劉淑艷 王偉榮 葉凌赟 高金星

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔惡性腫瘤中最常見的類型，患者5 年總生存率不足60%[1-2]。近年來，中藥在抗腫瘤治療中的重要性逐漸被發(fā)現(xiàn)。土茯苓復方由土茯苓、銀花、甘草、連翹、大黃和馬齒莧等中藥組成，其中的土茯苓苷、茯苓醇等不僅可以抑制癌細胞的生長和擴散，還可提高機體的抗癌能力[3-6]；銀花提取物具有增強免疫功能的作用[7-8]；甘草提取物具有抗氧化和抗腫瘤的特性[9-10]；連翹、大黃和馬齒莧等提取物也展現(xiàn)出抗氧化、抗炎的功效，并對多種癌細胞具有抑制增殖和擴散的能力[11-18]?？梢娡淋蜍邚头街械母鞣N成分均具有一定的抗腫瘤活性，但是其作用機制尚需進一步探討。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學對土茯苓復方的有效成分和靶點進行篩選，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)探究土茯苓復方的OSCC 治療靶點及其相互作用關(guān)系，對潛在疾病治療靶點的生物學過程和途徑進行富集分析，并對疾病關(guān)鍵靶點進行分子對接，以揭示土茯苓復方治療OSCC 的作用機制，為尋找OSCC 新的治療靶點提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 土茯苓復方潛在活性成分及靶點預測 登錄中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以“dahuang”“gancao”“l(fā)ianqiao”“machixian”“tufulin”“yinhua”為關(guān)鍵詞，以化合物的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，篩選土茯苓復方主要活性成分及關(guān)聯(lián)這些活性成分的相應靶點。通過通用蛋白質(zhì)資源（universal protein resource，UniProt）數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）搜索靶點的UniProt ID，并將物種定義為“Homo sapiens”，以便后續(xù)獲得治療靶點的三維結(jié)構(gòu)。

1.2 OSCC 相關(guān)靶點篩選 從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中下載OSCC 的mRNA 表達譜和患者臨床資料。表達譜數(shù)據(jù)的單位由每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM）轉(zhuǎn)化為每百萬轉(zhuǎn)錄本（transcripts per million，TPM）[19]。利用limma R 包篩選OSCC 組織與正常組織之間的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）[20]。DEGs 的篩選條件定義為P＜0.05。在Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）數(shù)據(jù)庫（https://omim.org）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）中搜索關(guān)鍵詞“口腔鱗狀細胞癌”，獲取疾病靶點。將DEGs 和數(shù)據(jù)中獲得的疾病靶點取交集，篩選得到OSCC 相關(guān)靶點。

1.3 潛在治療靶點與主要活性成分的獲取 將1.1中潛在活性成分相應靶點與1.2 中OSCC 相關(guān)靶點取交集，繪制韋恩圖，獲得土茯苓復方抗OSCC 的潛在治療靶點。隨后獲得這些靶向潛在治療靶點的活性成分，即土茯苓復方抗OSCC 的主要活性成分。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將土茯苓復方抗OSCC的潛在治療靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，參數(shù)設(shè)置為最高置信度0.700，去除無連接的靶蛋白，進行PPI 分析。將分析結(jié)果導入Cytoscape 軟件進行可視化處理，獲得“OSCC 靶點-藥物活性成分”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。通過拓撲學分析，即使用Cytoscape 軟件中的CytoNCA 工具模塊，計算PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的參數(shù)，包括度數(shù)、接近中心性、介數(shù)中心性、特征向量、局部平均連接系數(shù)和網(wǎng)絡(luò)[21]。并以這6 個參數(shù)的中位數(shù)為閾值，治療靶點的6 個參數(shù)均大于其相應中位值的靶點作為關(guān)鍵作用靶點。上述拓撲學分析進行兩次，獲得的靶點確定為土茯苓復方抗OSCC 的關(guān)鍵作用靶點。按照度值大小進行排序，前3 個靶點被視為最關(guān)鍵作用靶點。

1.5 土茯苓復方抗OSCC 關(guān)鍵作用靶點的功能與通路的基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書（K yo to encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 利用Cluster Profiler R 包對土茯苓復方抗OSCC 關(guān)鍵作用靶點進行GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析。利用Metascape（https://metascape.org）在線數(shù)據(jù)庫對上述拓撲學首次分析的關(guān)鍵作用靶點進行GO 和KEGG 富集分析，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，P＜0.05 為數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義。

1.6 TCGA-OSCC 低表達組患者和高表達組患者的生存分析 根據(jù)3 個最關(guān)鍵作用靶點對應基因的中位表達值將TCGA-OSCC 患者分為低表達組和高表達組，繪制Kaplan-Meier 曲線，比較兩組的OS 和無進展生存期（progression-free survival，PFS）。log-rank 檢驗P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。HR＜1 說明該基因是保護因素，HR＞1 說明該基因是危險因素。

1.7 分子對接 采用Autodock Vina（http://autodock.scripps.edu/）進行分子對接。對接流程：（1）從Pub-Chem 化合物數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)鍵的藥物活性化合物的結(jié)構(gòu)文件（mol2 格式），利用ChemOffice 軟件2019（Chem-Draw Professional 2019）將其轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，利用AutoDockTools 1.5.6 軟件將三維結(jié)構(gòu)氫化計算并保存為PDBQT 文件。（2）從RCSB PDB 蛋白庫（https://www.pdb.org/）中獲取治療疾病的最關(guān)鍵作用靶點晶體結(jié)構(gòu)，導入PyMOL 1.7.2.1（https://pymol.org/2/）中，脫水、氫化，用于配體分離。 隨后在AutoDockTools 1.5.6 中對每個目標蛋白的活性位點構(gòu)建對接口袋，以PDBQT 格式保存。（3）使用AutoDock Vina 4.2 對假定的最關(guān)鍵作用靶點和藥物活性化合物進行分子對接，并評估自由結(jié)合能。對接分數(shù)的絕對值反映了組分與目標的親和度和構(gòu)象的穩(wěn)定性。絕對值＞4.25 表示有一定的結(jié)合活性，＞5.00表示結(jié)合活性較好，＞7.00 表示結(jié)合活性較強。（4）利用PyMOL 和Discovery Studio 2022 可視化軟件分析活性化合物的相互作用和結(jié)合模式。

2 結(jié)果

2.1 土茯苓復方和OSCC 交集靶點的獲取 TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得6 種中藥中179 個化合物，其中大黃、甘草、連翹、馬齒莧、土茯苓和銀花分別包含16、92、23、10、15 和23 個化合物。核心預測靶標634 個，其中大黃70 個，甘草237 個，連翹229 個，馬齒莧224個，土茯苓214 個，銀花220 個。在OMIM 和GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到與OSCC 密切相關(guān)的疾病靶點6 842個。TCGA 中共篩選到OSCC 相關(guān)的差異基因18 119個，取交集后最終得到3 079 個OSCC 相關(guān)靶點，見圖1A。對土茯苓復方的靶標和OSCC 相關(guān)靶點取交集，獲得潛在治療靶點141 個，見圖1B。與15 個以上靶點連接的成分有8 個，分別為槲皮素（81 個）、山奈酚（33 個）、木犀草素（33 個）、漢黃芩素（24 個）、花生四烯酸（22 個）、7 甲氧基-2 甲基異黃酮（19 個）、異鼠李素（16 個）和柚皮素（16 個）。這些成分可能在OSCC的發(fā)病機制和治療中發(fā)揮重要作用。靶向藥物種類＞50 的靶點有11 個，說明土茯苓復方治療OSCC 的機制比較復雜。

圖1 土茯苓復方和OSCC交集靶點的獲?。ˋ：數(shù)據(jù)庫OSCC相關(guān)基因與差異表達基因的Venn圖；B：藥物與疾病靶點的Venn圖）

2.2 潛在治療靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵作用靶點獲取 將141 個潛在治療靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。利用Cytoscape 3.9.1 軟件繪制土茯苓復方抗OSCC 的“OSCC 靶點-藥物活性成分”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖3（插頁）。CytoNCA 計算兩次后得到13個關(guān)鍵作用靶點，分別為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）14、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、窩蛋白-1（caveolin 1，CAV1）、缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α）、IL-1B、MAPK8、NF-κB 抑制劑α（NF-κB inhibitor-alpha，NFκBIA）、MAPK3、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA proto-oncogene，RELA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3，CASP3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 “OSCC 靶點-藥物活性成分”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

對141 個潛在治療靶點的GO 分析結(jié)果顯示，這些基因共參與了2 016 個生物學過程、44 個細胞成分組成、175 個分子功能。其中生物學過程包括對脂多糖、細菌源分子、外來刺激、營養(yǎng)水平、類固醇激素和金屬離子的反應；涉及的細胞成分包括膜筏、膜微域、囊泡腔、分泌顆粒腔、細胞質(zhì)囊泡腔；參與的分子功能包括DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶特異性DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化活性和類固醇激素受體活性，見圖4A）。KEGG 結(jié)果顯示，這些基因主要參與了162 個信號通路，包括糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路、化學致癌-受體激活、TNF 信號通路、IL-17 信號通路、Th17 細胞分化、凋亡、NF-κB 信號通路和HIF-1α 信號通路等，見圖4B）。

圖4 GO 分析和KEGG 通路富集分析（A：GO 分析結(jié)果；B：KEGG 通路富集分析結(jié)果）

2.3 關(guān)鍵作用靶點與OSCC 患者預后的關(guān)系分析單因素Cox 回歸結(jié)果顯示，13 個關(guān)鍵作用靶點中與OS 有關(guān)的共9 個，分別為AKT1、CASP3、CAV1、EGF、EGFR、MAPK8、MAPK14、RELA 和VEGFA，這些基因的高表達與較低的OS 顯著相關(guān)，見圖5。13個關(guān)鍵作用靶點中與PFS 有關(guān)的有7 個，分別為AKT1、CASP3、CAV1、EGF、HIF-1α、MAPK8 和VEGFA。除HIF-1α 外，其余基因高表達與較短的PFS 顯著相關(guān)，見圖6。提示上述預后相關(guān)基因是疾病的風險因素，靶向這些基因可能有助于疾病的治療。

圖5 基因表達量與患者總生存期的關(guān)系（A：AKT1；B：CASP3；C：CAV1；D：EGF；E：EGFR；F：MAPK8；G：MAPK14；H：RELA；I：VEGFA）

圖6 基因表達量與患者無進展生存狀態(tài)的關(guān)系（A：AKT1；B：CASP3；C：CAV1；D：EGF；E：HIF-1α；F：MAPK8；G：VEGFA）

2.4 最關(guān)鍵作用靶點和有效成分的分子對接驗證 按照度值大小進行排序，被視為最關(guān)鍵作用靶點的前3 個靶點依次為MAPK3、AKT1 和CASP3。作用于MAPK3 的有效成分為柚皮素；作用于AKT1 的有效成分有柚皮素、漢黃芩素、薯蕷皂苷元、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素和槲皮素；作用于CASP3 的有效成分有柚皮素、漢黃芩素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素和蘆薈大黃素。分子對接結(jié)果顯示，柚皮素與MAPK3 的對接分數(shù)為-7.3，β-胡蘿卜素與CASP3 的對接分數(shù)為-8.0，山奈酚與CASP3 的對接分數(shù)為-8.1，顯示出較強的結(jié)合活性，見圖7（插頁）。

圖7 最關(guān)鍵作用靶點與有效成分的分子對接圖（A：柚皮素與MAPK3 的分子對接圖；B：β-胡蘿卜素與CASP3 的分子對接圖；C：山奈酚與CASP3 的分子對接圖）

3 討論

最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)提示，全球每年約有35 萬例新的OSCC 確診病例和17 萬死亡病例[1]。尋找有效的治療藥物對于OSCC 患者至關(guān)重要。中藥土茯苓復方成分復雜，可通過多靶點、多途徑、多層次整合調(diào)控產(chǎn)生協(xié)同功效，對腫瘤治療有效。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土茯苓復方的有效成分中，與15 個以上靶點連接的成分有8 個，分別是槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、花生四烯酸、7 甲氧基-2 甲基異黃酮、異鼠李素和柚皮素。其中柚皮素作用于MAPK3；柚皮素、漢黃芩素、薯蕷皂苷元、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素和槲皮素作用于AKT1；柚皮素、漢黃芩素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素和蘆薈大黃素作用于CASP3?？梢奜SCC 中的MAPK3、AKT1 和CASP3 等3 個最關(guān)鍵作用靶點，分別被土茯苓復方中不同的有效成分靶向作用。

土茯苓復方包含土茯苓、銀花、生甘草、連翹、大黃、馬齒莧等6 種中藥，其中土茯苓的主要活性成分槲皮素，具有調(diào)節(jié)表皮生長因子/熱激蛋白27 通路的作用，通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的血管生成擬態(tài)進而減輕乳腺癌的惡性程度[22]；此外，柚皮素和β-谷甾醇能夠癌細胞停滯G0/G1期，通過調(diào)節(jié)細胞周期來抑制癌細胞的生長和擴散[23-24]。銀花中的山奈酚具有抗氧化和抗腫瘤活性，能夠通過干擾癌細胞的生物學行為來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[25]。甘草中的甘草酸具有抗炎和抗腫瘤作用，可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抑制腫瘤細胞增殖來抑制腫瘤的發(fā)展[26]。馬錢子堿是來自連翹的一種有效的抗腫瘤化合物，能夠通過干擾細胞凋亡途徑和抑制腫瘤細胞的生長來抑制腫瘤的發(fā)展[27-29]。大黃中的大黃素具有抗炎和抗腫瘤活性，能夠通過抑制炎癥反應和調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑來抑制腫瘤的生長和擴散[30-32]。馬齒莧素是馬齒莧的一種有效的抗腫瘤成分，能夠通過抑制腫瘤細胞的增殖和遷移來抑制腫瘤的發(fā)展[33]。這些中藥成分的多靶點調(diào)控作用可能是中藥治療OSCC 的有效機制之一。它們通過作用于多個關(guān)鍵靶點，影響腫瘤細胞的生長、增殖、遷移、凋亡等多個生物學過程，從而抑制OSCC 的發(fā)展。這種多靶點調(diào)控的特性有助于提高治療的有效性，并減少患者對單一藥物的耐藥性。

本研究還存在一定的局限性。土茯苓復方的有效活性成分在體內(nèi)發(fā)揮抗OSCC 中的有效性和潛在機制還尚不明確，生物活性成分治療OSCC 的作用機制有待進一步的體外和體內(nèi)研究，此外中藥有效成分的濃度、劑量、劑型、作用時間等一系列問題還尚未被探究。

綜上所述，本研究應用生物信息學方法，系統(tǒng)探索了土茯苓復方治療OSCC 的藥理學和分子作用機制，可為臨床應用提供參考。