莫勇真 王裕民 范春梅 晏其佳 曾朝陽 蔣衛(wèi)紅 熊 芳**

（1）國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，長沙 410078；2）國家衛(wèi)健委癌變原理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部癌變與侵襲原理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中南大學(xué)腫瘤研究所，長沙 410078）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種來源于鼻咽上皮的惡性腫瘤，在東南亞國家和中國南方地區(qū)高發(fā)［1］。其發(fā)病部位隱蔽，早期癥狀不明顯或者沒有特異性，大部分鼻咽癌患者確診時已出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［2-4］。盡管目前調(diào)強(qiáng)放療和聯(lián)合化療在早期鼻咽癌患者中取得了較好的療效，但在部分中晚期患者中療效不佳［5-8］。因此，深入研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的分子標(biāo)記和治療靶點(diǎn)，已成為該領(lǐng)域迫切需要解決的科學(xué)問題。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由前體RNA反向剪接形成首尾相連、無5'端帽子和3'端PolyA 尾的一類特殊構(gòu)型RNA，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)circRNA在人體內(nèi)廣泛表達(dá)［9-11］。由于沒有游離的5'和3'端，circRNA比線性RNA 更穩(wěn)定，加上它們含量豐富，circRNA作為分子標(biāo)志物在疾病的輔助診斷方面具有明顯的優(yōu)勢［12］。circRNA 還可通過多種途徑發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，包括：作為微小RNA（microRNA，miRNA）海綿通過競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）形式調(diào)控其他基因表達(dá)［13］；結(jié)合其他蛋白質(zhì)并影響靶蛋白的表達(dá)和功能［14］；或直接翻譯出小肽發(fā)揮功能［15］等。越來越多的證據(jù)表明，circRNA在包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［16-18］。然而，大量circRNA在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的功能和調(diào)控機(jī)制還值得深入研究。

circPVT1 是由長鏈非編碼RNA （long noncoding RNA，lncRNA）PVT1基因的第2 號外顯子反向拼接而成，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并可促進(jìn)腫瘤的增殖和耐藥等表型［19-20］，在鼻咽癌患者中已發(fā)現(xiàn)circPVT1 可以結(jié)合β-TrCP 蛋白，阻斷β-TrCP 與c-Myc 結(jié)合，從而抑制c-Myc 的泛素化降解，促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移［21］，然而circPVT1 是否還有其他作用機(jī)制值得更深入研究。本文發(fā)現(xiàn)circPVT1 還可以通過吸附miR-24-3p 和let-7a-5p 上調(diào)FSCN1 的表達(dá)，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了circPVT1 是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要驅(qū)動因子，并為鼻咽癌的診療提供了一個潛在的分子標(biāo)記和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

本研究所用到的鼻咽癌細(xì)胞系CNE2、HNE2均為本課題組所在分子遺傳實(shí)驗(yàn)室凍存，培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco，MA，USA）和1%雙抗（青霉素、鏈霉素）（Life Technologies，NY，USA）的RPMI1640液體培養(yǎng)基（Life Technologies，NY，USA），在含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 circPVT1過表達(dá)質(zhì)粒，siRNA

為了獲得circPVT1 的過表達(dá)載體，通過PCR擴(kuò)增PVT1 基因2 號外顯子，并將其克隆到本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計改良的circRNA 空白載體pCirc 質(zhì)粒中。靶向敲低circPVT1 的siRNA 序列：5'-UCAGGCCUCAAGCCCAGCUGAGC-3'， 在 吉 瑪 公 司（Shanghai，China）合成。過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 3000 （Life Technologies， NY，USA）， siRNA 轉(zhuǎn)染使用Hiperfect （Qiagen，Hilden，Germany）。

1.3 RT-qPCR

對于circPVT1 及其下游mRNA 檢測，使用Vazyme（Vazyme，Nanjing，China）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)胞總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green（Biomake，Shanghai，China）進(jìn)行RT-qPCR 分析，GAPDH和β-actin作為內(nèi)參。對于miRNA檢測，使用miDETECTA TrackTMmiRNA RT-qPCR 試劑盒（RiboBio，Guangzhou，China） 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR，U6 用作檢測miRNA 表達(dá)的內(nèi)參。本研究中使用的引物由上海生工公司（Shanghai，China） 合 成 。 miRNA 引 物 由 RiboBio（Guangzhou，China）設(shè)計合成。

1.4 劃痕和Matrigel膠侵襲實(shí)驗(yàn)

劃痕實(shí)驗(yàn)用于檢測鼻咽癌細(xì)胞遷移能力：將鼻咽癌細(xì)胞接種在6孔板中，分別轉(zhuǎn)染circPVT1過表達(dá)載體或siRNA（及它們對應(yīng)的空白質(zhì)粒和無義對照RNA（scramble RNA）序列）后，待單層細(xì)胞生長至接近匯合時，使用10 μl 槍頭在6 孔板中劃痕；洗掉脫落細(xì)胞換上無血清1640 培養(yǎng)基后在顯微鏡下拍照，即為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后在顯微鏡下拍照，劃痕寬度使用Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計。為了檢測細(xì)胞侵襲能力，將Transwell 小室（8-mm pores；Millipore，NY，USA）放置在24 孔板中，然后向Transwell 小室中加入20 μl 10% Matrigel 膠（BD Biosciences，NJ，USA），放到37℃培箱中2 h 待Matrigel 凝固，然后將分別轉(zhuǎn)染circPVT1 過表達(dá)載體或siRNA（及它們對應(yīng)的空白質(zhì)粒和Scramble RNA 序列）后的鼻咽癌細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)，按每200 μl中20 000個鼻咽癌細(xì)胞加到Transwell 上層小室中，將含20% FBS 的培養(yǎng)基添加到小室底部的24 孔板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，之后將侵入小室底部的鼻咽癌細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，并用5%結(jié)晶紫染色后進(jìn)行拍照，用Image J軟件統(tǒng)計穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)目。

1.5 circRNA pull-down實(shí)驗(yàn)

為了找到與circPVT1結(jié)合的miRNAs，基于拼接位點(diǎn)設(shè)計了與circPVT1 反向互補(bǔ)的探針，探針序列為：5'-GCCAAAAGATCAGGCCTCAAGCCCAGCTGA-3'，探針5'和3'端均標(biāo)記生物素基團(tuán)，由上海生工公司（Shanghai，China）合成。先將生物素標(biāo)記的circPVT1 探針與鏈霉素親和磁珠在室溫孵育2 h。將鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行裂解和超聲處理后，將細(xì)胞裂解液加入到探針-磁珠混合液中，37°C 孵育過夜，隨后洗脫磁珠，使用Trizol提取RNA進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染后的鼻咽癌細(xì)胞于1.5 ml EP 管中，用預(yù)冷的PBS洗滌3遍，1 000 r/min離心5 min。加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，置于冰上裂解30 min。之后12 000 r/min，4℃離心20 min，轉(zhuǎn)移上清至新的EP管內(nèi)，使用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。在等量蛋白質(zhì)（40 μg）中加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液，煮沸10 min后置于冰上2 min使蛋白質(zhì)變性。變性后的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（5%濃縮膠，10%分離膠）分離后，電轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃條件下孵育一抗（1∶1 000）過夜，一抗分別為FSCN1 （14384-1-AP）、GAPDH （60004-1-Ig）購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。孵育一抗的PVDF 膜用TBST 緩沖液漂洗3 次，每次10 min，隨后與山羊抗兔或抗鼠IgG 二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。用TBST漂洗3次，每次10 min。最后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測miRNAs是否可以靶向FSCN1 的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）。當(dāng)鼻咽癌細(xì)胞長至對數(shù)期后，將其接種在24 孔板中，并將miR-24-3p 和let-7a-5p 的模擬物（mimics）或抑制劑（inhibitor） 以及相應(yīng)的對照序列（RiboBio，Guangzhou，China）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時共轉(zhuǎn)染熒光素酶報告質(zhì)粒（FSCN1-WT、FSCN1-Mutant） 和pRL-TK Renilla 內(nèi)參質(zhì)粒（Promega，WI， USA） 。 48 h 后 ， 使 用 Dual-Luciferase?Reporter Assay 試劑盒（Promega，WI，USA）進(jìn)行檢測。使用海腎熒光素酶（Renilla）活性作為內(nèi)參，評估不同組之間的相對熒光值變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，CA，USA）分析數(shù)據(jù)和作圖，通過Student’st檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)評估兩組或多組數(shù)據(jù)之間的顯著差異。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，P<0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circPVT1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移

具備侵襲和遷移能力是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提，為了探究circPVT1 對鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，本文構(gòu)建了circPVT1 的過表達(dá)載體，基于拼接位點(diǎn)設(shè)計并合成了敲低circPVT1 的siRNA（sicircPVT1），連同作為對照的空白質(zhì)粒（vector）和scramble RNA 序列（siCtrl）分別轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細(xì)胞中。通過RT-qPCR 檢測circPVT1 的過表達(dá)和敲低效果，結(jié)果表明，在鼻咽癌細(xì)胞CNE2 和HNE2 中成功過表達(dá)和敲低circPVT1，且對線性lncPVT1表達(dá)無顯著影響（圖1a，b）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)circPVT1 后鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，敲低circPVT1 鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力減弱（圖1c）。Transwell基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)circPVT1 細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，敲低circPVT1 鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力減弱（圖1d）。以上結(jié)果表明，circPVT1 可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

2.2 circPVT1通過競爭性結(jié)合miR-24-3p和let-7a-5p促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移

circRNA 通常作為miRNA 的“海綿”吸附miRNA 解除對下游靶基因的抑制作用發(fā)揮功能，為了探究circPVT1 是否通過吸附miRNA 促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移， 本文通過miRanda、RegRNA2.0 和RNA22 3 個生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能與circPVT1 結(jié)合的miRNAs，通過整合分析這3個生物信息軟件預(yù)測的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)4 個miRNAs（miR-24-3p、let-7a-5p、miR-1226-5p和miR-423-5p）最可能與circPVT1結(jié)合（圖2a）。隨后設(shè)計并合成與circPVT1 反向互補(bǔ)匹配帶生物素標(biāo)記探針，通過RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與circPVT1 結(jié)合的miRNAs。結(jié)果表明，RNA pull-down 獲得的RNA復(fù)合物中可以檢測到miR-24-3p 和let-7a-5p，而沒有檢測到miR-1226-5p 和miR-423-5p（圖2b），提示在鼻咽癌細(xì)胞中circPVT1 可能通過競爭性吸附miR-24-3p 和let-7a-5p 發(fā)揮生物學(xué)功能。為了明確circPVT1 與miR-24-3p/let-7a-5p 結(jié)合的序列，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-24-3p/let-7a-5p 結(jié)合circPVT1 的種子序列，并構(gòu)建包含circPVT1 種子序列的野生型和突變型的熒光素酶報告質(zhì)粒（圖2c），然后在鼻咽癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒和miR-24-3p/let-7a-5p mimics，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了miR-24-3p/let-7a-5 mimics 后野生型報告基因熒光素酶活性降低，而對突變型報告質(zhì)粒熒光素酶活性無影響（圖2d）。以上結(jié)果表明miR-24-3p 和let-7a-5p 可以與circPVT1 結(jié)合。為了進(jìn)一步證明circPVT1 通過miR-24-3p 和let-7a-5p 促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移，在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)circPVT1 同時轉(zhuǎn)染miR-24-3p 或let-7a-5p mimics，結(jié)果表明，circPVT1 表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲遷移，而同時在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-24-3p 或let-7a-5p可以逆轉(zhuǎn)circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移的影響（圖2e）。以上結(jié)果表明，circPVT1可以競爭性結(jié)合miR-24-3p 和let-7a-5p 增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移能力。

Fig. 1 circPVT1 promotes the invasion and migration of NPC cells

Fig. 2 circPVT1 promotes invasion and migration of NPC cells by competitively binding miR-24-3p and let-7a-5p

2.3 circPVT1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中FSCN1的表達(dá)

以上結(jié)果表明，circPVT1 通過吸附miR-24-3p和let-7a-5p促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但是具體通過調(diào)控哪個靶基因發(fā)揮作用還不清楚，為了尋找受circPVT1 調(diào)控且是miR-24-3p/let-7a-5p 共同靶向的mRNA，本文在鼻咽癌細(xì)胞HNE2 中敲低circPVT1后利用高分辨質(zhì)譜平臺進(jìn)行全蛋白質(zhì)組檢測，然后以肽段覆蓋面積（area）作為篩選指標(biāo)，通過對照組area與敲低組area比值獲得每個蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的比值，然后以area比值大于2作為篩選差異蛋白質(zhì)的閾值，在敲低circPVT1 前后鼻咽癌細(xì)胞中一共獲得了151 個差異表達(dá)蛋白質(zhì)。接下來，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetsan和miRNADB預(yù)測miR-24-3p/let-7a-5p共同靶向的mRNAs，以結(jié)合的最小自由能（minimum free energy，MEF）作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最小自由能的閾值設(shè)定為<-25 kcal/mol，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-24-3p 和let-7a-5p 共同靶向的mRNAs 有353 個。最后整合分析蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)以及miR-24-3p 和let-7a-5p 共同的潛在靶mRNA，發(fā)現(xiàn)FSCN1和MATR3在敲低circPVT1的鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且最有可能是miR-24-3p和let-7a-5p下游靶基因（圖3a）。在鼻咽癌細(xì)胞CNE2和HNE2中分別過表達(dá)或敲低circPVT1 后檢測FSCN1 和MATR3在RNA和蛋白質(zhì)水平變化，結(jié)果表明，與對照組相比，circPVT1過表達(dá)后FSCN1表達(dá)上調(diào)，circPVT1敲低后FSCN1表達(dá)下調(diào)，而MATR3表達(dá)變化不顯著（圖3b，c）。以上結(jié)果表明，circPVT1可能通過吸附miR-24-3p/let-7a-5p這兩個miRNA促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中FSCN1 的表達(dá)。FSCN1 屬于肌動蛋白，主要調(diào)控細(xì)胞骨架重塑，包括微管、微絲、中間絲的動態(tài)組裝及骨架相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)改變，以及和侵襲性偽足的形成促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動。通過對circPVT1 調(diào)控的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行DAVID 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞黏附和肌動蛋白調(diào)控的骨架重塑上（圖3d）。以上結(jié)果也提示，circPVT1 可能通過上調(diào)FSCN1 影響鼻咽癌細(xì)胞微管組裝，重塑細(xì)胞骨架，使鼻咽癌細(xì)胞更容易形變從而突破基底層完成侵襲和遷移。

2.4 circPVT1 通過miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1軸促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移

為了確證miR-24-3p 和let-7a-5p 直接靶向抑制FSCN1 的表達(dá)，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-24-3p和let-7a-5p在FSCN1 mRNA 3'-UTR上潛在的種子序列，并構(gòu)建包含F(xiàn)SCN1 3'-UTR 野生型和突變型的熒光素酶報告質(zhì)粒（圖4a），然后在鼻咽癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒和miR-24-3p/let-7a-5p mimics 或inhibitor，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了miR-24-3p/let-7a-5p mimics組報告基因熒光素酶活性降低，轉(zhuǎn)染miR-24-3p 和let-7a-5p inhibitor 組熒光酶活性升高，而突變結(jié)合序列的報告質(zhì)粒熒光素酶活性無影響（圖4b）。這些結(jié)果證實(shí)，miR-24-3p和let-7a-5p可以直接靶向抑制FSCN1 的表達(dá)。進(jìn)一步在鼻咽癌細(xì)胞過表達(dá)circPVT1 同時敲低FSCN1，結(jié)果表明敲低FSCN1 可以削弱circPVT1 對鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響（圖4c），基于上述結(jié)果，證實(shí)circPVT1通過miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1軸促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

Fig. 4 circPVT1 promotes invasion and migration of NPC cells through the miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1 axis

3 討論

circRNA近年來已成為生物醫(yī)學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)［22-24］，特別是它們在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用引起了廣泛關(guān)注。盡管已鑒定的circRNA多達(dá)數(shù)萬種，但大部分circRNA 的功能尚不清楚，circRNA在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的研究更少。目前關(guān)于circRNA 參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的報道有：Tang 等［25］發(fā)現(xiàn)circSETD3 作為競爭性內(nèi)源性RNA，通過與MAPRE1 競爭結(jié)合miR-615-5p 和miR-1538 促進(jìn)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移；Fan 等［26］發(fā)現(xiàn)circARHGAP12 通過直接結(jié)合EZR mRNA 的3'-UTR 促進(jìn)其穩(wěn)定性來促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；Mo 等［27］發(fā)現(xiàn)circRNF13 直接結(jié)合并穩(wěn)定SUMO2 mRNA來抑制鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移。

本文發(fā)現(xiàn)circPVT1 通過miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1 軸促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移。circPVT1 是一個來源于PVT1基因2 號外顯子的circRNA。PVT1基因主要編碼具有癌基因功能的lncRNA，lncPVT1 可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和放化療抵抗等，從而在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［28-30］。circPVT1 首次在胃癌中被發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)它能促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展［31］。隨著研究的深入，circPVT1 在多種惡性腫瘤中都發(fā)揮了重要作用，目前發(fā)現(xiàn)circPVT1 發(fā)揮功能的作用機(jī)制研究最多的是它作為miRNA分子“海綿”，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上增加miRNA 靶基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。如Chen等［31］發(fā)現(xiàn)circPVT1可以作為miR-125家族的“海綿”促進(jìn)胃癌的進(jìn)展；Wan 等［32］發(fā)現(xiàn)circPVT1 結(jié)合miR-423-5p 促進(jìn)骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移；Shi等［33］發(fā)現(xiàn)circPVT1通過吸附miR-30d和miR-30e促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展等。

目前廣泛證實(shí)circRNA 可作為miRNA 海綿，特異性的結(jié)合miRNA，從而通過ceRNA 的作用機(jī)制調(diào)控下游基因的表達(dá)。ceRNA 假說提出了一種RNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制，即mRNA、lncRNA 和circRNA 等通過競爭結(jié)合相同的miRNA 來影響靶基因mRNA 的穩(wěn)定性或翻譯活性，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)節(jié)［34］。miRNA是一類長度約為22 個核苷酸的非編碼RNA，主要通過與目標(biāo)基因的3'-UTR 進(jìn)行堿基配對，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在生物體內(nèi)大約有60%的基因受到miRNAs 的調(diào)控，miRNAs 的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［35-36］。同一個circRNA 在不同組織細(xì)胞中競爭性結(jié)合的miRNA不同，通過miRNA 調(diào)控的下游mRNA 不一樣，產(chǎn)生的效應(yīng)也可能不相同。如：circHIPK3 在不同腫瘤中就發(fā)揮不同的功能，在結(jié)直腸癌中circHIPK3過表達(dá)通過上調(diào)miR-7關(guān)鍵靶基因EGFR、IGF1R、FAK和YY1的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展［37］；在膽囊癌細(xì)胞中circHIPK3 通過吸附miR-124 促進(jìn)增殖的靶基因IL6R和DLX2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡［38］；在膀胱癌中circHIPK3 可以充當(dāng)miR-558海綿來抑制乙酰肝素酶的表達(dá)抑制膀胱癌的生長和轉(zhuǎn)移［39］。這些發(fā)現(xiàn)使RNA間的相互作用在不同組織細(xì)胞中形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

本研究探討了circPVT1 在鼻咽癌侵襲遷移中的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)circPVT1 可以競爭性吸附miR-24-3p 和let-7a-5p 這兩條miRNA 從而上調(diào)FSCN1 的表達(dá)，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲遷移，這進(jìn)一步完善了對circPVT1 生物學(xué)功能和機(jī)制的了解。let-7a是著名的發(fā)揮抑癌作用的miRNA，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，它通過靶向癌基因（包括MYC、KRAS和HMGA2）作為主要的腫瘤抑制因子抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［40］。miR-24-3p在多種腫瘤中根據(jù)靶基因的不同發(fā)揮不同的功能，研究發(fā)現(xiàn)miR-24-3p 可以抑制癌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［41］等。

FSCN1 是肌動蛋白結(jié)合蛋白家族中的一員，在腫瘤組織中高表達(dá)，而在生物體內(nèi)正常組織中表達(dá)較低。該蛋白質(zhì)作為一種特異性的肌動蛋白集束蛋白，可以將肌動蛋白絲捆綁聚合，參與細(xì)胞膜絲狀偽足的形成以及編碼細(xì)胞骨架蛋白通過促進(jìn)細(xì)胞的侵襲遷移參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［42］。研究表明，F(xiàn)SCN1 在多種腫瘤中高表達(dá)且促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，靶向FSCN1可以抑制腫瘤的進(jìn)展［43-45］。與這些研究一致，本文發(fā)現(xiàn)circPVT1 通過吸附miR-24-3p和let-7a-5p兩個miRNA，上調(diào)FSCN1的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲遷移，表明circPVT1可以通過調(diào)控細(xì)胞骨架重塑促進(jìn)鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，這為以circPVT1 及其下游FSCN1 為靶點(diǎn)抑制鼻咽癌細(xì)胞骨架重塑抑制轉(zhuǎn)移提供了一個新思路。

總之，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多階段變異累積的病理過程，mRNA、miRNA、circRNA 之間形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在鼻咽癌的進(jìn)展，包括侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用［46-50］。本文的研究結(jié)果揭示了circPVT1 通過miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1 軸促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移，為鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的發(fā)現(xiàn)。但circPVT1是否還參與了鼻咽癌的其他惡性生物學(xué)表型，它更多的臨床價值，包括在放化療抵抗和免疫治療耐受等方面的作用和機(jī)制，以及circPVT1 在鼻咽癌患者血清中的表達(dá)水平如何，是否可以作為鼻咽癌患者早期診斷的標(biāo)記等將是下一步研究的課題。

4 結(jié)論

綜上所述，本文探討了circPVT1 在鼻咽癌中的作用，發(fā)現(xiàn)circPVT1 可以吸附miR-24-3p 和let-7a-5p，上調(diào)FSCN1 的表達(dá)，通過miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1軸促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移，進(jìn)一步證實(shí)了circPVT1 是鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中一個重要驅(qū)動因子。這些發(fā)現(xiàn)豐富了鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為鼻咽癌的診療提供了新的線索。