秦嶺 閻海萍 尹小芳 楊超 栗穎利 李敏

[摘要]目的：探討脂肪干細(xì)胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）與放射損傷成纖維細(xì)胞（Fibroblast，F(xiàn)b）共培養(yǎng)后細(xì)胞因子表達(dá)的差異。方法：使用劑量8 Gy的X線放射源，對(duì)大鼠的成纖維細(xì)胞進(jìn)行單次照射，建立ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)模型。分別把未干預(yù)的成纖維細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照Fb1組，放射后成纖維細(xì)胞設(shè)為Fb2組，ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組設(shè)為Fb3組，利用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)各組差異表達(dá)的細(xì)胞因子，并通過Elisa檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果：研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fb2組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的表達(dá)水平低于Fb1組（P＜0.05），F(xiàn)b3組GM-CSF表達(dá)水平高于Fb2（P＜0.01）；Fb3組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)水平高于Fb2組（P＜0.05）；各組表皮細(xì)胞因子（Epidermal growth factor，EGF）和血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后多種生長(zhǎng)因子、黏附因子、趨化因子上調(diào)，部分炎性因子下調(diào)；ADSCs可能主要通過VEGF和GM-CSF促進(jìn)成纖維細(xì)胞放射損傷的修復(fù)。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；放射損傷；細(xì)胞因子；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

[中圖分類號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）07-0086-04

Differences in Cytokines Expression after Co-Culture of Adipose Stem Cells with Irradiated Fibroblasts

QIN Ling1，YAN Haiping2，YIN Xiaofang1，YANG Chao3，LI Yingli4，LI Min5

（1.The PLA 960th Hospital Graduate Training Base of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，Liaoning，China; 2.Jinan's Eleventh Leaving Cadre Recuperation Center of Shandong Provincial Military Region，Jinan 250013，Shandong，China; 3.Plastic Surgery of PLA Naval Medical Center，Shanghai 200433，China; 4.Department of Plastic Surgery，960th Hospital of PLA，Jinan 250000，Shandong，China; 5.Department of Nuclear Medicine， 960th Hospital of PLA，Jinan 250000，Shandong，China）

Abstract： Objective? To investigate the difference in cytokines expression after co-culture of ADSCs and radiation-damaged fibroblasts. Methods? An X-ray radiation source of 8 Gy was used to illuminate rat fibroblasts to establish a co-culture model of ADSCs and radiation-damaged fibroblasts. Unintervened fibroblasts were set as blank control Fb1，radiation damaged fibroblasts as Fb2， and ADSCs with radio-injured fibroblasts as Fb3. Differentially expressed cytokines were detected in each group using protein microarray， which were verified by Elisa. Results? The expression of granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF） in Fb2 group were lower than that in Fb1 group （P＜0.05），while the expression of GM-CSF in Fb3 group were higher than that in Fb2 group （P＜0.01）; Moreover，the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF） in Fb3 group were higher than that in Fb2 group （P＜0.05）. However， there was no significant difference in epidermal growth factor（EGF） and platelet derived growth factor（PDGF） content in each group. Conclusion? Some growth factors， adhesion factors， and chemokines were up-regulated while some inflammatory factors were down-regulated after co-culture of ADSCs with radiation-damaged fibroblasts. ADSCs may promote the repair of fibroblast radiation damage mainly through VEGF and GM-CSF.

Key words： adipose derived stem cells; fibroblast; radiation damage; cytokines; granulocyte-macrophage colony stimulating factor; vascular endothelial growth factor

皮膚作為放射損傷最常累及的器官，約90%的患者接受放射性治療后會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。目前常用的乳膏、皮瓣移植以及手術(shù)切除修復(fù)等治療方式的有效性仍缺乏證據(jù)[1]。Fb的遷移和增殖被認(rèn)為在很大程度上影響傷口收縮、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和組織的重建[2]。而大量成纖維細(xì)胞的放射損傷成為了放射性皮膚損傷難愈合的重要原因之一。但是單純使用成纖維細(xì)胞治療，可能會(huì)導(dǎo)致皮膚組織纖維化[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)ADSCs可以通過分泌細(xì)胞因子和黏附分子等物質(zhì)修復(fù)放射損傷后的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞[4，6]，并且脂肪來源干細(xì)胞對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞能夠發(fā)揮抗纖維化作用[7]。但是，目前尚不明確ADSCs主要通過哪些細(xì)胞因子來影響放射損傷后成纖維細(xì)胞的修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)組前期設(shè)計(jì)的ADSCs與放射損傷成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，通過蛋白芯片高通量篩查ADSCs可能通過哪些細(xì)胞因子促進(jìn)放射后成纖維細(xì)胞的修復(fù)，并進(jìn)行Elisa定量檢測(cè)來驗(yàn)證。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑：直線加速器（西門子，德國(guó)）；超凈工作臺(tái)（青島 海爾）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo scientific，美國(guó)）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；流式細(xì)胞儀（Mihenyi Biotec，德國(guó)）；GenePix 4000B芯片掃描儀（Axon，美國(guó)）；0.4μm細(xì)胞共培養(yǎng)皿（Corning，美國(guó)）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、膠原酶Ⅰ型、胰蛋白酶、Dispase酶（Gibco，美國(guó)）；戊巴比妥鈉（Signa，美國(guó)）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，上海）；RIPA裂解液（碧云天，上海）；酶標(biāo)儀（Thenno Scientific，美國(guó)）；Elisa檢測(cè)試劑盒（碧云天，上海）；CD29、CD44、 CD31、CD45抗體（Miltenyi Biotec，德國(guó)）；波形蛋白（Vimentin）抗體（CST，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取6～8周齡雄性SD大鼠10只，每只體重300～400 g，由長(zhǎng)海醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 大鼠ADSCs的提取、培養(yǎng)與鑒定：取10只SD大鼠脫頸處死，75%酒精浸泡10 min后，分離腹股溝脂肪，用1%雙抗PBS沖洗。在適量PBS中盡量剪碎脂肪后加入等體積膠原酶Ⅰ型，37℃、100 r/min搖床消化50 min。離心后棄上清，加入適量含胎牛血清（FBS）的DMEM終止消化，經(jīng)過75μm篩網(wǎng)過濾后離心，棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸后移至培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d換液一次。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合度后傳代用于表面CD分子鑒定及定向誘導(dǎo)分化，具體細(xì)胞驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)步驟參考課題組前期方法[8]。

1.4 大鼠成纖維細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定：取SD大鼠腹部皮膚，分離脂肪等其他組織后用PBS沖洗，加入Dispase酶消化過夜，溫度為4℃。分離真皮與表皮組織，盡量剪碎真皮組織后放入10 ml含0.25%胰酶DMEM培養(yǎng)皿中，于標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下培養(yǎng)箱孵育2 h。用75 μm篩網(wǎng)過濾組織液后離心棄上清，重懸后將所得細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移在配置好的培養(yǎng)液中（含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基）。每2 d換一次液，90%融合度后傳代，做Vimentin蛋白表達(dá)檢測(cè)[8]。

1.5 分組及蛋白質(zhì)提?。篎b1組為空白對(duì)照的成纖維細(xì)胞，F(xiàn)b2組為接受過8 Gy X線照射后的成纖維細(xì)胞，F(xiàn)b3組為照射后與ADSCs共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。待第3代ADSCs和真皮成纖維細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%后消化后計(jì)數(shù)。先準(zhǔn)備3塊6孔板，各組6孔板每孔接種1.5×105個(gè)Fb，加培養(yǎng)液后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。ADSCs以1.0×105個(gè)/孔的密度接種于共培養(yǎng)組Transwell 6孔板上室中，加培養(yǎng)液置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后換液，在常規(guī)6孔板每孔中加入2 ml培養(yǎng)液，Transwell 6孔板每個(gè)上室和下室中加1 ml培養(yǎng)液。Fb2組和Fb3組成纖維細(xì)胞利用直線加速器進(jìn)行X線照射，能量為6 MV，距離100 cm，劑量8 Gy。照射完成后立即將接種ADSCs 的Transwell 6孔板上室放入Fb3組下室中，所有6孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。48 h后收集各組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清離心后加入蛋白裂解液提取總蛋白[9]。

1.6 細(xì)胞因子蛋白芯片檢測(cè)：取各組含總蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，分別為Fb1組蛋白、Fb2組蛋白和Fb3組蛋白。每組總蛋白液以13 200 rpm離心15 min后，取每組上清400μl于500 ml 1×PBS透析液中，4℃搖床過夜。次日以10 000 rpm離心5 min。BCA法蛋白定量，加入Labeling reagent tube（Item B），室溫震蕩30 min，每5 min輕搖一次。所有樣品加入3μl Stop Solution混勻。參照Raybiotech公司提供的蛋白芯片檢測(cè)流程以及試劑盒進(jìn)行操作，取透析后樣品200μl，加入Blocking Buffer至終體積400μl后進(jìn)行芯片檢測(cè)。芯片干燥后，于4℃封閉，每孔加入800μl Blocking Buffer，除去Blocking Buffer后按照步驟芯片經(jīng)過1×Wash BufferⅠ和1×Wash BufferⅡ洗滌后，1 000 rpm離心后甩干，上Axon GenePix 4000B芯片掃描儀。

1.7 ELISA檢測(cè)：取上述Fb1、Fb2和Fb3組含蛋白上清，利用ELISA檢測(cè)驗(yàn)證并定量蛋白質(zhì)芯片初篩的結(jié)果。操作具體過程按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書以及相關(guān)參考文獻(xiàn)[9]。每次檢測(cè)均為3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：細(xì)胞因子蛋白芯片檢測(cè)和Elisa檢測(cè)等數(shù)據(jù)匯總Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)值。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后所得數(shù)據(jù)用（x ?±s）表示。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0軟件分析，采用多組單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GraphPad Prism 6.0制作圖表。

2? 結(jié)果

2.1 ADSCs與大鼠成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定：ADSCs 2 d后貼壁，逐漸由多角形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形。流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表面標(biāo)記結(jié)果顯示CD29、CD44高表達(dá)，而CD45、CD31低表達(dá)。經(jīng)過成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)的ADSCs胞漿內(nèi)可見脂滴，油紅O染色后脂滴變?yōu)榧t色。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后ADSCs由梭形變成多角形，顯微鏡下可觀察到鈣鹽結(jié)晶沉積及礦化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶及茜素紅染色陽性。成纖維細(xì)胞亦呈梭形或多角形，免疫細(xì)胞化學(xué)染色后波形蛋白高表達(dá)[10]。

2.2 蛋白質(zhì)芯片結(jié)果：蛋白芯片結(jié)果顯示，相比于Fb1組，F(xiàn)b2組中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮細(xì)胞因子（Epidermal growth factor，EGF）和血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）等大部分細(xì)胞因子下調(diào)。Fb3組比Fb2組上調(diào)的細(xì)胞因子包括酪氨酸激酶受體-2（Tyrosine kinase receptor-2，TIE-2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、金屬蛋白酶組織抑制物-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、分泌型磷蛋白1（Secretory phosphoprotein-1，SPP1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（Neurotrophic factor receptor，NGFR）、GM-CSF、L選擇素（CD62L）、VEGF、CD80、EGF、PDGF等；下調(diào)的細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配（Tumor necrosis factor-associated apoptosis-inducing ligand，TRAIL）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-3（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-3，TIMP-3）、β神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Beta nerve growth factor，β-NGF）、IL-3、CD54、IL-12、IL-4、IL-10等，見圖1。通過對(duì)比各組差異細(xì)胞因子含量發(fā)現(xiàn)在成纖維細(xì)胞放射損傷后下調(diào)，經(jīng)過ADSCs共培養(yǎng)后上調(diào)的細(xì)胞因子排名靠前為GM-CSF、VEGF、EGF和PDGF。

2.3 Elisa結(jié)果：由于采用半定量蛋白芯片檢測(cè)細(xì)胞因子，所以利用Elisa檢測(cè)對(duì)排名靠前幾個(gè)細(xì)胞因子進(jìn)行定量驗(yàn)證。Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示Fb2組GM-CSF表達(dá)量較Fb1組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)b3組GM-CSF表達(dá)量較Fb2組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Fb3組VEGF表達(dá)量較Fb2組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EGF和PDGF含量非常少，且各組間含量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

3? 討論

隨著患者不斷增長(zhǎng)的放療需求，脂肪干細(xì)胞的移植成為放射性皮膚損傷治療的一種非常有前景的方法。雖然大量研究已經(jīng)證實(shí)ADSCs能夠通過旁分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖以及皮膚創(chuàng)面的愈合[11-12]。但在放射性皮膚損傷中ADSCs通過哪些細(xì)胞因子參與修復(fù)仍需要進(jìn)一步探究。

課題組在前期證實(shí)ADSCs能夠促進(jìn)放射損傷的成纖維細(xì)胞修復(fù)的基礎(chǔ)上[10]，利用共培養(yǎng)皿上室的聚碳酸酯膜可以通過細(xì)胞因子的特點(diǎn)，對(duì)Fb1組、Fb2組和Fb3組細(xì)胞因子進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)和Elisa檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在接受照射后幾乎所有細(xì)胞因子的表達(dá)下降，而ADSCs干預(yù)的Fb3組較Fb2組中多種生長(zhǎng)因子、趨化因子、黏附因子上調(diào)，部分炎性因子下調(diào)。其中在放射損傷組下調(diào)而在ADSCs干預(yù)的Fb3組上調(diào)的細(xì)胞因子排名靠前的是GM-CSF、VEGF、EGF和PDGF。這與多項(xiàng)ADSCs治療放射性傷口的研究中發(fā)現(xiàn)的VEGF表達(dá)上調(diào)[14-16]和炎癥反應(yīng)減輕一致[13-14]?？壳暗倪@些細(xì)胞因子里差異含量較明顯是GM-CSF和VEGF，而EGF和PDGF含量相對(duì)較少，與各組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示ADSCs可能是主要通過VEGF和GM-CSF干預(yù)放射損傷后成纖維細(xì)胞的修復(fù)。

綜上所述，本研究預(yù)測(cè)了ADSCs修復(fù)放射損傷成纖維細(xì)胞前后差異細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs可能主要通過VEGF和GM-CSF干預(yù)放射損傷后成纖維細(xì)胞的修復(fù)。但本研究只檢測(cè)一部分常見的細(xì)胞因子，ADSCs還可能通過其他細(xì)胞因子或外泌體等介質(zhì)參與放射損傷成纖維細(xì)胞的修復(fù)。另外，實(shí)驗(yàn)組前期發(fā)現(xiàn)在ADSCs修復(fù)放射損傷成纖維細(xì)胞后信號(hào)通路主要富集在PI3K/AKT與MAPK上[9]。這與Liu等[17]利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠放射性皮膚潰瘍后創(chuàng)面VEGF表達(dá)上調(diào)和PI3K/AKT信號(hào)通路的激活相同。所以這將為我們驗(yàn)證GM-CSF與VEGF和PI3K/Akt與MAPK通路在ADSCs修復(fù)放射損傷成纖維細(xì)胞過程中的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2022-04-20

本文引用格式：秦嶺，閻海萍，尹小芳，等.脂肪干細(xì)胞與放射損傷成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞因子表達(dá)的差異[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2023，32（7）：86-89.