董蕾，黃利華，江津津，鄭玉璽

（廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院，廣東 廣州 510650）

食源性致病菌是導(dǎo)致食品安全事件頻發(fā)的主要原因之一。在世界范圍內(nèi)，每年感染沙門氏菌（Salmonella spp.）導(dǎo)致死亡或患病而造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超30 億美元[1-2]。沙門氏菌常見的主要有鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌等，是引起全球細(xì)菌性食物中毒的主要食源性致病菌之一，其中腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）由于不分解蛋白質(zhì)，食品基本不會(huì)發(fā)生感官變化，十分容易被忽略[3]。

傳統(tǒng)食源性致病菌檢測(cè)方法包括平板分離法[4]、分子生物學(xué)方法[5-7]、免疫學(xué)方法[8]等。平板分離法作為食品安全檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，需要依靠增菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等，其檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度不高；同時(shí)檢測(cè)過程中可能出現(xiàn)非目標(biāo)菌干擾、污染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移等問題，影響檢測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題[9]；分子生物學(xué)方法要求技術(shù)條件高、檢測(cè)過程中一旦出現(xiàn)環(huán)境污染，則極易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，影響檢測(cè)結(jié)果；免疫學(xué)方法前期抗體制備周期長(zhǎng)、研發(fā)成本高、抗體穩(wěn)定性較差，且易受檢測(cè)環(huán)境影響，很難滿足食品安全快速檢測(cè)中對(duì)食源性致病菌快速、靈敏、特異的檢測(cè)需求[10]。

適配體是一類能夠與蛋白結(jié)合、產(chǎn)生高特異性和親和度的單鏈核酸序列[11]，其通常僅含有15～40 個(gè)堿基，分子量為5～25 kDa。其片段短、性質(zhì)穩(wěn)定，因此環(huán)境適應(yīng)性好、易保存、不易降解；同時(shí)由于適配體為單鏈寡核苷酸DNA 或RNA，可形成各種所需的空間構(gòu)象（如發(fā)卡結(jié)構(gòu)、G-四聚體等），與食源性致病菌的標(biāo)志性蛋白或致病毒素的特異性結(jié)構(gòu)高特異性結(jié)合，而不與其他類似結(jié)構(gòu)物產(chǎn)生交叉反應(yīng)[12-13]，從而實(shí)現(xiàn)高特異性識(shí)別和高親和性結(jié)合靶物質(zhì)。且靶物質(zhì)可為生物分子、化學(xué)分子及細(xì)胞等多種物質(zhì)，探針也具有分子量小、無免疫原性、修飾簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[14-16]，因此被廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域[17]。近年來，研究者利用核酸適配體進(jìn)行沙門氏菌檢驗(yàn)，如Duan 等[18]篩選鼠傷寒沙門氏菌核酸適配體，將其結(jié)合熒光技術(shù)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，其檢出限可達(dá)25 CFU/mL；Xu等[19]結(jié)合金納米顆粒變色效應(yīng)檢測(cè)沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7，當(dāng)有靶標(biāo)出現(xiàn)時(shí)，金納米顆粒由紅色變?yōu)樗{(lán)或紫色，其檢出限為105CFU/mL；Yuan 等[20]利用納米金適配體進(jìn)行鼠傷寒沙門氏菌檢測(cè)時(shí)，檢出限可達(dá)7 CFU/mL，實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的可視化檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致。

納米金（nano-gold，AuNPs）是金的微小顆粒，其具有優(yōu)異的催化活性和獨(dú)特的光學(xué)特性，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性。中等粒徑（10～20 nm）大小的納米金在分散態(tài)下呈紅色，高鹽情況下凝聚成藍(lán)色，而在含有單鏈DNA（ssDNA）條件下，ssDNA 的正電荷堿基自由狀態(tài)暴露，通過靜電吸附在納米金上，使納米金在高鹽溶液中仍保持穩(wěn)定性，納米金溶液仍為紅色[21-22]。通過納米金進(jìn)行檢驗(yàn)，產(chǎn)生的變色比色反應(yīng)，其靈敏度可達(dá)熒光檢測(cè)法的靈敏程度[23-24]。納米金在存在特異性靶標(biāo)的情況下，適配體形成特定三維結(jié)構(gòu)，與靶標(biāo)特異性結(jié)合；而未吸附適配體的納米金則在高鹽溶液中發(fā)生聚集，最終使溶液呈深藍(lán)色。

本文通過配制納米金溶液，結(jié)合已開發(fā)的腸炎沙門氏菌核酸適配體，通過優(yōu)化腸炎沙門氏菌適配體濃度，研究納米金-適配體體系的腸炎沙門氏菌檢測(cè)限、特異性及適用溫度；同時(shí)以人工污染樣品為例，評(píng)價(jià)納米金-適配體的加標(biāo)回收率，從而構(gòu)建一種操作成本低、特異性強(qiáng)的腸炎沙門氏菌檢測(cè)方法。同時(shí)，通過更換其他致病菌特異性的適配體，又可進(jìn)行其他致病菌的快捷檢測(cè)，具有良好推廣效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料及藥品

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538、腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）50335，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。

冷鮮雞肉：市售，散裝稱重，于4 ℃保存。

木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂（xylose-lysinesodium tetrahydrosulfate agar，XLT4）、腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、M9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M9 minimal medium）、LB 培養(yǎng)基（Luria-Bertani）：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）（分析純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；聚乙二醇20000（polyethylene glycol，PEG）、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、NaCl、KH2PO4、KCl、MgCl2、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸三鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化股份有限公司；腸炎沙門氏菌核酸適配體序列參考Joshi 等[25]，序列：5'-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3'；引物1和引物2 分別為5'-GGT GAC GCC ATA-3'和5'-CTG TCA TAA TGT C-3'由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2ws 加熱型磁力攪拌器：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；UV1810S 型紫外分光光度計(jì)：青島聚創(chuàng)環(huán)保有限公司；LDZX-40AI 立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DH5000AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納米金溶液制備

錐形瓶中加入95.8 mL 超純水和4.2 mL 氯金酸溶液，磁力加熱攪拌器混勻后，加入10 mL 檸檬酸三鈉溶液和5 mL PVP，持續(xù)攪拌加熱至溶液變紅，靜置冷卻至室溫。

1.3.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

1.3.2.1 菌種活化及菌懸液制備

3 種試驗(yàn)菌株接種于腦心浸液肉湯并涂布LB 平板劃線，挑取單菌落于10 mL 營養(yǎng)肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)（150 r/min）至達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。4 ℃、2 850 r/min離心20 min，利用預(yù)冷的PBS 緩沖液（pH7.5）清洗2次，無菌水重懸，調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL，此時(shí)OD550nm為6.30。

1.3.2.2 適配體濃度篩選

在96 孔板中加入1×109CFU/mL 的菌液50 μL，再分別加入等體積濃度為0、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1 000 nmol/L 的適配體，混勻孵育5 min。加入納米金溶液50 μL，平衡5 min，加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液，平衡5 min 后比色拍照，篩選最佳適配體濃度。

1.3.2.3 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌檢測(cè)限測(cè)試

梯度稀釋菌懸液，使菌懸液濃度分別為101～109CFU/mL。96 孔板中分別加入1.3.2.2 中篩選出的最佳適配體濃度的適配體50 μL，再依次加入101～109CFU/mL 菌懸液50 μL，混勻孵育5 min，加入50 μL納米金溶液，平衡5 min，加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液，平衡5 min 后比色拍照，確定腸炎沙門氏菌的檢測(cè)限。

1.3.2.4 適配體-納米金溶液特異性檢測(cè)

分別加入3 種試驗(yàn)菌株1×109CFU/mL 菌懸液50 μL，加入最佳適配體濃度適配體50 μL，混勻孵育5 min，加入納米金溶液50 μL，平衡5 min，加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液，平衡5 min 后比色拍照，檢測(cè)腸炎沙門氏菌適配體-納米金溶液的特異性。

1.3.2.5 適配體-納米金溶液的適用溫度測(cè)定

96 孔板中加入50 μL 1×109CFU/mL 的菌液、最佳適配體濃度適配體50 μL，混勻孵育5 min 后，加入納米金溶液50 μL，平衡5 min。加入10 μL 5 mol/L NaCl溶液后，置于15、25、35 ℃的水浴中，測(cè)定該體系的適用溫度。

1.3.3 人工污染樣品檢測(cè)

冷鮮雞肉切塊，生理鹽水沖洗，超凈臺(tái)紫外照射30 min，經(jīng)GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》[26]方法檢測(cè)，無腸炎沙門氏菌檢出。稱取50 g 雞肉塊為1 份，分別浸入102～109CFU/mL 的菌液中，放置1 h。取出后，利用生理鹽水充分浸泡振蕩30 min。沖洗溶液取50 μL 進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，另取50 μL 進(jìn)行納米金-適配體檢驗(yàn)，以開始出現(xiàn)顏色變化所對(duì)應(yīng)的平板計(jì)數(shù)濃度為納米金-適配體的加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析，顯著性分析為ANOVA（One-way analysis of variance，the Duncan test），多重比較采用LSD 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適配體-納米金溶液檢測(cè)腸炎沙門氏菌

基于納米金溶液在高鹽環(huán)境下所產(chǎn)生的凝聚顏色變化原理[21，27-28]，適配體-納米金法檢測(cè)腸炎沙門氏菌的顏色變化如圖1 所示。若溶液中僅存在納米金，則在高鹽溶液環(huán)境下，會(huì)發(fā)生凝聚現(xiàn)象，使溶液變?yōu)樗{(lán)色；而當(dāng)溶液中存在納米金和適配體時(shí)，由于納米金表面吸附了適配體，不會(huì)在高鹽環(huán)境中發(fā)生凝聚，因此溶液仍為紅色；當(dāng)溶液中存在靶標(biāo)菌（腸炎沙門氏菌）時(shí)，適配體與靶標(biāo)細(xì)菌特異性結(jié)合，而未結(jié)合適配體的納米金即在高鹽環(huán)境下發(fā)生聚集，使溶液呈現(xiàn)深藍(lán)色。

圖1 適配體-納米金腸炎沙門氏菌檢測(cè)體系Fig.1 Aptamer nano gold detection system for Salmonella enteritidis

由圖1 及納米金溶液在高鹽環(huán)境下的凝聚顏色變化原理可知，管1 中包含靶標(biāo)細(xì)菌（腸炎沙門氏菌）、適配體和納米金，靶標(biāo)菌與適配體結(jié)合呈現(xiàn)的藍(lán)色與未結(jié)合適配體的納米金在高鹽環(huán)境下發(fā)生凝集，使藍(lán)色加深，呈現(xiàn)深藍(lán)色；管2 中只有靶標(biāo)菌及適配體，兩者結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色；管3 中僅有適配體和納米金，納米金在高鹽環(huán)境下呈現(xiàn)紅色。結(jié)果表明，當(dāng)測(cè)試溶液中包含靶標(biāo)菌時(shí)，該體系應(yīng)呈現(xiàn)深藍(lán)色。

2.2 最佳適配體濃度篩選

最佳適配體濃度篩選結(jié)果如圖2 所示。

圖2 最佳適配體濃度篩選Fig.2 Optimal aptamer concentration screening

由圖2 可知，當(dāng)腸炎沙門氏菌濃度為109CFU/mL時(shí)，分別測(cè)試添加0、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1 000 nmol/L 的適配體50 μL，隨著適配體濃度不斷升高，混合溶液的顏色逐漸加深，在200 nmol/L 時(shí)顏色最深（管7），其后增加適配體濃度，適配體數(shù)量多于菌數(shù)，多余的適配體與納米金結(jié)合，在高鹽溶液下呈紅色，至1 000 nmol/L 時(shí)適配體數(shù)量遠(yuǎn)多于菌數(shù)，溶液呈現(xiàn)紅色。因此選擇適配體200 nmol/L 為最佳適配體添加濃度。

2.3 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的檢測(cè)限

通過在523 nm 處吸光度與腸炎沙門氏菌濃度的線性分析結(jié)果見圖3。

圖3 腸炎沙門氏菌濃度與吸光度的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between Salmonella enteritidis concentration and absorbance value

由圖3 可知，在103～107CFU/mL 菌液濃度下，兩者有較好的線性關(guān)系，線性方程：y=0.187 8x-0.146（R2=0.991 3），檢測(cè)限為9.3×101CFU/mL。

3f 1H NMR(CDCl3) δ:7.91-7.79(m,2 H),7.77-7.75(m,1 H),7.56-7.53(m,1 H),7.37-7.33(m,2 H),7.27-7.16(m,1 H),2.43(s,6 H).

在體系中分別添加101～109CFU/mL 的腸炎沙門氏菌，其顏色變化在圖4 中顯示。

圖4 適配體-納米金溶液在腸炎沙門氏菌濃度不同時(shí)的顏色變化Fig.4 Color changes of aptamer nano gold solution at different concentrations of Salmonella enteritidis

由圖4 可知，當(dāng)沒有腸炎沙門氏菌存在時(shí)，混合溶液為紅色；當(dāng)溶液中有靶標(biāo)菌存在時(shí)，適配體與靶標(biāo)菌結(jié)合，部分納米金被未與靶標(biāo)菌結(jié)合的適配體保護(hù)，保持紅色，而未與適配體結(jié)合的納米金顆粒在鹽溶液環(huán)境下呈現(xiàn)藍(lán)色，最終使溶液呈現(xiàn)紫紅色；隨著靶標(biāo)菌數(shù)不斷增加，適配體完全與靶標(biāo)菌結(jié)合，納米金顆粒暴露在鹽溶液環(huán)境下凝集，最終使混合溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。

2.4 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的特異性

利用適配體-納米金溶液檢測(cè)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及腸炎沙門氏菌，檢測(cè)反應(yīng)體系的特異性，試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。

圖5 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的特異性Fig.5 Specificity of aptamer nano gold solution for Salmonella enteritidis

由圖5 可知，腸炎沙門氏菌混合溶液出現(xiàn)顏色變化，其他兩種菌的混合溶液則依然為紅色。當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶標(biāo)菌時(shí)，由于適配體與靶標(biāo)菌結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色，納米金溶液在高鹽環(huán)境下呈現(xiàn)紅色，最終呈現(xiàn)出深藍(lán)色（管3）；而其他細(xì)菌與適配體無法特異性結(jié)合，納米金與適配體結(jié)合，從而在高鹽溶液下保護(hù)納米金顆粒，使混合溶液依舊為紅色（管1、管2）。

2.5 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的適用溫度

適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌體系在不同溫度下的反應(yīng)見圖6。

圖6 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌體系在不同溫度下的反應(yīng)Fig.6 Reaction of aptamer nano gold solution Salmonlla enteritidis system at different temperatures

如圖6 所示，在相同的添加量下，改變反應(yīng)體系的環(huán)境溫度，結(jié)果無明顯差異。表明該反應(yīng)體系在日常室溫條件下（15～35 ℃）可以使用，環(huán)境溫度變化對(duì)該反應(yīng)體系的檢測(cè)效果無明顯影響。

2.6 人工污染樣品檢測(cè)結(jié)果分析

表1 適配體-納米金溶液檢測(cè)腸炎沙門氏菌與平板計(jì)數(shù)法的對(duì)比Table 1 Comparison of Salmonella enteritis detection with plate counting method

由表1 可知，基于核酸適配體的納米金比色法檢測(cè)腸炎沙門氏菌的方法加標(biāo)回收率為93.68%～117.89%。與平板計(jì)數(shù)方法檢測(cè)腸炎沙門氏菌的結(jié)果沒有明顯差異，表明適配體-納米金溶液可以靈敏地檢測(cè)出食品中的腸炎沙門氏菌污染。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于核酸適配體的納米金比色法檢測(cè)腸炎沙門氏菌，本方法可以特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌，對(duì)其他食源性致病菌無特異反應(yīng)。通過條件優(yōu)化，在適配體濃度200 nmol/L 下，腸炎沙門氏菌的最低檢測(cè)限為9.3×101CFU/mL，其線性范圍為103～107CFU/mL，線性方程為y=0.187 8x-0.146（R2=0.991 3）。檢測(cè)人工污染樣品的加標(biāo)回收率為93.68%～117.89%。

本研究建立的快捷、可視的進(jìn)行腸炎沙門氏菌檢測(cè)的方法，利用納米金為顯色信號(hào)，無需連接信號(hào)轉(zhuǎn)換器，操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)分析檢測(cè)；對(duì)比平板計(jì)數(shù)方法，其結(jié)果無明顯差異，該方法可以特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中腸炎沙門氏菌污染情況，且無需進(jìn)行樣品采集、處理、培養(yǎng)等過程，操作時(shí)間大大縮短，技術(shù)要求降低，提升檢測(cè)效率；同時(shí)該方法通過選擇特異性識(shí)別菌種的核酸適配體，配合納米金在高鹽環(huán)境下的顏色變化，實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。此外，篩選識(shí)別不同食源性致病菌的適配體時(shí)，僅需調(diào)整改變檢測(cè)體系內(nèi)適配體，其他成分無需改變（成分濃度根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)菌特性調(diào)整），即可實(shí)現(xiàn)不同致病微生物的檢測(cè)，具有良好的通用性。