趙 軍 張冰茜 趙毅航 王曉軒

（1）河北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，天津 300130；2）河北省生物電磁與神經(jīng)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（河北工業(yè)大學(xué)），天津 300130；3）天津市生物電工與智能健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（河北工業(yè)大學(xué)），天津 300130）

隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展以及電氣化設(shè)備在生活中的應(yīng)用不斷增加，無(wú)線電能傳輸（wireless power transfer，WPT）作為一種借助空間無(wú)形軟介質(zhì)（如聲波、機(jī)械波、磁場(chǎng)、電場(chǎng)等）通過(guò)電源端將電能隔空傳遞至用電設(shè)備的新型電能傳輸方式，具有使用壽命長(zhǎng)、安全性和靈活性高的特點(diǎn)［1］，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，該技術(shù)已應(yīng)用于機(jī)器人、智能家居、交通等工業(yè)領(lǐng)域［2-6］。目前，WPT根據(jù)傳輸過(guò)程中能量形式的不同主要分為3種方式：a. 基于分離變壓器原理的電磁感應(yīng)式；b. 基于微波輻射的傳輸方式；c. 磁耦合諧振式。其中，由于磁耦合諧振式無(wú)線電能傳輸（magnetically-coupled resonant wireless power transfer，MCR-WPT）可在數(shù)米范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)無(wú)線供電，具有傳輸距離較遠(yuǎn)、電磁干擾小、傳輸效率高等特點(diǎn)，在工業(yè)方面優(yōu)于其他傳輸方式而被廣泛應(yīng)用［7-8］。然而，大量研究表明，生物體在一定的電磁環(huán)境中生存，生物體的不同部位會(huì)產(chǎn)生不同程度的變化，影響生物體的神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌等維持生命活動(dòng)正常運(yùn)動(dòng)的功能變化，導(dǎo)致記憶力障礙、情緒易變、抑郁等行為記憶方面的問(wèn)題，有的轉(zhuǎn)變甚至是不可逆的［9-11］。為了使MCR-WPT 更好地運(yùn)用于市場(chǎng)當(dāng)中，人體在MCR-WPT運(yùn)行的電磁環(huán)境中的安全性是研究的熱點(diǎn)之一。

目前有關(guān)WPT 電磁環(huán)境的安全性研究大多利用軟件仿真計(jì)算、對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)限值來(lái)得出是否安全的結(jié)論，若要將該技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于市場(chǎng)，尚缺乏生物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)支撐［12］。在現(xiàn)有有關(guān)電磁環(huán)境的安全性研究當(dāng)中，長(zhǎng)期接受射頻（900 MHz）電磁輻射可導(dǎo)致大鼠的海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并對(duì)大鼠認(rèn)知能力產(chǎn)生不利影響［13-14］。膜電位是反映細(xì)胞功能的重要指標(biāo)［15］，低頻電磁場(chǎng)會(huì)影響離子的跨膜運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而影響細(xì)胞膜電位的變化，使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生改變［16-17］。而脈沖磁場(chǎng)和射頻磁場(chǎng)會(huì)影響皮層神經(jīng)元細(xì)胞膜上K+通道的激活、失活等特性，從而影響神經(jīng)元的生理特性［18-20］。

因海馬區(qū)是人體易受電磁環(huán)境影響的敏感區(qū)域，其中齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)在與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的三突觸回路中扮演著至關(guān)重要的角色［21］，故本文選用小鼠海馬區(qū)DG區(qū)顆粒神經(jīng)元作為研究對(duì)象。神經(jīng)元信息系統(tǒng)中的信息傳遞主要依靠膜電位的發(fā)放、頻率、峰值來(lái)對(duì)離子通道進(jìn)行調(diào)控［22］，離子通道由跨膜蛋白構(gòu)成，使Na+、K+和Cl-穿過(guò)，改變細(xì)胞內(nèi)部和外部的電位差以此來(lái)改變細(xì)胞的生理活動(dòng)。由于膜內(nèi)無(wú)閘門(mén)控制的K+通道遠(yuǎn)多于Na+通道，使得神經(jīng)元細(xì)胞膜對(duì)于Na+的滲透性遠(yuǎn)低于K+，且Na+通道的通道電導(dǎo)在相同強(qiáng)度相同頻率磁場(chǎng)中的變化并不明顯［23-24］，故實(shí)驗(yàn)采用膜片鉗技術(shù)，從離子通道角度研究WPT 電磁環(huán)境對(duì)顆粒神經(jīng)細(xì)胞K+通道的影響。利用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶情況，探究磁場(chǎng)暴露對(duì)神經(jīng)元和學(xué)習(xí)記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

人工腦脊液（ACSF）：NaCl 134 mmol/L，KCl 5 mmol/L， NaH2PO41.5 mmol/L， MgSO42 mmol/L，CaCl22 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH 7.3，使用前通95% O2+5% CO2混合氣飽和。高糖切片液：KCl 2.5 mmol/L，CaCl21 mmol/L，MgCl26 mmol/L， NaH2PO41.625 mmol/L， NaHCO326 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，蔗糖220 mmol/L，pH 7.4，使用前通95% O2+5% CO2混合氣飽和。動(dòng)作電位電極內(nèi)液：葡萄糖酸鉀（K-gluconate）125 mmol/L，NaCl 15 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl21 mmol/L， EGTA 11 mmol/L， HEPES 10 mmol/L，Na-ATP 3 mmol/L，Na-GTP 0.3 mmol/L。用KOH 將pH 調(diào)至7.2~7.3，分裝冷凍前及使用前都要經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾。K+通道記錄細(xì)胞外液：NaCl 130 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，MgCl21 mmol/L， 葡萄糖10 mmol/L， HEPES 10 mmol/L，TTX 0.001 mmol/L，CdCl20.2 mmol/L。用NaOH 將pH 調(diào)至7.4。K+通道記錄電極內(nèi)液：KCl 140 mmol/L， MgCl22 mmol/L， EGTA 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Mg-ATP 2 mmol/L。用KOH 將pH 調(diào)至7.2，分裝冷凍前及使用前都要經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.2 腦片的制備與孵育

選用24只1月齡健康雄性昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，購(gòu)買(mǎi)于北京華阜生物科技股份有限公司。使用10%濃度的水合氯醛溶液對(duì)其進(jìn)行腹腔注射進(jìn)行深度麻醉，迅速斬首取腦，剝離出切除額葉前端和小腦后端的大腦部分并浸泡在提前準(zhǔn)備好的0~4℃冰水混合狀態(tài)且含飽和氧氣的切片液中，為確保神經(jīng)細(xì)胞的活性，整個(gè)過(guò)程控制在3 min以內(nèi)。待大腦在切片液中降溫2~3 min后取出，用濾水紙吸干大腦表面溶液，將其斷面大口朝下放置涂有502膠水的切片槽中央，倒入含有冰塊的切片液，調(diào)整切片機(jī)刀片進(jìn)刀角度，后用VT1200S 切片機(jī)（德國(guó)徠卡）在冰芯切片液中切出300 μm 的腦切片，用吸管選擇具有完整海馬區(qū)域的腦片，并將其置于持續(xù)通有95% O2+5% CO2混合氣體的人工腦脊液孵育槽中，保持孵育槽溫度在28℃的環(huán)境中，孵育約1 h 后用于實(shí)驗(yàn)。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全部?jī)?nèi)容均根據(jù)中國(guó)相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行，由河北工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（編號(hào)為HEBUTaCUC2020007），且符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范。

1.3 磁場(chǎng)裝置及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用小功率MCR-WPT裝置，高頻電源通過(guò)發(fā)射線圈傳輸高頻交變電流，然后與接收線圈發(fā)生磁耦合諧振，從而實(shí)現(xiàn)電能從發(fā)射端到接收端的高效無(wú)線傳輸過(guò)程，可通過(guò)觀察發(fā)射端與接收端分別帶有的功率表調(diào)整功率，無(wú)線電能傳輸裝置工作頻率位于45~60 kHz 之間，實(shí)際所采用頻率為f=（L為線圈電感，C為補(bǔ)償電容），發(fā)射線圈與接收線圈相距200 mm、發(fā)射線圈Pin≈54.2 W，負(fù)載接收端控制在（25±0.5）W，發(fā)射線圈與接收線圈為邊長(zhǎng)32 cm的正方形基板，線圈材料為定制的利茲線，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)如圖1所示。

在小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，將小鼠隨機(jī)分為4組，A、B、C 組為實(shí)驗(yàn)組（A 組輻射5 d、B 組輻射15 d、C 組輻射30 d），D 組對(duì)照組，每個(gè)組均為6只小鼠。打開(kāi)無(wú)線電能傳輸試驗(yàn)箱，將實(shí)驗(yàn)組的鼠籠每天放置于發(fā)射線圈與接受線圈之間的中部暴露5 h。由于兩線圈規(guī)格大小的關(guān)系，兩個(gè)鼠籠疊加放置，每日開(kāi)始前交換鼠籠位置（圖1c）。對(duì)照組在每天相同條件下，但不打開(kāi)無(wú)線電能傳輸裝置。

為明確兩線圈之間的磁場(chǎng)分布情況，以線圈為中心做一個(gè)垂直于線圈的切面，并計(jì)算該切面上線圈電磁場(chǎng)的分布情況（圖2）。根據(jù)三維電磁輻射分析儀的測(cè)量結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析可知，小鼠活動(dòng)范圍的電場(chǎng)強(qiáng)度平均值為316.8 V/m，磁感應(yīng)強(qiáng)度平均值為272.5 μT，小鼠頭部感應(yīng)電場(chǎng)強(qiáng)度峰值為0.806 49 V/m［25］。

Fig. 1 The electromagnetic exposure experimental platform of WPT

Fig. 2 Distribution of magnetic field

1.4 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

小鼠輻射結(jié)束后，依次單獨(dú)放入新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)箱（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)包含3 個(gè)階段：熟悉期、測(cè)試I 期和測(cè)試II期。熟悉期：提前在箱中底部靠近箱體的一側(cè)平行擺放兩個(gè)完全相同的物體，讓小鼠在安靜且不被打擾的環(huán)境中自由活動(dòng)5 min后將其取出，放回飼養(yǎng)籠中。測(cè)試I 期：待熟悉期結(jié)束1 h 后進(jìn)行，將其中一個(gè)物體替換成另一個(gè)形狀顏色不同但尺寸相當(dāng)?shù)男挛矬w后，將小鼠放入相同的環(huán)境中自由活動(dòng)5 min后取出，放回飼養(yǎng)籠中。測(cè)試II期：測(cè)試I期結(jié)束24 h后進(jìn)行，將另一舊物體替換成另一個(gè)形狀顏色不同但尺寸相當(dāng)?shù)男挛矬w后，在相同的環(huán)境中放入小鼠自由活動(dòng)5 min 后取出，放回飼養(yǎng)籠中。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，配備Any-maze 行為學(xué)跟蹤軟件跟隨并記錄小鼠的行為軌跡［26-27］。每只小鼠從實(shí)驗(yàn)箱被取出后都需用75%的酒精對(duì)箱體進(jìn)行擦拭，防止上一只小鼠遺留的氣味對(duì)后來(lái)的小鼠行動(dòng)造成影響。計(jì)算新物體的認(rèn)知指數(shù)（cognitive index，CI），計(jì)算方法為認(rèn)知指數(shù)=探索新物體的時(shí)間/（探索新物體的時(shí)間+探索舊物體的時(shí)間）［28］。通過(guò)測(cè)試I期與測(cè)試II 期獲得的認(rèn)知指數(shù)分別記為CI(1 h)與CI(24 h)。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄

在20~25℃室溫環(huán)境內(nèi)，使用EPC10膜片鉗信號(hào)放大器（HEKA公司，德國(guó)）進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，實(shí)驗(yàn)采用外徑1.5 mm 內(nèi)徑0.86 mm 規(guī)格硼硅酸鹽材質(zhì)的玻璃微電極，經(jīng)P-97 拉制儀（SUTTER 公司，美國(guó)）兩步拉制獲得，往電極中灌注解凍后的電極內(nèi)液至電極針身1/3處，避免安裝電極時(shí)內(nèi)液溢出污染電極夾持器，灌注后可捏住電極尾部輕輕甩動(dòng)，將電極內(nèi)的氣泡排出。

將灌注好的電極固定在電極夾持器上，用吸管選取孵育完成的腦片平鋪在膜片鉗操作臺(tái)上的記錄槽中，并用尼龍網(wǎng)固定，在低倍鏡下將腦片海馬齒狀回尖端移至視野中央后切換為高倍鏡及紅外場(chǎng)，在水鏡下鎖定海馬DG區(qū)內(nèi)的一個(gè)顆粒細(xì)胞后標(biāo)記位置上抬鏡頭，將電極緩慢移入記錄槽中可看到阻抗為5~10 MΩ，當(dāng)電極與細(xì)胞膜之間形成高阻封接后（>1 G），給予快電容補(bǔ)償，然后用注射器給予適量的脈沖式負(fù)壓進(jìn)行破膜。破膜成功即可看到阻值跳變至200~300 MΩ左右，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)液與電極內(nèi)液相通，待電阻穩(wěn)定后給予慢電容補(bǔ)償，之后將記錄模式更改為電流鉗模式，可用于記錄電壓信號(hào)，膜電流置零記錄靜息膜電位，給予足夠的去極化電流刺激記錄誘發(fā)動(dòng)作電位，將記錄模式更改為電壓鉗模式，可用于記錄離子通道電流信號(hào)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用非重復(fù)測(cè)量的單因素方差（one-way ANOVA）分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間的多重比較采用Tukey-test 分析方法，事后分析采用Tukey-test矯正下的成對(duì)t檢驗(yàn)分析方法。使用GraphPad Prism 6.0 和Origin2017 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并以mean±SEM的方式表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)0.05。

2 結(jié)果

2.1 MCR-WPT對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

在熟悉期的實(shí)驗(yàn)階段中，對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。磁場(chǎng)暴露5 d 組和磁場(chǎng)暴露15 d組的運(yùn)動(dòng)軌跡密集程度較高，磁場(chǎng)暴露30 d組運(yùn)動(dòng)軌跡最為稀疏，運(yùn)行軌跡如圖3所示。為判定小鼠在不同磁場(chǎng)暴露環(huán)境下的運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)其在熟悉期的運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度進(jìn)行定性分析（圖4），小鼠磁場(chǎng)暴露組與對(duì)照組在熟悉期的運(yùn)動(dòng)軌跡長(zhǎng)度皆無(wú)顯著差異。

Fig. 3 Motion trajectory during the familiarization period

Fig. 4 Length of motion trajectory during the familiarization period

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置顏色及形狀各異的兩類(lèi)物體來(lái)獲得小鼠對(duì)新舊物體的喜好程度，分別計(jì)算了測(cè)試I期和測(cè)試II期小鼠探索新舊物體的次數(shù)比和認(rèn)知指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30 d輻射組與對(duì)照組的新物體識(shí)別能力差異最大且CI低于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異（圖5）。

Fig. 5 Test period data analysis

2.2 MCR-WPT對(duì)瞬時(shí)外向鉀通道電流（IA）的影響

本文主要研究對(duì)電流-電壓（I-V）曲線的影響。使用K+通道電極內(nèi)液和全細(xì)胞外液，并在外液中加入終濃度為25 mmol/L 的TEA-Cl，使用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4。用于阻斷神經(jīng)元上的Ca2+電流、Na+電流和延遲整流K+電流。

a. 在全細(xì)胞膜記錄模式下，將鉗制電位設(shè)定為-100 mV，給予細(xì)胞-50~+90 mV，步階10 mV，波寬為200 ms 的去極化脈沖刺激（圖6a）后，可得到一組外向電流IA。以膜電位為橫軸，該膜電位下激活的IA峰值為縱軸，繪制IA的I-V曲線（圖6b）。對(duì)同一膜電位下的電流峰值分析，對(duì)照組IA電流峰值明顯大于磁場(chǎng)暴露組，磁場(chǎng)暴露30 d組的IA最小，磁場(chǎng)暴露5 d組的IA在磁場(chǎng)暴露組中最高，但仍顯著小于對(duì)照組，且隨著去極化電壓的變化，磁場(chǎng)暴露時(shí)間的增加對(duì)IA峰值的抑制作用更為明顯。說(shuō)明MCR-WPT電磁環(huán)境可明顯抑制瞬時(shí)外向鉀電流IA，且其影響程度隨著暴露天數(shù)的增加而增強(qiáng)，具有時(shí)間依賴性。

b. 在全細(xì)胞膜記錄模式下，將鉗制電位設(shè)定為-100 mV，預(yù)先給予-110 mV波寬400 ms的超極化條件刺激，然后給予-50~+90 mV，步階10 mV，波寬為150 ms 的去極化測(cè)試脈沖至+90 mV（圖7a），得到一組瞬時(shí)外向鉀電流，此為IA的穩(wěn)態(tài)激活過(guò)程。使用公式G=I∕(Vm-Vr)將瞬時(shí)外向鉀電流值轉(zhuǎn)換為電導(dǎo)值，其中G為電導(dǎo)，I為不同測(cè)試脈沖下的峰值電流，Vm為膜電位，Vr為反轉(zhuǎn)電位。以膜電位為橫坐標(biāo)，G∕Gmax為縱坐標(biāo)，繪制通道的激活散點(diǎn)圖。然后使用Boltzmann 方程對(duì)得到的激活散點(diǎn)圖進(jìn)行擬合，其中Vm為膜電位，為半數(shù)激活電壓，k為斜率因子（圖7b）。根據(jù)得到的曲線圖可以看出對(duì)照組與磁場(chǎng)暴露組皆呈S形，且與對(duì)照組相比，磁場(chǎng)暴露組曲線皆向右偏移。使用t檢驗(yàn)分析方法，可以看出對(duì)照組與磁場(chǎng)暴露組IA的半數(shù)激活電壓V12之間的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而斜率因子k的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯（表1）。由此可知，MCR-WPT電磁環(huán)境不改變其斜率因子，但可使IA的激活特性發(fā)生明顯改變，令激活曲線向去極化方向移動(dòng)，提高瞬時(shí)外向鉀通道蛋白的激活膜電位。

Fig. 6 I-V stimulation procedure (a) and I-V curve (b) of IA

Table 1 The activation parameters of IA

c. 在全細(xì)胞膜記錄模式下，將鉗制電位設(shè)定為-100 mV，預(yù)先給予-110~+10 mV，步階10 mV，波寬為80 ms 的階梯去極化條件脈沖，然后給予+50 mV波寬80 ms的測(cè)試脈沖（圖8a），得到一組瞬時(shí)外向鉀電流，此為IA的穩(wěn)態(tài)失活過(guò)程。繪制以膜電位為橫坐標(biāo)，電流峰值與電流最大峰值的比值I/Imax為縱坐標(biāo)的失活散點(diǎn)圖。然后使用Boltzmann方程I∕Imax= 1∕{1 + exp [(Vm-V12)∕k]}對(duì)得到的失活散點(diǎn)圖進(jìn)行擬合，其中I為每條測(cè)試脈沖下的電流峰值，Vm為膜電位，V12為半數(shù)失活電壓，k為斜率因子（圖8b）。由繪制曲線圖可以看出對(duì)照組與磁場(chǎng)暴露組皆呈反S形，且與對(duì)照組相比，磁場(chǎng)暴露組曲線皆向左偏移，其中磁場(chǎng)暴露30 d組的斜率因子k顯著小于對(duì)照組（表2）。由此可知，長(zhǎng)時(shí)間處于MCR-WPT電磁環(huán)境中可使IA的失活特性發(fā)生明顯的改變，令失活曲線向去極化方向移動(dòng)，并改變其斜率因子，縮短瞬時(shí)外向鉀通道蛋白的開(kāi)放時(shí)間，提高失活速率。

Fig. 8 Deactivation stimulation procedure (a) and deactivation curve (b) of IA

Table 2 The deactivation parameters of IA

d. 在全細(xì)胞膜記錄模式下，將鉗制電位設(shè)置為-100 mV，預(yù)先給予兩個(gè)+50 mV波寬80 ms的條件脈沖與測(cè)試脈沖，兩個(gè)脈沖間隔保持鉗制電位-100 mV，時(shí)間1~256 ms（圖9a），得到一組瞬時(shí)外向K+電流，即IA的失活再恢復(fù)的過(guò)程。以間隔時(shí)間為橫坐標(biāo)，測(cè)試脈沖的峰電流與條件脈沖的峰電流的比值I2/I1為縱坐標(biāo)繪制恢復(fù)散點(diǎn)圖。然后利用公式I2∕I1=A+B× exp (-t∕τ)對(duì)得到的恢復(fù)散點(diǎn)圖進(jìn)行擬合，其中I2為測(cè)試脈沖的峰電流，I1為條件脈沖的峰電流，τ為恢復(fù)時(shí)間常數(shù)（圖9b）。由繪制曲線圖可以看出與對(duì)照組相比，磁場(chǎng)暴露組皆向右偏移，其中磁場(chǎng)暴露15 d組和30 d組的IA失活后的恢復(fù)時(shí)間與對(duì)照組相比顯著延長(zhǎng)（表3）。

Fig. 9 Resurrection stimulation procedure (a) and resurrection curve (b) of IA

Table 3 The recovery parameters of IA

2.3 MCR-WPT對(duì)延遲整流K+通道電流（IK）的影響

本文主要考察對(duì)I-V曲線的影響。使用K+通道電極內(nèi)液和全細(xì)胞外液，并在外液中加入終濃度為3 mmol/L的4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP），使用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4。用于阻斷神經(jīng)元上的Na+電流、Ca2+電流和瞬時(shí)外向K+電流。由于延遲整流K+通道電流的激活過(guò)程為延遲激活，具有短時(shí)間內(nèi)不失活，失活速度緩慢的特點(diǎn)，因此在實(shí)驗(yàn)中不考慮IK的失活與恢復(fù)過(guò)程［29］。

a. 在全細(xì)胞膜記錄模式下，將鉗制電位設(shè)定為-50 mV，給予-50~+90 mV，步階10 mV 波寬為300 ms 的去極化脈沖刺激（圖10a），得到一組外向電流IK。以膜電位為橫軸，同一膜電位下激活的IK峰值為縱軸，繪制IK的I-V曲線（圖10b）。對(duì)同一膜電位下的電流峰值分析，對(duì)照組IK電流峰值明顯大于磁場(chǎng)暴露組，磁場(chǎng)暴露30 d組的IK最小，磁場(chǎng)暴露15 d 組與5 d 組的IK相近，但仍與對(duì)照組之間存在顯著性差異。說(shuō)明MCR-WPT電磁環(huán)境可明顯抑制延遲整流鉀電流IK，且隨著去極化電壓的變化，磁場(chǎng)暴露時(shí)間的增加對(duì)IK峰值的抑制作用更為明顯，具有時(shí)間依賴特性。

Fig. 10 I-V stimulation procedure (a) and I-V curve (b) of IK

b. 在全細(xì)胞膜記錄模式下，將鉗制電位設(shè)定為-50 mV，預(yù)先給予-110 mV 波寬為400 ms 的超極化條件刺激，然后給予-50~+90 mV，步階10 mV，波寬為150 ms 的去極化測(cè)試脈沖（圖11a），得到一組延遲整流鉀電流，此為IK的穩(wěn)態(tài)激活過(guò)程。利用公式G=I∕(Vm-Vr)將所得延遲整流鉀電流值轉(zhuǎn)換為電導(dǎo)值，其中G為電導(dǎo)，I為不同測(cè)試脈沖下的電流峰值，Vm為膜電位，Vr為反轉(zhuǎn)電位，以膜電位為橫坐標(biāo)，G∕Gmax為縱坐標(biāo)，繪制通道的激活散點(diǎn)圖。然后利用Boltzmann 方程G∕Gmax=1∕{1 + exp [(Vm-V12)∕k]}對(duì)得到的散點(diǎn)圖進(jìn)行擬合，其中Vm為膜電位，V12為半數(shù)激活電壓，k為斜率因子（圖11b）。由繪制曲線圖可以看出對(duì)照組與磁場(chǎng)暴露組皆呈S形，且與對(duì)照組相比，磁場(chǎng)暴露組曲線皆向右偏移。使用t檢驗(yàn)分析方法，可以看出對(duì)照組與磁場(chǎng)暴露組IK的半數(shù)激活電壓V12之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而斜率因子k的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯（表4）。由此可知，MCR-WPT電磁環(huán)境不改變其斜率因子，但可使IK的激活特性發(fā)生明顯改變，令激活曲線向去極化方向移動(dòng)，提高延遲整流鉀通道的激活膜電位。

Fig. 11 Activating stimulus program (a) and activation curve (b) of IK

Table 4 The activation parameters of IK

3 討論

國(guó)際上已有大量報(bào)告指出，不同頻段的電磁波會(huì)對(duì)生物的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，引起生物行為和記憶等方面問(wèn)題［30-32］。本文主要從離子通道的角度利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究頻率為47 KHz 小功率MCR-WPT電磁環(huán)境對(duì)小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元電壓門(mén)控膜電流IA和IK的影響。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)通過(guò)更改實(shí)驗(yàn)箱中物體的形狀、顏色觀察小鼠的識(shí)別記憶能力，基于小鼠對(duì)新舊事物的探索偏好來(lái)反映小鼠的記憶能力。結(jié)果表明，在頻率為47 KHz 的小功率MCR-WPT 電磁環(huán)境中，每天暴露5 h，連續(xù)30 d 暴露，小鼠的識(shí)別能力和記憶功能沒(méi)有受到影響。膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，磁場(chǎng)暴露組IA與IK的I-V曲線的激活曲線顯著降低，且隨著暴露時(shí)間的增加，受到的抑制作用更明顯，使膜的去極化過(guò)程延遲，提高了神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的速度，改變神經(jīng)元之間的傳導(dǎo)速度。磁場(chǎng)暴露組IA與IK的半數(shù)激活電壓V12在電磁環(huán)境的作用下明顯增大，激活曲線明顯右移，斜率因子無(wú)明顯改變，可以看出K+通道的激活閾值增大，激活難度增加，但激活速率不變。另外，IA的半數(shù)失活電壓V12減小，恢復(fù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，縮短了激活過(guò)程，同時(shí)IA恢復(fù)時(shí)間的顯著延長(zhǎng)，使電壓門(mén)控K+通道的開(kāi)放時(shí)間縮短，抑制了細(xì)胞膜電位的復(fù)極化過(guò)程。

根據(jù)生物電磁學(xué)理論，神經(jīng)元作為神經(jīng)系統(tǒng)基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，神經(jīng)興奮性是神經(jīng)元在放電狀態(tài)和靜息狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)機(jī)制［33］，與K+通道的開(kāi)放與關(guān)閉密切相關(guān)。當(dāng)磁場(chǎng)作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜表面的極性類(lèi)脂分子形成的電偶極子會(huì)受到電磁場(chǎng)的影響，改變細(xì)胞膜通道內(nèi)離子能量，引起離子跨膜遷移的變化，改變細(xì)胞膜的厚度、電導(dǎo)和電容［34］。本文研究結(jié)果中，IA與IK的激活過(guò)程與IA的失活過(guò)程受到抑制，IA的失活過(guò)程受到促進(jìn)，可能是在外加磁場(chǎng)的作用下，改變了K+通道蛋白的開(kāi)放頻率，提高了神經(jīng)元的敏感性。由于K+在設(shè)置靜息電位與動(dòng)作電位下降的過(guò)程中起著重要作用，阻礙K+外流，提高了細(xì)胞內(nèi)的電位水平，使細(xì)胞持續(xù)處于較高的興奮狀態(tài)。李剛等［35-36］研究不同強(qiáng)度工頻磁場(chǎng)對(duì)神經(jīng)元瞬時(shí)外向K+通道和延遲整流K+通道的影響，與本文有著相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，工頻磁場(chǎng)都對(duì)IA與IK產(chǎn)生了抑制作用，改變神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，短時(shí)間內(nèi)在MCR-WPT電磁環(huán)境下生活，會(huì)令細(xì)胞膜上瞬時(shí)外向K+通道的激活過(guò)程受到抑制、延遲整流K+通道的激活特性向去極化方向移動(dòng)，減少細(xì)胞內(nèi)K+的外流，增強(qiáng)神經(jīng)興奮性。有相關(guān)研究表明，在外加電磁場(chǎng)的作用下，組成K+通道孔洞的重要蛋白質(zhì)α螺旋蛋白質(zhì)分子會(huì)改變離子跨膜遷移的幾率，從而影響離子通道蛋白的開(kāi)放過(guò)程［19］，這種改變是否可逆尚不確定。可在下一步實(shí)驗(yàn)中開(kāi)展對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)、通道蛋白或其他區(qū)域的研究，完善WPT 電磁場(chǎng)作用機(jī)理，為WPT 技術(shù)的發(fā)展及其合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供具有一定參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。