 %），0.1 mol/L NaCl 洗脫組分LBP1B（12.0 g，得率為9.30%）以及0.2 mol/L NaCl 洗脫組分LBP1C（13.9 g，得率為10.78%）［25］，接下來對其抗衰老及清除脂褐質(zhì)方面的功能進(jìn)行研究。復(fù)制衰老指體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止生長，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活動發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象。除了大部分腫瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，不同年齡階段不同生物供體來源的細(xì)胞均存在復(fù)制衰老現(xiàn)象。以來源于人真皮的成纖維細(xì)胞復(fù)制型衰老模型研究LBP1C 在抗衰老方面的作用。首先對復(fù)制型衰老細(xì)胞模型的年輕及衰老的細(xì)胞進(jìn)行表征，用SA-β-gal酶檢測試劑盒對HDF P10和HDF P25代次細(xì)胞進(jìn)行檢測，P25代次的SA-β-gal 陽性細(xì)胞數(shù)比例顯著高于P6 代次（圖1b），結(jié)果表明P6 細(xì)胞為年輕細(xì)胞，定義為年輕細(xì)胞（early passage，EP），P25代次為衰老細(xì)胞（late passage，LP）。用LBP1C 處理HDF P20 代次的細(xì)胞，處理2代次（6 d）后進(jìn)行衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LBP1C 處理組中的衰老標(biāo)志物P16、P21 的mRNA 表達(dá)量顯著降低（圖1c，d）。LAMIN B1 的丟失是細(xì)胞衰老的標(biāo)志物［26］，LBP1C 處理組中LAMIN B1 水平顯著高于對照組（圖1e）。SA-β- gal陽性細(xì)胞數(shù)在LBP1C處理組中也顯著下降（圖1f）。以上結(jié)果表明LBP1C延緩了人成纖維細(xì)胞的衰老。

Fig. 1 LBP1C delayed fibroblasts senescence

2.2 LBP1C降低GATA4水平，抑制SASP水平

接下來對LBP1C 延緩細(xì)胞衰老的機制進(jìn)行研究。GATA4 在激活衰老過程中起著關(guān)鍵作用。GATA4 受到自噬的抑制，但當(dāng)細(xì)胞衰老時自噬水平會降低，GATA4 開始積累，其表達(dá)誘發(fā)了與SASP相關(guān)基因的表達(dá)［23］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，LBP1C 處理組中GATA4 的水平顯著下降（圖2a），SASP因子IL-1β在LBP1C處理組也顯著下降（圖2b），iNOS的mRNA和蛋白質(zhì)水平也都顯著降低（圖2c，d）。以上結(jié)果表明，LBP1C 降低了GATA4水平，抑制了衰老細(xì)胞中的SASP。

Fig. 2 LBP1C reduced GATA4 level and suppressed SASP

2.3 LBP1C 增加TFEB入核，激活自噬

LBP1C 可以降低GATA4水平，而GATA4受到自噬活性的抑制，因此推測是LBP1C激活了自噬，從而降低了GATA4 的水平。首先檢測了溶酶體生物發(fā)生和自噬的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（TFEB）的入核水平。免疫熒光結(jié)果表明，相比于對照組，LBP1C 處理組增加了TFEB 入核比例（圖3a）。進(jìn)一步用溶酶體染料檢測溶酶體的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)LBP1C 處理組中溶酶體數(shù)量顯著高于對照組（圖3b）。對TFEB下游基因檢測表明，溶酶體水解酶、溶酶體膜蛋白及功能相關(guān)的囊泡性ATP 酶在LBP1C 處理組都顯著上調(diào)（圖3c），進(jìn)一步表明LBP1C 促進(jìn)了自噬的形成。進(jìn)一步對自噬水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)相比對照組，LC3II/I 的水平顯著升高，表明細(xì)胞自噬水平顯著升高（圖3d）。以上結(jié)果表明，LBP1C通過增加了TFEB入核從而激活了細(xì)胞自噬。

Fig. 3 LBP1C increased TFEB nuclear translocations and activated autophagy

2.4 LBP1C降低衰老細(xì)胞及線蟲的脂褐質(zhì)水平

LBP1C 提高了自噬水平，因為自噬可以清除細(xì)胞中的聚集物比如脂褐質(zhì)，所以進(jìn)一步在細(xì)胞及個體水平對LBP1C 如何影響脂褐質(zhì)的水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)LBP1C 處理組的細(xì)胞中的脂褐質(zhì)顯著低于對照組（圖4a）。在線蟲水平，將5 g/L 的LBP1C 混合進(jìn)OP50 菌液中，從線蟲Day1 開始進(jìn)行喂食，對線蟲的脂褐質(zhì)水平及線蟲的運動能力進(jìn)行檢測。LBP1C 處理的Day8 線蟲中脂褐質(zhì)水平顯著低于對照組（圖4b），表明LBP1C可以降低線蟲的脂褐質(zhì)。Day10線蟲進(jìn)入衰老階段，線蟲的身體運動相關(guān)指標(biāo)從Day10 開始出現(xiàn)差異，LBP1C 顯著提高了線蟲的運動頻率和進(jìn)食速度（圖4c，d）。以上結(jié)果表明，LBP1C 減緩了由于衰老導(dǎo)致的脂褐質(zhì)積累及線蟲運動能力和進(jìn)食能力的下降，促進(jìn)了線蟲的健康衰老。

綜上所述，本研究表明，LBP1C 通過增加TFEB入核，提高了溶酶體發(fā)生，增強了細(xì)胞自噬水平。自噬水平的提高一方面使轉(zhuǎn)錄因子GATA4降低，從而抑制了衰老相關(guān)的SASP表型，另一方面自噬水平的提高降低了衰老過程中產(chǎn)生的脂褐質(zhì)，因此LBP1C延緩了衰老（圖4e）。

Fig. 4 LBP1C reduced lipofuscin in HDF cells and C. elegans’ and enhanced motility of C. elegans

3 討論

本研究對從枸杞子中分離得到的一種組分多糖LBP1C 在細(xì)胞及線蟲體系水平上其抗衰老及潛在美白的效應(yīng)及機制進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，LBPC1降低了自然衰老細(xì)胞標(biāo)志物水平，并降低了SASP，減少了細(xì)胞及線蟲中脂褐質(zhì)水平，提高了線蟲的運動能力，促進(jìn)了健康衰老。機制上發(fā)現(xiàn)LBPC1 促進(jìn)了TFEB入核，提高了溶酶體的含量及細(xì)胞的自噬水平，從而降低了SASP的調(diào)控因子GATA4的水平，進(jìn)而減少了SASP。同時自噬-溶酶體系統(tǒng)的激活也促使細(xì)胞內(nèi)聚集的底物脂褐質(zhì)的降解，因此降低了脂褐質(zhì)的水平。通過本研究發(fā)現(xiàn)了枸杞抗衰老和抑制脂褐質(zhì)的有效成分LBP1C，并揭示了其新的機制，為枸杞的廣泛應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

3.1 利用自然衰老的模型研究枸杞LBP1C抗衰作用，并發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)健康衰老的功效

本研究利用自然衰老的人成纖維細(xì)胞模型及自然衰老的線蟲模型進(jìn)行了LBP1C 功效及機制的研究，發(fā)現(xiàn)其降低SASP及降低脂褐質(zhì)的作用。相比以往很多研究是通過加速衰老的小鼠模型［10］或者一些氧化劑處理或刺激進(jìn)行研究［8］，本研究更能模擬枸杞在日常生活中的自然應(yīng)用，為使用者提供實用的參考信息。抗衰的新宗旨是“健康衰老”，要實現(xiàn)“老而不衰”，即：老齡時也能保持相較于普通水平更高的身體機能水平。之前的研究揭示了鍛煉緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還原應(yīng)激從而促進(jìn)健康衰老的機制［27］，本研究中發(fā)現(xiàn)LBP1C 可以使衰老的線蟲的運動能力得到提高，說明枸杞促進(jìn)了線蟲健康衰老，作為藥食同源的中藥在促進(jìn)健康衰老方面具有重要的實用價值。

3.2 發(fā)現(xiàn)枸杞LBP1C通過TFEB激活自噬延緩衰老新機制

本研究揭示了枸杞子的有效成分LBP1C 發(fā)揮功能的新機制：LBP1C激活了TFEB，促進(jìn)溶酶體的發(fā)生及自噬活性從而產(chǎn)生抗衰老及清除脂褐質(zhì)的效應(yīng)。研究表明，衰老過程中自噬能力是顯著下降的［28］，自噬是蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，自噬能力下降直接導(dǎo)致SASP的重要轉(zhuǎn)錄因子GATA4的積累，從而激活SASP，導(dǎo)致衰老［29］。LBP1C 顯著提高自噬水平從而具有抑制衰老的潛能，而且與SASP 相關(guān)的IL-1β 及炎癥相關(guān)的iNOS水平顯著下降，相應(yīng)衰老的標(biāo)志物P16、P21和β-gal 活性顯著下降，線蟲由于衰老導(dǎo)致運動能力的下降也得到了挽回；自噬水平的提升也是降低脂褐質(zhì)的原因之一，該研究為枸杞抗衰的功效理解提供了新的科學(xué)證據(jù)。以往研究多從其抗氧化的角度出發(fā)，清除自由基、抑制脂質(zhì)氧化從而抑制脂褐質(zhì)；本研究揭示了枸杞子可以通過激活自噬清除脂褐質(zhì)前體物質(zhì)從而減少脂褐質(zhì)?？傊?，本文從枸杞子中提取了全新的化合物，并為其抗衰老、潛在美白的功效提供了新的機制。

美白實際包含了兩方面內(nèi)容：美是細(xì)胞不老；白是脂褐質(zhì)等沉積少。本研究從延緩衰老和清除脂褐質(zhì)沉積兩個方面揭示了枸杞子功效成分LBP1C的新作用和新的分子機制，闡釋了《本草綱目》記載的枸杞子輕身不老、易顏色、變白的功效的科學(xué)內(nèi)涵。未來將深入研究LBP1C調(diào)控TFEB入核的機制，并在哺乳動物中進(jìn)行驗證本研究發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)及機制，為枸杞在未來的轉(zhuǎn)化及應(yīng)用中提供充分的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究使用人類成纖維細(xì)胞和線蟲作為自然衰老的模型，發(fā)現(xiàn)LBP1C 可以降低人成纖維細(xì)胞中P16、P21的表達(dá)水平以及SA-β-gal 染色陽性細(xì)胞的數(shù)量，表明LBP1C 可以延緩細(xì)胞衰老。進(jìn)一步研究表明，LBP1C 發(fā)揮抗衰老作用是通過降低SASP 和脂褐質(zhì)水平。機制上，LBP1C 通過促進(jìn)TFEB 入核增加自噬，并減少細(xì)胞和秀麗隱桿線蟲中SASP和脂褐素的積累。同時，LBP1C提高了線蟲衰老過程中的運動能力，促進(jìn)健康衰老。本文研究了從枸杞子中提取的LBP1C 的新功能和機制，表明其通過促進(jìn)自噬來延緩細(xì)胞衰老，從而達(dá)到抗衰老和皮膚美白的效果。