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        高靈敏度指示膜對魚肉新鮮度的監(jiān)測及其機(jī)理分析

        2023-08-12 00:41:38胡慧玲熊治渝高瑞昌
        食品科學(xué) 2023年13期
        關(guān)鍵詞:新鮮度明膠魚肉

        石 彤,胡慧玲,熊治渝,王 林,袁 麗,高瑞昌

        (江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

        魚肉富含蛋白質(zhì),容易被微生物污染而引發(fā)食品安全問題,為了提高食品安全性并獲悉所購買的冷鮮肉(如魚肉)等新鮮程度,研究人員開發(fā)出多種冷鮮肉新鮮度監(jiān)測的方法。相對于耗時(shí)且操作繁瑣的傳統(tǒng)檢測方法和需要借助專業(yè)儀器且數(shù)據(jù)處理復(fù)雜的快速無損檢測方法,比色型pH指示膜(智能包裝的一種)無需破壞包裝,只需利用指示劑隨食物及其微環(huán)境pH值的變化而改變顏色的特點(diǎn),就可以讓消費(fèi)者迅速區(qū)分新鮮和變質(zhì)的食物,對于減少食物浪費(fèi)具有重要意義。然而,很多基于天然色素的pH指示膜的靈敏度不高,并且許多天然指示劑(如藍(lán)莓花青素[1-2]和紫薯花青素[3-5])在不同pH值條件下色澤變化不明顯,故限制了這類指示劑及指示膜的應(yīng)用。Buchweitz等[6]發(fā)現(xiàn)含有鐵-花青素螯合物的明膠基凝膠較瓊脂和酰胺化果膠基的凝膠表現(xiàn)出更深更明顯的藍(lán)色色調(diào)。因此,針對藍(lán)莓花青素在特定pH值條件下變色不明顯,且以其為指示劑制備的指示膜不能較好地監(jiān)測食品新鮮度等問題,本研究旨在利用明膠和Fe2+這兩種物質(zhì)增強(qiáng)指示膜的顯色效果和靈敏度,從而更好地監(jiān)測食品新鮮度,期望通過促進(jìn)指示膜中的指示劑與魚肉腐敗所產(chǎn)生特征性物質(zhì)(生物胺)的反應(yīng)凸顯顏色變化,從而使得消費(fèi)者能夠根據(jù)指示膜的顏色判斷魚肉所處的新鮮度等級。同時(shí),考慮到靜電紡絲是一種經(jīng)濟(jì)高效、操作簡單、條件溫和的制備高孔隙率、高比表面積和高活性包埋率的高靈敏度納米纖維的技術(shù)[7-9],且玉米醇溶蛋白是一種無毒、可生物降解、具有成膜性且可用于靜電紡絲制備納米纖維和膠囊的疏水性聚合物[10-13],因此,本研究采用靜電紡絲技術(shù)制備以藍(lán)莓花青素為指示劑,以玉米醇溶蛋白為基質(zhì)的含有烏鱧魚皮明膠/Fe2+的高靈敏度納米纖維指示膜,并以鰱魚魚肉新鮮度監(jiān)測為例驗(yàn)證該指示膜的有效性和靈敏性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        新鮮的花鰱和烏鱧購于鎮(zhèn)江市吉麥隆超市。

        玉米醇溶蛋白 美國Sigma公司;藍(lán)莓花青素(純度5%~25%)上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        DP30高壓靜電紡絲機(jī) 天津云帆科技有限公司;HH-S2恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司;紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司;CR-400色差儀日本柯尼卡美能達(dá)有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 烏鱧魚皮明膠的提取

        將清洗干凈的烏鱧魚皮切成2 cm×2 cm大小正方形小塊,用于提取明膠[14]。首先,將準(zhǔn)備好的魚皮在0.05 mol/L NaOH溶液中以1∶5(m/V)的料液比浸泡8 h,然后,將蒸餾水沖洗至魚皮pH值為中性(將魚皮以1∶4(m/V)的比例置于蒸餾水中,在55 ℃的恒溫水浴鍋中水浴6 h)。最后,用紗布和濾紙過濾提取液后得到濾液進(jìn)行冷凍干燥,獲得明膠粗提物,并將其保存在-40 ℃冰箱中備用。

        1.3.2 指示膜的制備

        1.3.2.1 靜電紡絲液的制備

        稱取適量的玉米醇溶蛋白和藍(lán)莓花青素溶于體積分?jǐn)?shù)70%的乙酸溶液中,其中,玉米醇溶蛋白和花青素的質(zhì)量濃度基于先前的實(shí)驗(yàn)分別取30 g/100 mL和5 g/100 mL[15]。在避光條件下用磁力攪拌器攪拌使玉米醇溶蛋白和花青素完全溶解得到紡絲液。在此基礎(chǔ)上,添加明膠(1 g/100 mL)和FeSO4·7H2O(0、0.01、0.04、0.07 mg/mL)制備含有明膠/Fe2+的紡絲液。

        1.3.2.2 靜電紡絲指示膜的制備

        采用高壓靜電紡絲機(jī)將上述紡絲液進(jìn)行靜電紡絲得到納米纖維指示膜,靜電紡絲參數(shù)為:電壓(18.0±1.5)kV、進(jìn)樣速率0.000 1 mm/s、溫度(20±5)℃、相對濕度(30±5)%。電紡納米纖維膜收集在鋁箔紙上,并避光儲(chǔ)存。未添加明膠和Fe2+的指示膜記為F0-0,僅添加明膠的指示膜記為F1-0,僅添加Fe2+的指示膜根據(jù)Fe2+的質(zhì)量濃度(0.01、0.04、0.07 mg/mL)分別記為F0-1、F0-4、F0-7,既添加明膠又添加Fe2+的指示膜根據(jù)Fe2+質(zhì)量濃度(0.01、0.04、0.07 mg/mL)分別記為F1-1、F1-4、F1-7。

        1.3.3 指示膜pH敏感性測定

        首先配制pH值分別為7、8、9、10、11、12、13的溶液,然后將制備的指示膜浸泡在10 mL不同pH值的溶液中,5 min后拍照記錄指示膜的顏色,根據(jù)指示膜在不同pH值溶液條件下的顏色變化情況初步判斷指示膜的pH(7~13)敏感性。

        1.3.4 指示膜對氨氣敏感性測定

        由于肉類新鮮度智能指示膜主要通過pH指示劑與肉制品腐敗時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性成分反應(yīng)的變化信息來判斷肉類的新鮮度,且氨氣(NH3)是肉類變質(zhì)產(chǎn)生的揮發(fā)性堿性氣體的代表,所以本實(shí)驗(yàn)以氨氣為模型氣體判斷含有明膠/Fe2+的指示膜在監(jiān)測魚肉新鮮度時(shí)敏感性是否有所提升。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:將F0-0、F0-4、F1-0和F1-44 種指示膜置于含有100 mL 10 mmol/L氨水的錐形瓶瓶口,每隔一定時(shí)間對指示膜拍照,記錄其顏色變化,直到指示膜的顏色達(dá)到平衡[15]。之后用Photoshop 2019軟件處理所拍得指示膜照片,并將指示膜的顏色進(jìn)行數(shù)值化分析,獲取顏色參數(shù)L*、a*、b*、R、G、B及顏色代碼等相關(guān)信息。在CIE-L*a*b*顏色標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)中,L*值表示顏色的明度;a*值表示紅綠度,正值表示偏紅,負(fù)值表示偏綠;b*值表示黃藍(lán)度,正值表示偏黃,負(fù)值表示偏藍(lán)。RGB色彩模式是工業(yè)領(lǐng)域的一種顏色標(biāo)準(zhǔn),RGB即是代表紅、綠、藍(lán)3 個(gè)通道的顏色。獲取顏色參數(shù)后按下式計(jì)算指示膜的顏色變化值(色差)ΔE。

        式中:Lt*、at*、bt*是指示膜暴露于氨氣環(huán)境后在t時(shí)刻的顏色值;L0*、a0*、b0*是指示膜的初始顏色值。

        1.3.5 指示膜中花青素釋放情況測定

        為了解所制備的指示膜(F0-0、F0-4、F1-0和F1-4)中藍(lán)莓花青素在高濕度條件下的穩(wěn)定性,測定了指示膜浸泡于水中時(shí)花青素的釋放情況。首先參照劉景榮[16]的方法繪制藍(lán)莓花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后稱取適量的指示膜,以膜、水8∶5(m/V)的比例將指示膜浸泡一定時(shí)間,每1 h用紫外-可見分光光度計(jì)測定上清液在530 nm波長處的吸光度。根據(jù)測得的吸光度和藍(lán)莓花青素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)溶液中花青素含量占指示膜中花青素總量的百分比,即花青素溶出率。

        1.3.6 指示膜應(yīng)用于魚肉新鮮度監(jiān)測實(shí)驗(yàn)

        1.3.6.1 魚肉腐敗過程中總揮發(fā)性鹽基氮含量和pH值的測定

        將處理好的花鰱魚肉,分成若干等分,每份50 g,裝在一次性塑料培養(yǎng)皿中,并將其分別貯藏在4 ℃和25 ℃環(huán)境中,4 ℃貯藏的魚肉每3 d測1 次pH值和總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量,直至魚肉完全腐敗。25 ℃貯藏的魚肉每12 h測1 次pH值和TVB-N含量,直至魚肉完全腐敗。參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》測定魚肉的TVB-N含量。測定pH值時(shí),5 g魚肉中加入25 mL去離子水進(jìn)行均質(zhì)后靜置30 min,過濾取濾液測定pH值,重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。

        1.3.6.2 魚肉新鮮度監(jiān)測

        將處理好的花鰱魚肉,分成若干等分,每份50 g,裝在一次性塑料培養(yǎng)皿中,并將指示膜(F0-0、F0-1、F0-4、F0-7、F1-0、F1-1、F1-4、F1-7)剪成0.5 cm×0.5 cm的正方形貼在培養(yǎng)皿蓋上。之后將若干裝有魚肉且粘有指示膜的培養(yǎng)皿分別放入4 ℃的冰箱和25 ℃的恒溫箱中。按照1.3.6.1節(jié)所述的時(shí)間間隔定期拍照記錄指示膜的顏色。按1.3.3節(jié)的方式處理所拍照片獲取響應(yīng)的顏色信息,并按上式計(jì)算ΔE。其中值是指示膜監(jiān)測魚肉新鮮度過程中t時(shí)刻的顏色值值是指示膜監(jiān)測魚肉新鮮度過程中t時(shí)刻前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的顏色值。

        1.3.6.3 相關(guān)性分析

        為了確定所制備的指示膜應(yīng)用于花鰱新鮮度監(jiān)測時(shí)所呈現(xiàn)的顏色信息與魚肉新鮮度之間的關(guān)系。將上述監(jiān)測魚肉新鮮度時(shí)指示膜的顏色響應(yīng)值P與魚肉新鮮度指標(biāo)TVB-N含量進(jìn)行線性擬合,根據(jù)線性擬合的決定系數(shù)判斷二者的相關(guān)性。其中P=(L*+a*+b*+R+G+B)/a*。

        1.3.7 指示膜作用機(jī)制初探

        1.3.7.1 Zeta電位測定

        配制不同pH值(5、7、9)的醋酸-醋酸鈉緩沖液,將花青素/明膠/FeSO4·7H2O溶于緩沖液中,用激光粒度儀在25 ℃測定相應(yīng)樣品的Zeta電位。將樣品注入一次性樣品池進(jìn)行測定,重復(fù)3 次。僅含有花青素的樣品記為A;僅含有烏鱧魚皮明膠的樣品記為G;僅含有FeSO4·7H2O的樣品記為F;含有花青素和明膠的樣品記為AG,含有花青素和FeSO4·7H2O的樣品記為AF,含有明膠和FeSO4·7H2O的樣品記為GF,含有花青素、明膠和FeSO4·7H2O的樣品記為AGF。

        1.3.7.2 驅(qū)動(dòng)力測定

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證明膠、花青素和Fe2+之間的相互作用,在pH值為5、7、9條件下分別配制了2 種懸濁液:含藍(lán)莓花青素和明膠的懸濁液(S11)和含藍(lán)莓花青素、明膠和Fe2+的懸濁液(S12),花青素、明膠和FeSO4·7H2O的最質(zhì)量終濃度分別為0.5、0.5 mg/mL和0.2 mg/mL。懸濁液的驅(qū)動(dòng)力測定參照Akbari等[17]的方法并稍做修改。將上述懸濁液分別與相同體積的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、尿素和二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)混合,其中SDS終質(zhì)量濃度分別為0、0.25、0.50、0.75、1.00 g/100 mL,尿素終濃度分別0、2、4、6、8 mol/L,DTT終濃度分別為0、15、30、45、60 mmol/L。反應(yīng)6 h后,用漩渦振蕩儀將其混合均勻并立即測定其在600 nm波長處的吸光度(以此表征濁度),測定兩種懸濁液在不同SDS、尿素和DTT添加量下的濁度,并通過計(jì)算濁度下降情況分析不同SDS、尿素和DTT添加量對兩種懸濁液濁度的影響。混合物渾濁度的降低被認(rèn)為是反映顆粒分解程度的一個(gè)指標(biāo)。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,每次3 個(gè)平行。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS Statistic 22軟件進(jìn)行單因素方差分析及顯著性分析(P<0.05表示差異顯著);采用Excel 2010軟件繪制線性相關(guān)性圖;采用Origin 2018軟件繪制其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖;采用Microsoft PowerPoint 2010軟件繪制機(jī)理圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 指示膜的pH敏感性

        8 種指示膜浸泡在不同pH值(7~13)溶液中的顏色變化如圖1所示。隨著pH值的增加,指示膜先由紅色變?yōu)樽霞t色,然后再變成紫灰色,最后變成灰黑色。與花青素的結(jié)構(gòu)變化相對應(yīng):甲醇假堿和黃烊鹽陽離子逐漸轉(zhuǎn)變成醌式堿和陰離子醌式堿[18]。此外,pH值從8增加到9時(shí),F(xiàn)1-4和F1-7最先發(fā)生了比較明顯的顏色變化。而其他大部分指示膜在pH 10時(shí)才發(fā)生較明顯的顏色變化。據(jù)報(bào)道,鐵(亞鐵)離子和花青素可以形成有色螯合物[6]。當(dāng)鐵(亞鐵)離子含量較低時(shí),花青素上的酚羥基取代基與鐵(亞鐵)離子發(fā)生部分配位,導(dǎo)致部分粉色顯色反應(yīng)[19],而當(dāng)鐵(亞鐵)離子的數(shù)量增加到一定程度時(shí),鐵(亞鐵)-花青素螯合物的數(shù)量增加,進(jìn)一步使溶液的顏色變?yōu)樽仙踔了{(lán)色[20]。同時(shí),明膠中含有生色團(tuán)和助色基團(tuán),在一定程度上會(huì)影響指示膜的顯色[15]。此外,pH值增加至12~13時(shí),花青素容易從指示膜中擴(kuò)散出來,即溶液堿性很強(qiáng)時(shí),容易破壞指示膜的玉米醇溶蛋白基質(zhì),使花青素容易擴(kuò)散至溶液中,與玉米醇溶蛋白易溶于高堿性溶液的結(jié)論[13]是一致的。

        圖1 不同指示膜在不同pH值溶液中的顏色Fig.1 Color response of different indicator films in solutions with different pH

        2.2 指示膜對氨氣的敏感性

        暴露于10 mmol/L的氨水上方的指示膜F0-0、F0-4、F1-0和F1-4所產(chǎn)生的色差值(ΔE)的變化曲線如圖2A所示。隨著暴露于氨水上方的時(shí)間延長,指示膜ΔE趨于穩(wěn)定,表明隨著時(shí)間的延長,指示膜的顏色逐漸趨于穩(wěn)定。暴露時(shí)間不超過6 min時(shí),F(xiàn)1-0和F1-4的ΔE迅速增加,繼續(xù)暴露于氨水上方后,ΔE基本穩(wěn)定在20左右,表明在6 min時(shí),F(xiàn)1-0和F1-4的顏色變化基本達(dá)到極限,顏色不再有明顯的變化。而F0-0的ΔE則在6 min之后繼續(xù)增加,需要暴露在氨水上方更長時(shí)間才能使得顏色趨于穩(wěn)定,且ΔE趨于穩(wěn)定所需的時(shí)間依次為F1-0/F1-4<F0-4<F0-0,即F1-0和F1-4在暴露時(shí)間更短、氨氣量更少的情況下就能使顏色變化趨于穩(wěn)定,說明添加了明膠/Fe2+的指示膜F1-0和F1-4對氨氣的響應(yīng)靈敏度更高。Jiang Guangyang等[5]制備了含紫甘薯花青素的淀粉/羧甲基纖維素基的指示膜用于監(jiān)測魚肉新鮮度,指示膜對氨(32 mmol/L)的響應(yīng)分析結(jié)果表明,紫甘薯花青素添加量為0.1 g/100 g時(shí),指示膜的ΔE最先趨于穩(wěn)定,且ΔE達(dá)到穩(wěn)定時(shí)所需時(shí)間為4.52 min,而不添加紫甘薯花青素指示膜達(dá)到穩(wěn)定時(shí)所需時(shí)間為14 min。進(jìn)一步說明了本實(shí)驗(yàn)所制備的含明膠和Fe2+指示膜的氨靈敏度較高。

        2.3 指示膜中花青素的釋放情況

        指示膜(F0-0、F0-4、F1-0和F1-4)中花青素在水中的釋放情況如圖2B所示。指示膜浸泡6 h之后花青素的溶出率仍保持在25%以下,說明本研究制備指示膜中的花青素不容易滲透至所監(jiān)測的食品上,可能是因?yàn)橹甘灸さ某赡せ|(zhì)是疏水性的玉米醇溶蛋白。而翟曉東[21]制備的復(fù)合膜中花青素提取物6 h后釋放率超過90%,進(jìn)一步體現(xiàn)出本實(shí)驗(yàn)所制備的指示膜對花青素的束縛作用。此外,浸泡1 h時(shí)指示膜中花青素表現(xiàn)出突釋的現(xiàn)象,可能是由于指示膜表面及靠近表面的花青素更容易從膜中釋放出來[16]。F1-0和F1-4浸泡6 h后花青素溶出量較F0-0和F0-4小,說明大分子明膠對于花青素的溶出具有抑制作用,可能與花青素及鐵-花青素螯合物與明膠之間的相互作用有關(guān)[15]。

        2.4 魚肉腐敗過程中TVB-N含量和pH值變化

        TVB-N是魚肉、畜肉等動(dòng)物肌肉貯藏過程中,內(nèi)源酶和微生物分解蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的[22],主要包括二甲胺、三甲胺及氨等含氮化合物,其含量是評價(jià)水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)之一。隨著貯藏時(shí)間的延長,pH值先由于ATP酶、糖類酵解及乳酸菌等作用產(chǎn)生乳酸而下降,隨后由于蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生堿性胺類物質(zhì)而上升,故pH值亦可用于評價(jià)魚肉等肉類的新鮮程度[23]。由圖3可知,在4 ℃和25 ℃貯藏條件下,魚肉的pH值均為先下降后上升,且TVB-N含量在貯藏前階段緩慢增加,隨后急劇增加。GB 2733—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》規(guī)定,淡水魚的TVB-N含量≤20 mg/100 g時(shí)被認(rèn)為是可接受的。從圖3A中可以看出,貯藏在4 ℃的鰱魚魚肉第9天左右的TVB-N含量稍大于20 mg/100 g,說明此時(shí)魚肉已經(jīng)腐敗,不宜食用。隨著貯藏時(shí)間的繼續(xù),TVB-N含量急劇增加,貯藏12 d后魚肉完全腐敗。25 ℃下貯藏24 h鰱魚魚肉的TVB-N含量接近規(guī)定的可接受值,說明此時(shí)魚肉即將腐敗,貯藏48~60 h之后,鰱魚魚肉完全腐?。▓D3B)。由于低溫不利于微生物的繁殖,所以貯藏在4 ℃的魚肉完全腐敗所需的時(shí)間較長。

        圖3 貯藏在4℃(A)和25℃(B)的魚肉腐敗過程中TVB-N含量和pH值的變化曲線Fig.3 Curves of TVB-N content and pH of of fish stored at 4℃ (A)and 25℃ (B) during spoilage

        2.5 指示膜監(jiān)測魚肉新鮮度時(shí)顏色響應(yīng)

        由圖4可知,指示膜用于監(jiān)測貯藏在4 ℃下的魚肉新鮮度時(shí),隨著貯藏時(shí)間的延長,指示膜的顏色從紫紅色變?yōu)榛易仙詈笞優(yōu)榛易厣?。本?shí)驗(yàn)鰱魚肉在4 ℃條件下貯藏9 d之后,TVB-N含量開始超過規(guī)定值,表明魚肉在貯藏9 d后腐敗變質(zhì),此時(shí)指示膜(F0-0、F0-1、F0-4和F0-7)由深灰紫色變?yōu)闇\灰紫色,而指示膜(F1-0、F1-1、F1-4和F1-7)則由灰紫色變?yōu)榛遥ňG)色。而鰱魚肉在25 ℃條件下貯藏約24 h之后,TVB-N含量開始超過限值,即魚肉在貯藏24 h后腐敗變質(zhì),此時(shí)指示膜F0-0、F0-1、F1-0由紫紅色變?yōu)樽丶t色,F(xiàn)0-4和F1-1由深紫灰色變?yōu)榛易厣?,F(xiàn)0-7由深紫灰色變?yōu)榛易仙?,F(xiàn)1-4和F1-7則由灰棕色變成灰色。且指示膜在監(jiān)測新鮮魚肉(0 d/0 h)時(shí)的顏色和監(jiān)測完全腐敗魚肉(12 d(4 ℃)/48 h(25 ℃))時(shí)的顏色變化最明顯。魚肉貯藏過程中產(chǎn)生的生物胺會(huì)使pH值增加,從而使指示膜的顏色發(fā)生上述變化,說明本研究制備的指示膜可用于魚肉新鮮度監(jiān)測,這與Li Yana等[18]的研究結(jié)果類似。此外,體系內(nèi)的TVB-N含量增加使微環(huán)境pH值增加的同時(shí),會(huì)導(dǎo)致指示膜紅色逐漸褪去,與圖5所示的代表紅綠度的顏色參數(shù)a*值的減小趨勢是一致的,且a*值越大(指示膜紅色越明顯)說明魚肉越新鮮。當(dāng)指示膜監(jiān)測貯藏于4 ℃時(shí)的魚肉新鮮度時(shí),含明膠/Fe2+的指示膜(F0-7、F1-1、F1-4和F1-7)在初始時(shí)a*值的減小速度更快,指示膜紅色褪去更快,說明這些指示膜的氨反應(yīng)靈敏度較高,與2.2節(jié)的結(jié)論是一致的。類似地,Ge Yunjun等[24]制備的明膠/氧化幾丁質(zhì)納米晶體納米復(fù)合膜暴露于pH值范圍為2~12的緩沖液時(shí),復(fù)合膜的顏色參數(shù)a*值隨pH值的增加而減小,說明pH值越大,紅色越不明顯,而綠色則越來越明顯。

        圖4 指示膜監(jiān)測貯藏在4 ℃(A)和25 ℃(B)條件下的魚肉新鮮度時(shí)顏色隨時(shí)間的變化Fig.4 Changes in color response of indicator films to the freshness of fish stored at 4 ℃ (A) and 25 ℃ (B)

        圖5 指示膜監(jiān)測貯藏在4 ℃(A)和25 ℃(B)條件下的魚肉新鮮度時(shí)的顏色參數(shù)a*值隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes in color parameter a* of indicator films for monitoring the freshness of fish stored at 4 ℃ (A) and 25 ℃ (B)

        一般來說,當(dāng)顏色差異值ΔE大于5時(shí),肉眼能夠觀察到兩種顏色之間的差異[25]。魚肉新鮮度監(jiān)測過程中,指示膜在相鄰時(shí)間點(diǎn)的顏色差異情況如表1所示。由于4 ℃和25 ℃貯藏的魚肉分別在9 d和24 h后TVB-N含量超過限值,不宜食用,所以指示膜在9 d和36 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ΔE需要足夠大,從而確保可以通過肉眼辨別出顏色的差異情況。從表1可以看出,添加了明膠和Fe2+的指示膜ΔE較大,說明添加了明膠和Fe2+之后的指示膜顯示出的顏色變化更易于被肉眼觀察到,有利于區(qū)分新鮮和腐敗的魚肉。

        表1 指示膜監(jiān)測魚肉過程中相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ΔETable 1 ΔE of indicator films between two adjacent time points during the monitoring of fish meat

        2.6 顏色響應(yīng)與TVB-N含量相關(guān)性分析

        TVB-N含量是魚肉新鮮度的重要指標(biāo)之一,為了使得指示膜不僅能夠監(jiān)測魚肉新鮮度而且還能科學(xué)準(zhǔn)確地推算出魚肉的TVB-N含量,本研究對指示膜的顏色響應(yīng)參數(shù)和TVB-N含量進(jìn)行了線性擬合。以魚肉貯藏過程中TVB-N含量為縱坐標(biāo),以顏色響應(yīng)情況(L*+a*+b*+R+G+B)/a*(記為P)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合。從表2可以看出,指示膜應(yīng)用于監(jiān)測貯藏在4 ℃的魚肉新鮮度時(shí),除了F1-0和F1-7之外,其余指示膜的顏色響應(yīng)情況P和TVB-N含量之間均存在較好的線性關(guān)系。其中,F(xiàn)1-1和F1-4顏色響應(yīng)情況P和TVB-N含量之間顯示出非常強(qiáng)的線性相關(guān)性(R2分別為0.999 1和0.983 3),但是F1-7則顯示出相關(guān)性較差的線性關(guān)系。說明明膠添加量為1 g/100 mL時(shí),若Fe2+添加量為0.01 mg/mL和0.04 mg/mL,指示膜的顏色響應(yīng)情況與魚肉新鮮度指標(biāo)TVB-N含量之間存在高度一致性,而繼續(xù)增加Fe2+質(zhì)量濃度至0.07 mg/mL時(shí),由于氨反應(yīng)靈敏度過高使得線性相關(guān)性降低。同樣,指示膜應(yīng)用于監(jiān)測貯藏在25 ℃的魚肉新鮮度時(shí),所有指示膜的顏色響應(yīng)情況P和TVB-N含量之間均存在較好的線性關(guān)系。其中F0-7、F1-1和F1-4顏色響應(yīng)情況P和TVB-N含量之間顯示出非常強(qiáng)的線性相關(guān)性(R2分別為0.987 6、0.983 3和0.981 7),說明僅添加Fe2+(0.07 mg/mL)或既添加明膠(1 g/100 mL)又添加Fe2+(0.01、0.04 mg/mL)時(shí),指示膜的顏色響應(yīng)情況與魚肉新鮮度指標(biāo)TVB-N含量之間存在高度一致性,而明膠添加量為1 g/100 mL時(shí),繼續(xù)增加Fe2+添加量至0.07 mg/mL,由于氨反應(yīng)靈敏度過高使得線性相關(guān)性降低。線性擬合結(jié)果表明,在監(jiān)測魚肉新鮮度的過程中,可以根據(jù)指示膜的顏色響應(yīng)情況P科學(xué)地推算出TVB-N含量,從而判斷魚肉的新鮮程度。同時(shí)也可以通過TVB-N含量的限值推算出所對應(yīng)的顏色響應(yīng)P的限值,進(jìn)而根據(jù)P的限值判斷魚肉新鮮程度。以4 ℃下監(jiān)測魚肉新鮮度的指示膜F1-1為例,當(dāng)TVB-N含量為20 mg/100 g時(shí),根據(jù)擬合方程y=0.085x+11.406,顏色響應(yīng)P所對應(yīng)的魚肉可食用限值為101.11。因此,4 ℃條件下,指示膜的(L*+a*+b*+R+G+B)/a*值超過101.11時(shí),所監(jiān)測的淡水魚已腐敗變質(zhì),不能食用。表明指示膜顏色響應(yīng)參數(shù)P能夠指示魚肉的新鮮度,并能對可食用和不宜食用魚肉進(jìn)行鑒別。該結(jié)論與Luo Qian等[26]根據(jù)水凝膠的(R+G+B)/B值判斷魚肉新鮮度的結(jié)果相似。

        表2 4 ℃和25 ℃貯藏條件下的魚肉新鮮度指標(biāo)(TVB-N含量)與指示膜顏色參數(shù)P(L*a*b*RGB)/a*)的線性關(guān)系Table 2 Linear correlation of fish freshness index (TVB-N) content and film color parameter P (L*+a*+b*+R+G+B)/a*) at 4 ℃ and 25 ℃

        表2 4 ℃和25 ℃貯藏條件下的魚肉新鮮度指標(biāo)(TVB-N含量)與指示膜顏色參數(shù)P(L*a*b*RGB)/a*)的線性關(guān)系Table 2 Linear correlation of fish freshness index (TVB-N) content and film color parameter P (L*+a*+b*+R+G+B)/a*) at 4 ℃ and 25 ℃

        2.7 明膠、Fe2+、花青素相互作用分析

        2.7.1 Zeta電位分析

        Zeta電位的絕對值反映了溶液的穩(wěn)定性。絕對值越高,粒子之間的相互排斥力越大,它們相互碰撞和聚集的可能性就越小。相反,絕對值越低,粒子就越容易相互吸引并聚集[27]。由圖6可知,不同pH值的藍(lán)莓花青素溶液的帶有部分凈負(fù)電荷,且Zeta電位絕對值小于5,可能是花青素在不同的pH值條件下不穩(wěn)定所導(dǎo)致。當(dāng)pH值從3增加至9時(shí),明膠的Zeta電位由正值轉(zhuǎn)為負(fù)值,且在pH 5和pH 7之間存在凈電荷為零的點(diǎn),說明本實(shí)驗(yàn)所提取的烏鱧魚皮明膠的等電點(diǎn)在5~7之間[28]。這與文獻(xiàn)[29]報(bào)道的堿法提取所獲得的B型明膠等電點(diǎn)在pH 5左右相一致。在花青素存在下,明膠的Zeta電位絕對值增加,說明花青素的存在使得明膠溶液的穩(wěn)定性增加?;ㄇ嗨貙Φ鞍踪|(zhì)溶液的表面電荷特性和穩(wěn)定性有一定的影響,這可能是花青素的添加引起靜電屏蔽現(xiàn)象導(dǎo)致的[30-31]。在Fe2+存在條件下,花青素溶液和明膠溶液的Zeta電位變化均不大,可能是Fe2+含量較低所致。而花青素、明膠和Fe2+共同存在時(shí),與兩兩復(fù)合時(shí)相比,Zeta電位絕對值增加,說明三者之間可能存在相互作用且所形成復(fù)合物的穩(wěn)定性增加[27]。

        圖6 不同pH值條件下不同樣品的Zeta電位分布Fig.6 Zeta potential distribution of different samples under different pH conditions

        2.7.2 驅(qū)動(dòng)力分析

        不同的分子間作用力可以被不同的化學(xué)試劑破壞[32]。尿素可以通過與蛋白質(zhì)氨基酸殘基形成新的氫鍵而破壞分子間和分子內(nèi)的氫鍵;SDS通過自身非極性尾巴與蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)域作用,使蛋白質(zhì)部分展開,從而破壞蛋白質(zhì)及其聚集體疏水相互作用;而DTT可以破壞二硫鍵[32]。為了研究花青素、明膠和Fe2+之間的氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用,采用不同添加量的尿素、DTT和SDS處理S11和S12。從圖7中可以看出,加入尿素時(shí),S11和S12的濁度下降得最多,說明花青素、明膠和Fe2+之間的主要是氫鍵相互作用,而疏水相互作用和二硫鍵則占比少。且不同pH值條件下,添加Fe2+之后的混合液(S12)在添加尿素和SDS之后濁度下降率減小。說明添加Fe2+之后,混合液中不同物質(zhì)之間的氫鍵數(shù)量和疏水相互作用減少。猜想可能是Fe2+既會(huì)和明膠形成基態(tài)配合物,又會(huì)和花青素形成螯合物,減少了花青素和明膠的結(jié)合,從而使二者相互作用所形成的氫鍵數(shù)量減少[6,19,33]。

        圖7 尿素(A)、SDS(B)和DTT(C)對不同pH值條件下S11和S12濁度降低的影響Fig.7 Effect of urea (A),sodium dodecyl sulfate (SDS) (B) and DL-dithiothreitol (DTT) (C) on the decrease in the turbidity of S11 and S12 under different pH conditions

        添加明膠和Fe2+的指示膜具有良好的氨反應(yīng)靈敏性、花青素保護(hù)特性及顏色響應(yīng)特性。而根據(jù)添加明膠和Fe2+之后藍(lán)莓花青素溶液的紫外-可見吸收光譜的吸收峰強(qiáng)度和位置發(fā)生變化[15]及Zeta電位發(fā)生變化可知三者存在相互作用,而驅(qū)動(dòng)力分析結(jié)果表明三者主要存在氫鍵相互作用。三者可能的主要相互作用機(jī)理如圖8所示。

        圖8 提出的花青素、明膠和Fe2+之間的主要相互作用機(jī)理Fig.8 Proposed interaction mechanism among anthocyanins,gelatin and Fe2+

        3 結(jié)論

        本研究制備以藍(lán)莓花青素為指示劑、以玉米醇溶蛋白為基質(zhì)的含明膠和Fe2+指示膜具有對pH值和氨的高靈敏性,可應(yīng)用于魚肉的新鮮度監(jiān)測。含有適量明膠和Fe2+的指示膜監(jiān)測魚肉新鮮度時(shí)呈現(xiàn)的顏色響應(yīng)特性P((L*+a*+b*+R+G+B)/a*)與魚肉新鮮度指標(biāo)TVB-N含量之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性(R2>0.98)。明膠/Fe2+與花青素的相互作用影響了指示膜的顏色,使指示膜在監(jiān)測腐敗魚肉時(shí)表現(xiàn)出與新鮮魚肉較大的顏色差異(ΔE),因此對腐敗魚肉的監(jiān)測具有很高的靈敏性?;ㄇ嗨?、明膠和Fe2+之間主要通過氫鍵相互作用,創(chuàng)造了獨(dú)特的微環(huán)境,增加了花青素對pH值的靈敏性。本研究通過將一些特殊物質(zhì)與色素結(jié)合,可為開發(fā)智能食品包裝和各種食品保鮮指標(biāo)提供新的思路。

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