高鑫，李博*，劉小杰*

（1.上海城建職業(yè)學(xué)院，上海 201415；2.上海教育教學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，上海 201415）

冷藏水產(chǎn)品的特定腐敗菌種（spoilage organism，SSOs）可以在低溫下對(duì)水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，并生成腐胺、尸胺和H2S 等異味物質(zhì)，形成生物膜導(dǎo)致水產(chǎn)品表面發(fā)黏等[1-2]，造成水產(chǎn)品在低溫運(yùn)輸與貯藏過程中的腐敗，從而影響感官。在冷藏水產(chǎn)品中，絕大部分微生物生長緩慢甚至停滯，但腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）能夠在低溫下長期存活并繁殖，形成特定腐敗菌種（SSOs）[3]。農(nóng)產(chǎn)品流通產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告顯示，2022 年我國海水產(chǎn)品流通損耗率高達(dá)10%。因此，深入探究S.putrefaciens 的冷適應(yīng)機(jī)制對(duì)于延長冷藏水產(chǎn)品貨架期具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)可從RNA 水平上闡述宿主或環(huán)境對(duì)原核生物影響而產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)答變化，細(xì)菌通過表達(dá)單組分感應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子或雙組分系統(tǒng)感受胞外信號(hào)，激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并使下游的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶在基礎(chǔ)水平上增強(qiáng)或減弱表達(dá)，增加代謝途徑中間體的產(chǎn)生，進(jìn)而進(jìn)入各個(gè)代謝途徑調(diào)控細(xì)胞物質(zhì)和能量的分配。例如，通過RNA-seq 分析發(fā)現(xiàn)，低溫導(dǎo)致柑橘黃龍病菌（Xanthomonas citripv.Citri，Xcc）的Ⅳ型菌毛狀突系統(tǒng)及發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因表達(dá)產(chǎn)生差異性變化，這是Xcc 對(duì)冷應(yīng)激的重要細(xì)胞適應(yīng)反應(yīng)[4]。目前已有很多研究表明，細(xì)胞壁組分合成基因[5]、細(xì)菌趨化性相關(guān)基因[6]和群體感應(yīng)相關(guān)基因[7]等的表達(dá)對(duì)S.putrefaciens 在低溫冷適應(yīng)方面具有重要的貢獻(xiàn)?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，能夠深層次挖掘大量數(shù)據(jù)，已經(jīng)成為闡述生物應(yīng)答機(jī)制的重要手段[8-11]。

本研究利用多組學(xué)聯(lián)合分析的手段，探究低溫下S.putrefaciens 在不同基因表達(dá)層面的適應(yīng)性變化，以期探索脂肪酸代謝和能量代謝通路對(duì)促進(jìn)腐敗希瓦氏菌冷適應(yīng)的作用及機(jī)理，并深入探討S.putrefaciens在低溫下的代謝改變和調(diào)控機(jī)理，為低溫水產(chǎn)品的儲(chǔ)運(yùn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

S.putrefaciens ATCC8071：上海海洋大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏；瓊脂粉、氯化鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：生工生物工程股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）、RNase/DNase free八連管：賽默飛世爾科技公司；羅氏熒光定量試劑盒：上海羅氏制藥有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司、DNA 酶活：德潤誠生物科技有限公司；熒光染料：上海翊圣生物技術(shù)有限公司；DNA marker DL2000/5000：寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷：北京德爾曼生物科技有限責(zé)任公司；溶菌酶（≥20 000 U/mg）：BBI 生命科學(xué)有限公司；Promega Eastep Super 總RNA 提取試劑盒：上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量基因擴(kuò)增儀（StepOnePlusTM）、超凈工作臺(tái)（YJ）：賽默飛世爾科技公司；冰箱（4、-20 ℃和-80 ℃）：海爾集團(tuán)公司；搖床（ZHTY-70）：上海知楚儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（GZP-450）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（MastercyclerRX50）：艾本德國際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 S.putrefaciens 的培養(yǎng)

將低溫凍存的S.putrefaciens 活化于無抗大豆胨瓊脂（tryptic soytone agar，TSA）培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)過夜，次日取單菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）液體培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，取500 μL 菌液再次接種于35 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至適當(dāng)OD600并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 S.putrefaciens 總RNA 的提取

培養(yǎng)過夜的S.putrefaciens 轉(zhuǎn)接到新鮮TSB 液體培養(yǎng)基中生長16 h 后，分別將細(xì)菌轉(zhuǎn)入4 ℃和30 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)48 h，并用總RNA 提取試劑盒提取總RNA，總RNA 保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerose chain reaction，RTqPCR）

參考檢測試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)，引物設(shè)計(jì)見表1。

對(duì)全部107個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)107個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本平均50 km行程中不同因素出現(xiàn)的頻數(shù)如表2所示：

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers of RT-qPCR

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析

過夜培養(yǎng)的菌液取500 μL 轉(zhuǎn)接入35 mL 新鮮的TSB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4，取1 mL菌液分別置于4 ℃（樣品編號(hào)記為E）和30 ℃（樣品編號(hào)記為A）下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取總RNA。進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（transcriptome sequencing，RNA-seq），分析方法采用DESeq2，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FoldChange|＞0（log2Fold-Change 是一種表達(dá)量變化比率，可以用來比較不同表達(dá)量水平的數(shù)據(jù)之間的相對(duì)變化）和padj＜0.05（padj為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性檢驗(yàn)指標(biāo)）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)使用Prism 8 軟件，分別采用t-test、Oneway ANOVA 和Two-way ANOVA 進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)p＜0.05 時(shí)，表明數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

1.5 多組學(xué)聯(lián)合分析

對(duì)處于低溫培養(yǎng)的S.putrefaciens 脂質(zhì)組學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了多組學(xué)相關(guān)性分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析及相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析，數(shù)據(jù)采用spearman 算法進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算，以相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值＞0.9 和p＜0.05 作為篩選顯著性相關(guān)的閾值標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)兩兩聯(lián)合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫條件影響S.putrefaciens 脂肪酸代謝和能量代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)

4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 表達(dá)基因的韋恩圖見圖1。

圖1 4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 表達(dá)基因的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of S.putrefaciens expression genes at 4 ℃and 30 ℃

由圖1 可知，S.putrefaciens 只在4 ℃和只在30 ℃表達(dá)的基因分別有39 個(gè)和36 個(gè)，而有3 602 個(gè)基因在兩種條件下均表達(dá)。進(jìn)一步比較4 ℃和30 ℃下的基因表達(dá)差異，結(jié)果顯示，4 ℃下生長的S.putrefaciens 相較于30 ℃共有2 142 個(gè)基因具有顯著性差異，其中上調(diào)和下調(diào)的基因分別有1 066 個(gè)和1 074 個(gè)。

RNA-seq 關(guān)鍵基因的RT-qPCR 驗(yàn)證見圖2。

圖2 RNA-seq 關(guān)鍵基因的RT-qPCR 驗(yàn)證Fig.2 Verification of RNA-seq by RT-qPCR

4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 脂肪酸代謝和能量代謝差異基因所在的KEGG 通路見表2。

表2 4 ℃和30 ℃下S.putrefaciens 脂肪酸代謝和能量代謝差異基因所在的KEGG 通路Table 2 The different genes of fatty acid metabolism and energy metabolism in S.putrefaciens at 4 ℃and 30 ℃strains according to KEGG pathway

由表2 可知，這些共同表達(dá)的差異基因在脂肪酸代謝及能量代謝相關(guān)通路富集較多，其中脂肪酸合成、代謝和降解的基因占富集基因總數(shù)的41.5%，三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）占16%，氧化磷酸化占23.6%，糖酵解/糖異生占18.9%，結(jié)果表明：與脂質(zhì)和能量代謝相關(guān)的通路在低溫下可能與S.putrefaciens 的冷適應(yīng)有密切聯(lián)系。

2.2 低溫影響S.putrefaciens 脂肪酸代謝基因的表達(dá)

S.putrefaciens 低溫下與脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)情況見表3。S.putrefaciens 低溫下與甘油酯代謝相關(guān)基因表達(dá)情況見表4。

表3 S.putrefaciens 低溫下與脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)情況Table 3 Expression of genes related to fatty acid metabolism of S.putrefaciens at low temperature

表4 S.putrefaciens 低溫下與甘油酯代謝相關(guān)基因表達(dá)情況Table 4 Expression of genes related to glyceride metabolism of S.putrefaciens at low temperature

由表3～表4 可知，通過分析RNA-seq 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與脂肪酸代謝相關(guān)的fadA、fadB、SPUTCN32_RS09215以及參與脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的外在膜蛋白基因SPUTCN32_RS02420 出現(xiàn)顯著性下調(diào)（表3）。參與細(xì)胞膜甘油酯代謝相關(guān)的基因出現(xiàn)顯著性上調(diào)（表4），表明在低溫會(huì)抑制S.putrefaciens 脂肪酸的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。此外，RNA-seq 結(jié)果顯示，S.putrefaciens 的多種控制3-ketoacyl-ACP synthases 的基因在低溫下出現(xiàn)顯著性上調(diào)，例如fabF、SPUTCN32_RS02215、SPUTCN32_RS08050、SPUTCN32_RS12145、SPUTCN32_RS -02200，激活了低溫下的脂肪酸合成途徑，增加細(xì)胞脂質(zhì)含量，可能防止了細(xì)胞在低溫下的損傷；除了多種3-ketoacyl-ACP synthases 基因顯著性上調(diào)，與鏈延長中還原反應(yīng)相關(guān)的trans-2-enoyl-CoA reductase 家族蛋白基因SPUTCN32_RS07620、負(fù)責(zé)合成長鏈不飽和脂肪酸的fabA 和負(fù)責(zé)將丙二酰CoA 轉(zhuǎn)移到?；d體蛋白ACP 上的fabD 基因同樣顯著性上調(diào)，這些結(jié)果均證明了低溫激活了S.putrefaciens 的脂肪酸合成。

2.3 多組學(xué)聯(lián)合分析低溫條件影響S.putrefaciens 脂肪酸代謝促進(jìn)其冷適應(yīng)的機(jī)制

為了深入分析參與S.putrefaciens 冷適應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)的變化，進(jìn)一步了解低溫下S.putrefaciens維持存活和生長的關(guān)鍵機(jī)制，基于前期掌握的低溫下S.putrefaciens 冷適應(yīng)相關(guān)蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)[12]，對(duì)蛋白組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，進(jìn)而挖掘差異蛋白和差異基因的相關(guān)性，篩選出S.putrefaciens 在低溫下顯著上調(diào)的蛋白并將其定位到KEGG 途徑上。通過整理聯(lián)合分析得到的S.putrefaciens 映射通路，發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 甘油酯代謝（spc00564）中CDP-二?；视?絲氨酸O-磷脂酰轉(zhuǎn)移酶出現(xiàn)顯著性上調(diào)，CDP-二?；视?絲氨酸O-磷脂酰轉(zhuǎn)移酶能夠參與細(xì)胞膜中磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PE）的生成，首先該酶催化由CDP-二?；视秃蚅-絲氨酸產(chǎn)生的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），隨后PS經(jīng)磷脂酰絲氨酸脫羧酶催化脫羧形成PE，PE 含量的增加有利于維持細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)細(xì)胞在低溫下進(jìn)行有效的物質(zhì)交換。此外，基于試驗(yàn)前期掌握的低溫下S.putrefaciens 冷適應(yīng)相關(guān)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)[13]，進(jìn)一步對(duì)脂質(zhì)組學(xué)與蛋白組學(xué)聯(lián)合分析差異脂質(zhì)和差異蛋白的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 脂肪酸代謝途徑（spc01212）中乙酰輔酶A 脫氫酶結(jié)構(gòu)域蛋白出現(xiàn)顯著性上調(diào)。酯?；o酶A 脫氫酶作為脂肪酸β 氧化過程中第一個(gè)限速酶參與長鏈脂肪酸的脫氫步驟，產(chǎn)物再經(jīng)加水、脫氫和硫解步驟，每循環(huán)一次產(chǎn)生一分子的乙酰輔酶A，對(duì)于β 氧化至關(guān)重要。除了參與β 氧化外，酯?；o酶A 脫氫酶能夠增加細(xì)菌體內(nèi)不飽和脂肪酸的含量，而不飽和脂肪酸增加降低了磷脂雙分子層的堆積密度，導(dǎo)致液相至凝膠相變溫度的降低，對(duì)于低溫下維持細(xì)胞膜流動(dòng)性、保證細(xì)胞正常的生理功能具有重要的生理意義。

2.4 低溫影響S.putrefaciens 能量代謝基因的表達(dá)

S.putrefaciens 低溫下與糖酵解和糖異生相關(guān)基因表達(dá)情況見表5。

表5 S.putrefaciens 低溫下與糖酵解和糖異生相關(guān)基因表達(dá)情況Table 5 Expression of genes related to glycolysis and gluconeogenesis of S.putrefaciens at low temperature

續(xù)表5 S.putrefaciens 低溫下與糖酵解和糖異生相關(guān)基因表達(dá)情況Continue table 5 Expression of genes related to glycolysis and gluconeogenesis of S.putrefaciens at low temperature

糖酵解和糖異生是影響細(xì)菌持續(xù)供能和抵抗外部不良環(huán)境的關(guān)鍵因素。由表5 可知，在4 ℃下，S.putrefaciens 與糖酵解相關(guān)的乙醇脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸激酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶等基因表達(dá)上調(diào)，表明在低溫條件下S.putrefaciens 的糖酵解過程增強(qiáng)，為細(xì)胞抵抗低溫環(huán)境和維持正常的生理代謝提供更多的能量，同時(shí)為其它代謝提供三磷酸腺苷和中間產(chǎn)物。此外，S.putrefaciens 與糖異生相關(guān)的基因也有個(gè)別上調(diào)，如磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶等產(chǎn)物的基因表達(dá)（表5），該酶能夠在細(xì)胞高糖水平下啟動(dòng)磷酸烯醇丙酮酸的羧化過程并將其氧化到羧酸，提供細(xì)胞有利的熱能量，維持細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

S.putrefaciens 低溫下與三羧酸循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)情況見表6。S.putrefaciens 低溫下與氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)情況見表7。

表6 S.putrefaciens 低溫下與三羧酸循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)情況Table 6 Gene expression of S.putrefaciens related to the TCA cycle at low temperature

表7 S.putrefaciens 低溫下與氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)情況Table 7 Expression of genes related to oxidative phosphorylation of S.putrefaciens at low temperature

通過分析RNA-seq 結(jié)果，在4 ℃下S.putrefaciens與三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化相關(guān)的諸多基因出現(xiàn)顯著性上調(diào)，例如琥珀酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸還原酶、檸檬酸合酶、細(xì)胞色素c1、黃酮類化合物c、泛醌氧化酶亞基II、細(xì)胞色素c、b 氧化酶亞基、細(xì)胞色素o 泛醌氧化酶亞基I 等產(chǎn)物的基因表達(dá)（表6、表7），這些基因表達(dá)的上調(diào)均有利于S.putrefaciens 能量的產(chǎn)生和中間產(chǎn)物的積累，可能用于S.putrefaciens 在冷適應(yīng)狀態(tài)下物質(zhì)的生物合成和能量獲取。

2.5 多組學(xué)聯(lián)合分析低溫條件影響S.putrefaciens 能量代謝促進(jìn)其冷適應(yīng)的機(jī)制

為了深入分析冷適應(yīng)與能量代謝之間的關(guān)聯(lián)，從而了解低溫下S.putrefaciens 繁殖和水產(chǎn)品腐敗關(guān)鍵機(jī)制，研究對(duì)脂質(zhì)組學(xué)與蛋白組學(xué)進(jìn)行了聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)與S.putrefaciens 氧化磷酸化（spc00190）相關(guān)的還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶、琥珀酸脫氫酶亞基B、細(xì)胞色素c1、琥珀酸脫氫酶亞基C、琥珀酸脫氫酶亞基D、泛醌-細(xì)胞色素c還原酶/鐵硫亞單位、細(xì)胞色素b/b6/N 末端結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞色素杜比奎醇氧化酶亞基II 在低溫下出現(xiàn)顯著性上調(diào)。此外，還發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 的三羧酸循環(huán)（spc00020）中琥珀酸脫氫酶亞基B 和O-氧戊二酸脫氫酶成分2 出現(xiàn)顯著性上調(diào)。

NADH 脫氫酶作為電子傳遞鏈的第一個(gè)質(zhì)子泵，其上調(diào)表達(dá)能夠在增強(qiáng)S.putrefaciens 在低溫下的呼吸鏈，使細(xì)胞在低溫等不利因素下仍然能持續(xù)供能，這可能是S.putrefaciens 在低溫下大量繁殖的重要原因。除了NADH 脫氫酶，琥珀酸脫氫酶在低溫下的上調(diào)對(duì)于S.putrefaciens 的三羧酸循環(huán)供能也起著重要作用。細(xì)胞色素c 氧化酶、細(xì)胞色素還原酶以及細(xì)胞色素c1、細(xì)胞色素b 作為電子傳遞鏈末端的酶和中間電子載體，具有質(zhì)子泵和電子傳遞的功能，其上調(diào)對(duì)于S.putrefaciens 氧化磷酸化和電子傳遞鏈具有增強(qiáng)作用，促使細(xì)胞處于低溫環(huán)境的同時(shí)能夠保證其進(jìn)行營養(yǎng)的獲取、代謝酶促反應(yīng)、生物合成及繁殖，增強(qiáng)抗逆性。2-氧戊二酸脫氫酶E2 是二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的組分，二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶是α-酮戊二酸脫氫酶系之一，構(gòu)成α 酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的核心酶，同時(shí)也負(fù)責(zé)腺苷三磷酸的產(chǎn)生，對(duì)于能量的產(chǎn)生具有重要作用。該酶的上調(diào)促進(jìn)了琥珀酰CoA 的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)三羧酸循環(huán)和腺苷三磷酸的產(chǎn)生。

3 討論

S.putrefaciens 在低溫中具有很強(qiáng)的可持續(xù)存活、增殖和致腐能力，對(duì)全球水產(chǎn)品的物流和銷售造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。為克服寒冷環(huán)境對(duì)微生物存活的多重脅迫，微生物演化出了多種復(fù)雜的協(xié)作適應(yīng)能力，從細(xì)胞膜和酶的適應(yīng)到低溫保護(hù)劑及其伴侶的產(chǎn)生，甚至進(jìn)化出新的代謝能力[14-17]。利用多組學(xué)聯(lián)合分析微生物對(duì)于環(huán)境適應(yīng)的基因應(yīng)答變化是有效的研究手段，將基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等組學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析已成為人們探索生物應(yīng)答機(jī)制的一種有效方法。本文為探究S.putrefaciens 在低溫下的存活和增殖機(jī)制，對(duì)4 ℃和30 ℃條件下的S.putrefaciens RNA-seq 結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)S.putrefaciens 在低溫下參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、脂肪酸生物合成和降解、糖酵解和糖異生、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、碳代謝等相關(guān)基因的表達(dá)，這與Liao 等[4]在探究低溫對(duì)微生物的冷刺激有相似的結(jié)果，同時(shí)，RT-qPCR 的驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq 的數(shù)據(jù)具有一致性。

脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成部分，根據(jù)脂肪酸的含量來決定脂肪酸的降解和合成，對(duì)于維持膜脂穩(wěn)態(tài)具有重要作用。楊勝平等[18]對(duì)不同培養(yǎng)溫度下S.putrefaciens DSM6067 差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)溫度越低，S.putrefaciens 細(xì)胞膜脂肪酸代謝相關(guān)酶的表達(dá)量越高。在細(xì)菌中，大多數(shù)脂肪酸都可以酯化成脂質(zhì)，如磷脂（phospholipid，PL）和糖脂（glycolipid，GL）等[19]，而且在低溫脅迫下，脂質(zhì)構(gòu)成變化對(duì)細(xì)菌生存的重要性也是普遍性認(rèn)同的[20-21]。通過對(duì)S.putrefaciens 脂肪酸代謝基因的研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件可以調(diào)控脂肪酸代謝產(chǎn)物和代謝酶的表達(dá)，例如，與脂肪酸代謝相關(guān)的fabF 和fabD 可以促進(jìn)?；D(zhuǎn)移到?；d體蛋白上。質(zhì)膜長鏈不飽和脂肪酸的減少會(huì)影響細(xì)胞膜流動(dòng)性、通透性和物質(zhì)交換速率[22]，因此與長鏈脂肪酸拮抗的脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因fadR 出現(xiàn)顯著性上調(diào)，其拮抗機(jī)制是由于環(huán)境中存在14 個(gè)碳以上的長鏈脂肪酸，它們被降解成?；o酶A 并結(jié)合到fadR上，導(dǎo)致fadR 從fad 基因簇上釋放并解除對(duì)fad 基因簇的轉(zhuǎn)錄抑制，促進(jìn)長鏈脂肪酸降解[23]，維持質(zhì)膜流動(dòng)性等功能。

與S.putrefaciens 在低溫下保持其穩(wěn)定存活和繁殖相關(guān)的重要因素是脂肪酸合成相關(guān)的諸多基因出現(xiàn)上調(diào)，這與脂肪酸降解相關(guān)基因的下調(diào)相反。在脂肪酸生物合成中，乙酰CoA 通過碳碳縮合、還原、脫水和還原的循環(huán)反應(yīng)來產(chǎn)生長鏈脂肪酸，細(xì)菌的這些反應(yīng)是通過II 型合成酶催化，反應(yīng)的中間體以小的酰基載體帶白的硫酯形式存在于胞內(nèi)，而鏈的延長是通過多種3-酮脂酰-ACP 合成酶將?；鵆oA 或酰基-ACP與丙二酰-ACP 縮合形成。脂肪酸合成相關(guān)基因上調(diào)說明細(xì)胞膜中脂質(zhì)組成變化對(duì)于細(xì)菌在低溫脅迫下存活具有重要作用，聯(lián)合脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果可表明S.putrefaciens 脂質(zhì)代謝的變化可以更好地適應(yīng)低溫的環(huán)境。

除了脂質(zhì)代謝，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)、蛋白組學(xué)的聯(lián)合分析結(jié)果表明，與糖酵解/糖異生相關(guān)的乙醇脫氫酶adhE 和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶SPUTCN32_RS18530、與三羧酸循環(huán)/氧化磷酸化相關(guān)的琥珀酸脫氫酶SPUTCN32_RS01815 和細(xì)胞色素c SPUTCN32_RS17000 等能量代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)對(duì)于細(xì)胞在低溫下保持正常代謝、從環(huán)境中獲取能源物質(zhì)以及維持正常增殖有著不可或缺的功能。葡萄糖作為微生物主要的碳源物質(zhì)能夠被優(yōu)先利用，當(dāng)胞外葡萄糖被攝取進(jìn)入胞內(nèi)后，首先通過糖酵解途徑形成6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸等產(chǎn)物，中間過程產(chǎn)生大量的腺苷三磷酸和NADH 等能源物質(zhì)，產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和CO2，隨后乙醛在ADH I 和NADH 的作用下轉(zhuǎn)化為乙醇和NAD+，經(jīng)糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA 后進(jìn)入三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化進(jìn)一步被氧化為細(xì)胞供能。糖異生涉及葡萄糖-6-磷酸酶、丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶等關(guān)鍵酶的催化，促進(jìn)菌體降解乳酸、協(xié)調(diào)氨基酸代謝、維持菌體正常代謝[24-25]。因此，這些與能量代謝相關(guān)的基因差異性表達(dá)對(duì)于S.putrefaciens 在低溫下能量的產(chǎn)生和繁殖具有不可忽視的作用。

4 結(jié)論

本文深入探究了S.putrefaciens 在低溫下脂肪酸代謝和能量代謝通路關(guān)鍵基因的差異性變化，確定了S.putrefaciens 在低溫下代謝水平的改變，4 ℃和30 ℃培養(yǎng)的S.putrefaciens 脂肪酸生物合成和代謝、三羧酸循環(huán)、能量代謝等相關(guān)的部分基因出現(xiàn)顯著性差異，在4 ℃下與脂肪酸降解的相關(guān)基因出現(xiàn)下調(diào)，而與脂肪酸合成的相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)，這能夠促使S.putrefaciens 在低溫下維持一定的細(xì)胞膜脂質(zhì)成分，進(jìn)而維持其流動(dòng)性和物質(zhì)交換；在4 ℃下S.putrefaciens 能量代謝過程的關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)，這能夠?yàn)榫w抵抗低溫環(huán)境和維持正常的生理代謝提供更多的能量，對(duì)于S.putrefaciens 維持低溫下的生理狀態(tài)和能量代謝具有重要作用。本文為研究S.putrefaciens 冷適應(yīng)機(jī)制和靶向抑制低溫S.putrefaciens 的繁殖提供了新的思路和靶點(diǎn)。