李蕊,張志強(qiáng),高揚(yáng)

(北京康仁堂藥業(yè)有限公司 中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心,北京 101301)

荊芥穗之名始載于《食療本草》,是經(jīng)典中藥,自唐代沿用至今,《神農(nóng)本草經(jīng)》將之列為草部中品。荊芥穗為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗。夏、秋二季花開到頂,穗綠時(shí)采摘,除去雜質(zhì),曬干[1]。荊芥穗,味辛,性微溫,歸肝肺經(jīng),是一味常用的中藥解表藥[1],用藥歷史悠久,民間用于治療頭風(fēng)、虛勞、婦人血風(fēng)等[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,荊芥穗具有抗炎、抗病毒和鎮(zhèn)痛作用,并具有一定的抗補(bǔ)體作用[2]。荊芥穗治療婦科血癥、帶下等疾病,也取得較好的效果[3],因此具有較高的開發(fā)價(jià)值。

中藥配方顆粒是將中藥飲片提取、濃縮制成的顆粒劑,用于臨床中藥配方[4]。鑒于它們失去了傳統(tǒng)飲片的外觀,難以區(qū)分和鑒別,其質(zhì)量也不易評(píng)價(jià)[5-7]。目前對(duì)荊芥的研究主要集中在其揮發(fā)油的成分分析和含量測(cè)定上。但鑒于中藥成分的復(fù)雜性,很難借助單一指標(biāo)成分的含量測(cè)定來評(píng)價(jià)配方顆粒的整體質(zhì)量。中藥特征圖譜是一種對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行整體控制的方法。能反映中藥化學(xué)成分信息的全貌。它不僅能夠鑒別成分類型,還能夠評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的均勻性和穩(wěn)定性[6-7]。

因此,構(gòu)建中藥配方顆粒指紋圖譜能夠反映其化學(xué)特征信息,對(duì)其質(zhì)量控制具備重要意義,目前尚無荊芥穗顆粒指紋圖譜的相關(guān)研究。本研究采取使用超高效液相色譜法(UPLC)構(gòu)建了荊芥穗配方顆粒的指紋圖譜;同時(shí),構(gòu)建了荊芥穗配方顆粒中特定成分胡薄荷酮的測(cè)定方法,旨在為荊芥穗配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和應(yīng)用予以參考。

1 設(shè)備與試劑試藥

Waters ACQUITY UPLC H-Class,島津2010AHT,安捷倫1260,BSA124S電子天平;XP26電子天平;超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);島津 Wondasil C18(柱長(zhǎng)為250 mm,柱內(nèi)徑為4.6 mm,粒徑為5 μm);島津 ShiMADZA C18-AQ(柱長(zhǎng)為250 mm,柱內(nèi)徑為4.6 mm,粒徑為5 μm);Waters XBridge Shield RP 18(柱長(zhǎng)為250 mm,柱內(nèi)徑為4.6 mm,粒徑為5 μm);Waters CORTECS UPLC?T3(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)色譜柱。

荊芥穗對(duì)照藥材(批號(hào):121424-201404,中國食品藥品檢定研究院);胡薄荷酮對(duì)照品(批號(hào):111706-201606,純度99.8%,中國食品藥品檢定研究院);木犀草苷對(duì)照品(批號(hào):111720-201609,中國食品藥品檢定研究院);迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào):111871-201706,中國食品藥品檢定研究院);咖啡酸對(duì)照品(批號(hào):111885-200102,中國食品藥品檢定研究院);原兒茶酸(批號(hào):110806-201906,中國食品藥品檢定研究院);原兒茶醛(批號(hào):110810-201909,中國食品藥品檢定研究院);橙皮苷(批號(hào):110721-202019,中國食品藥品檢定研究院);荊芥穗配方顆粒:KL-01、KL-02、KL-03、KL-04、KL-05、KL-06、KL-07、KL-08、KL-09、KL-10、KL-11、KL-12、KL-13、KL-14、KL-15、KL-16;甲醇(Merk);蒸餾水(屈臣氏);乙腈(Merk);甲酸、磷酸(Fisher Chemical);其他試劑為分析純。

2 胡薄荷酮含量測(cè)定

2.1 荊芥穗配方顆粒揮發(fā)油中成分分析

采用氣相質(zhì)譜法對(duì)揮發(fā)油中的成分進(jìn)行推斷,結(jié)果見圖1、表1。

表1 氣相質(zhì)譜主要峰推斷表

結(jié)果顯示:揮發(fā)油中含有薄荷酮、胡薄荷酮等成分。

進(jìn)一步用氣相色譜法對(duì)揮發(fā)油中的成分進(jìn)行確認(rèn),結(jié)果見圖2。

圖2 荊芥穗配方顆粒揮發(fā)油氣相色譜指認(rèn)圖

通過對(duì)照品指認(rèn),揮發(fā)油中主要含有薄荷酮及胡薄荷酮,其中胡薄荷酮在揮發(fā)油中的含量約為70%。

2.2 胡薄荷酮的測(cè)定

2.2.1 樣品的配制

取荊芥穗配方顆粒,適量,研細(xì),取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.2 對(duì)照品的配制

取胡薄荷酮對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液,即得。

2.2.3 色譜分析條件

按照高效液相色譜法(中國藥典2020年版通則0512)測(cè)定。色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-水(V甲醇∶V水=70∶30,體積比)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm。理論板數(shù)按胡薄荷酮峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 專屬性研究

取對(duì)照品溶液、配方顆粒溶液和陰性溶液進(jìn)行檢測(cè)(見圖3),結(jié)果表明,樣品中各個(gè)峰分離較好,陰性無干擾,表明該方法的專屬性好。

A.荊芥穗配方顆粒溶液;B.胡薄荷酮對(duì)照品溶液;C.陰性溶液圖3 荊芥穗配方顆粒溶液、胡薄荷酮對(duì)照品溶液及陰性溶液圖譜

2.3.2 線性關(guān)系研究

取胡薄荷酮對(duì)照品適量,取8.100 mg,加70%甲醇定容至20 mL,作為母液(對(duì)照品溶液⑤)。分別取母液1,1,1,5 mL,加70%甲醇分別定容至100,50,10,10 mL。精密吸取上述5種對(duì)照品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,按正文方法測(cè)定胡薄荷酮色譜峰峰面積,以胡薄荷酮色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo),胡薄荷酮的濃度為橫坐標(biāo),得到回歸方程為y= 3×107x+27 014,r= 0.999 9,表明胡薄荷酮在0.004 05～0.405 mg/mL范圍內(nèi)有較好的線性。

2.3.3 重復(fù)性研究

取荊芥穗配方顆粒,按照“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液的配制方法配制6份樣品溶液,精密取10 μL,測(cè)定,胡薄荷酮的含量平均值為5.9 mg/g,RSD=0.6%,結(jié)果顯示方法重復(fù)性較好。

2.3.4 加樣回收研究

取已知含量的同一批樣品各0.25 g,精密稱量9份,分別添加低中高三個(gè)濃度的胡薄荷酮對(duì)照品,按照“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液的配制方法制備9份樣品溶液,精密取10 μL測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,平均回收率為95.4%,RSD=3.2%,結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確度較好。

2.3.5 穩(wěn)定性研究

取荊芥穗配方顆粒,按照“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液的配制方法制備樣品溶液,分別于制備后0～24 h,間隔2 h取樣,精密取10 μL測(cè)定,記錄峰面積,其峰面積的RSD=1.9%,結(jié)果顯示溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.6 耐用性研究

考察不同柱溫、不同色譜柱、不同波長(zhǎng)及不同流速對(duì)本檢測(cè)方法的耐用性,結(jié)果見表2。各色譜條件發(fā)生微小變化時(shí),本方法能滿足試驗(yàn)要求,耐用性較好。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果表

2.3.7 樣品含量檢測(cè)

按照“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液的配制方法配制樣品溶液,測(cè)定胡薄荷酮含量,結(jié)果如表3。16批荊芥穗配方顆粒胡薄荷酮含量為3.41～6.44 mg/g。

表3 16批荊芥穗配方顆粒中胡薄荷酮含量

3 特征圖譜的建立

3.1 參照物的配制

取荊芥穗對(duì)照藥材2 g,加水25 mL,煮沸20 min,濾過,同樣品溶液配制方法制備,作為對(duì)照藥材參照物溶液。另取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草苷對(duì)照品適量,加甲醇分別制成每1 mL含0.1 mg的溶液,作為對(duì)照品參照物溶液。

3.2 樣品的配制

取荊芥穗配方顆粒適量,研細(xì),取約0.5 g,置具塞錐形瓶中,加水20 mL,超聲處理30 min,放冷,用乙酸乙酯振搖提取兩次,每次30 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)?0%甲醇使溶解并定容至10 mL,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

3.3 色譜條件

以CORTECS UPLC T3(100 mm×2.1 mm,1.6 μm)為色譜柱;以乙腈為流動(dòng)相A,0.1%磷酸為流動(dòng)相B,按表4梯度進(jìn)行洗脫;流速為0.4 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。理論板數(shù)按咖啡酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

表4 梯度洗脫表

3.4 方法學(xué)研究

3.4.1 精密度研究

取“3.1”項(xiàng)下的對(duì)照品參照物溶液,在“3.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間,RSD均在5%以內(nèi),結(jié)果顯示儀器精密度較好。

3.4.2 重復(fù)性研究

取荊芥穗配方顆粒,按“3.2”項(xiàng)方法配制6份樣品溶液,在“3.3”項(xiàng)色譜條件下分別測(cè)定,計(jì)算相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間,RSD均在5%以內(nèi),結(jié)果顯示方法重復(fù)性較好。

3.4.3 穩(wěn)定性研究

取同一批荊芥穗配方顆粒,按“3.2”項(xiàng)方法制備樣品溶液,“3.3”項(xiàng)色譜條件下,分別于0～24 h,每間隔2 h取樣進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間,RSD均在5%以內(nèi),結(jié)果顯示溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.5 特征圖譜中成分質(zhì)譜推斷解析及共有峰指認(rèn)

特征峰的推斷:取“3.2”項(xiàng)下制備的樣品溶液,按“3.3”色譜條件,利用高效液相串聯(lián)高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀獲得其質(zhì)譜圖,并根據(jù)質(zhì)譜圖對(duì)10個(gè)特征峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷,推斷結(jié)果見圖4、表5。

表5 特征峰質(zhì)譜推斷結(jié)果

圖4 荊芥穗配方顆粒質(zhì)譜圖

利用高效液相串聯(lián)高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)荊芥穗配方顆粒中各特征峰分析,確定了9個(gè)特征峰的分子式,推斷了6個(gè)特征峰:峰2推斷為原兒茶酸,峰4推斷為原兒茶醛,峰6推斷為咖啡酸,峰7推斷為木樨草甘,峰9推斷為橙皮苷,峰10推斷為迷迭香酸。

特征峰的確認(rèn):取原兒茶酸、原兒茶醛、橙皮苷、咖啡酸、迷迭香酸、木犀草苷對(duì)照品適量,精密稱取,加甲醇分別制成每1 mL含0.1 mg的對(duì)照品溶液,作為對(duì)照品參照物溶液。

取荊芥穗配方顆粒與6個(gè)對(duì)照品溶液,檢測(cè),結(jié)果見圖5。

圖5 特征峰確認(rèn)圖

通過對(duì)照品指認(rèn),最終對(duì)6個(gè)特征峰進(jìn)行歸屬確認(rèn):其中峰2為原兒茶酸,峰4為原兒茶醛,峰6為咖啡酸,峰7為木樨草甘,峰9為橙皮苷,峰10為迷迭香酸。

3.6 隨行藥材測(cè)定

隨行藥材測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖6 荊芥穗配方顆粒與對(duì)照藥材圖譜對(duì)比

由圖6可以看出,荊芥穗對(duì)照藥材與配方顆粒相比較,特征峰保留時(shí)間一致峰形峰數(shù)統(tǒng)一,可為標(biāo)準(zhǔn)研究制定提供可靠依據(jù)和參考。

3.7 特征圖譜的構(gòu)建

分別取16批荊芥穗配方顆粒,按“3.2”項(xiàng)下樣品溶液配制方法制備,再按“3.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定,使用《特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012版本)。得出荊芥穗配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜R(圖7)和16批荊芥穗配方顆粒的重疊特征圖譜(圖8),并進(jìn)行共有峰的標(biāo)記,最終共標(biāo)記10個(gè)共有峰。

圖7 荊芥穗配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜

圖8 16批荊芥穗配方顆粒的特征圖譜

3.8 特征圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間的規(guī)定

由16批荊芥穗配方顆粒特征圖譜可知,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間差異較小,均在5%范圍內(nèi),符合質(zhì)量控制的要求,以咖啡酸為S峰,各峰的相對(duì)保留時(shí)間為:0.41(峰1),0.43(峰2),0.58(峰3),0.61(峰4),0.65(峰5),1.00(峰6S),2.65(峰7),3.09(峰8),3.32(峰9),3.43(峰10)。允許誤差范圍為:±10%。

4 討論

中藥配方顆粒保留了原飲片的藥效和性狀,具備不煎煮、調(diào)劑容易、貯藏方便、服用、攜帶、患者運(yùn)輸方便等特點(diǎn)。借助大量的臨床實(shí)驗(yàn)和患者的親身體驗(yàn),其療效與傳統(tǒng)湯劑基本相同。與預(yù)想不同的是,目前市場(chǎng)上流通的中藥配方顆粒規(guī)格并不統(tǒng)一,產(chǎn)品質(zhì)量也存在較大差異。因此,構(gòu)建統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)是不可或缺和合理且正確的。

研究表明,荊芥穗的主要成分是揮發(fā)油,揮發(fā)油的主要成分是胡薄荷酮。因此,本研究將測(cè)定胡薄荷酮的含量認(rèn)為是控制荊芥穗顆粒劑的方法之一。鑒于中草藥成分復(fù)雜,中草藥及中藥飲片制成配方顆粒后失去了藥性,應(yīng)當(dāng)需要構(gòu)建特異性強(qiáng)的特征圖譜,客觀評(píng)價(jià)荊芥穗產(chǎn)品質(zhì)量,因此,本實(shí)驗(yàn)使用超高效液相色譜法構(gòu)建了荊芥配方顆粒的特征圖譜,為荊芥配方顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)予以參考。中藥指紋圖譜能更全面地反映中藥所含化學(xué)成分的種類,更易于控制其質(zhì)量[8-9]。從16批次荊芥穗配方顆粒的UPLC指紋圖譜可以看出,相似度大于0.90,鑒定出原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、木犀草素、橙皮苷、迷迭香酸的峰歸屬,指紋圖譜相似度高,方法穩(wěn)定性好,可用于控制荊芥顆粒配方顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量。