李鑫，代民言，寧星，苗利，王明志

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150010）

鹽酸去氧腎上腺素可緩解感冒、減輕鼻炎導(dǎo)致的鼻塞[1-3]；馬來(lái)酸氯苯那敏用于治療過(guò)敏性鼻炎、打噴嚏等感冒癥狀[4-6]；氫溴酸右美沙芬對(duì)于延髓中樞產(chǎn)生的咳嗽有一定抑制作用,且沒(méi)有成癮性[7-11]。鎮(zhèn)咳口服液是由上述3 種成分復(fù)配制成,不僅可以治療感冒、冷空氣過(guò)敏、支氣管炎等疾病引起的兒童咳嗽及鼻塞的癥狀,同時(shí)可以減少馬來(lái)酸氯苯那敏單獨(dú)使用時(shí)口渴、多尿、咽喉疼痛等的不良反應(yīng),提高兒童用藥的安全性和順應(yīng)性。

現(xiàn)有報(bào)道中只有采用高效液相法測(cè)定鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬單一主成分或兩種主成分的方法[12-15],尚無(wú)同時(shí)測(cè)定3種成分含量的方法,若使用上述方法分別對(duì)鎮(zhèn)咳口服液中3種成分進(jìn)行含量測(cè)定,則操作繁瑣,效率低下。

筆者建立了同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定鎮(zhèn)咳口服液中三種主藥成分含量的方法,該方法操作簡(jiǎn)便、快速,專屬性強(qiáng),準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC20A 型,日本島津儀器有限公司。

電子天平：ALC-110.4 型,感量為0.1 mg,賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

鹽酸去氧腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

馬來(lái)酸氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

氫溴酸右美沙芬標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.8%,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

辛烷磺酸鈉、甲醇：均為色譜純,天津益仁達(dá)化學(xué)試劑廠。

磷酸二氫鈉：色譜純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

鎮(zhèn)咳口服液樣品：批號(hào)20190701、20190702、20190703,自制。

緩沖鹽溶液：稱取磷酸二氫鉀1.25 g,辛烷磺酸鈉2.5 g,置于1 000 mL容量瓶中,加水定容至標(biāo)線,pH值為3.0。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：ACE Excel super C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm,英國(guó)ACE 公司)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流動(dòng)相：A為緩沖鹽溶液-甲醇（體積比為92∶8）,B 為緩沖鹽溶液-甲醇（體積比為12∶88）,流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫,0～8 min,90%～45% A；8～14 min,45%～32% A；14～20 min,32%～56% A；20～21min,56%～90% A。

1.3 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬質(zhì)量濃度分別為0.2、0.08、0.4 mg/mL。精密稱取馬來(lái)酸氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于10 mL 容量瓶中,用流動(dòng)相A 定容至標(biāo)線,得到馬來(lái)酸氯苯那敏儲(chǔ)備液；稱取鹽酸去氧腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg、氫溴酸右美沙芬標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,精密稱定,加入流動(dòng)相A溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,再加入4 mL馬來(lái)酸氯苯那敏儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相A定容至標(biāo)線。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2、2.25、2.5、2.75、3 mL于10 mL容量瓶中,用流動(dòng)相A 定容至標(biāo)線,分別得到對(duì)應(yīng)于鎮(zhèn)咳口服液處方含量的80%、90%、100%、110%、120%線性樣品濃度。

樣品溶液：用移液管吸1 mL 鎮(zhèn)咳口服液于10 mL 容量瓶中,用流動(dòng)相A 定容至10 mL,以3 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液,用0.22 μm 濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液作為樣品溶液。

陰性樣品溶液：參照鎮(zhèn)咳口服液配方比例和制備工藝,制備不添加3種主成分的陰性樣品。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品溶液,按照1.2色譜條件下分析,繪制鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算得線性方程,利用線性方程計(jì)算鎮(zhèn)咳口服液中三種成分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在190～400 nm區(qū)間進(jìn)行掃描,選擇有較大吸收的波長(zhǎng)220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。分別考察ACE Excel super C18色譜柱、迪馬Diamonsil Plus C18色譜柱,結(jié)果表明,同等條件下,ACE Excel super C18型色譜柱分離度最佳,色譜峰寬更小,對(duì)稱性更好,因此選擇ACE Excel super C18型色譜柱為分離柱。

分別考察磷酸二氫鈉溶液-甲醇、磷酸二氫鈉溶液-乙腈作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明,選擇磷酸二氫鈉溶液-甲醇作為流動(dòng)相時(shí),色譜峰形對(duì)稱,基線平穩(wěn)。故選擇磷酸二氫鈉溶液-甲醇作為流動(dòng)相。

分別考察戊烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑時(shí)的分離效果。結(jié)果表明離子對(duì)試劑烷基鏈越長(zhǎng),分離度改善明顯,因此選擇辛烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑。隨著離子對(duì)試劑濃度的升高,色譜峰形對(duì)稱性越好,當(dāng)辛烷磺酸鈉質(zhì)量濃度高于2.5 g/L 時(shí),分離度合適,色譜峰形理想。同時(shí)考慮到離子對(duì)試劑濃度過(guò)大時(shí),會(huì)縮短色譜柱的使用壽命,故最終選擇2.5 g/L 辛烷磺酸鈉溶液,可使各主成分的色譜峰分離效果最佳,互不干擾。

以緩沖鹽溶液-甲醇作為流動(dòng)相并考察兩組分配比對(duì)色譜分離效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)增大時(shí),色譜保留時(shí)間縮短；甲醇的體積分?jǐn)?shù)減少時(shí),保留時(shí)間延長(zhǎng)。因鎮(zhèn)咳口服液中成分復(fù)雜,為實(shí)現(xiàn)更好的分離效果,流動(dòng)相的組成會(huì)逐漸改變,使得多種成分在更廣泛的條件下被洗脫,故采用梯度洗脫,提高分離效率與檢測(cè)靈敏度。

調(diào)整流動(dòng)相pH分別為2.0、3.0、4.0,考察流動(dòng)相pH 值對(duì)色譜分離效果的影響。發(fā)現(xiàn)隨著pH 值降低,色譜保留時(shí)間延長(zhǎng),基線分離良好,同時(shí)色譜峰形尖銳、對(duì)稱,考慮分離度、色譜柱耐受性、保留時(shí)間等因素,故最終選擇流動(dòng)相pH值為3.0。

2.2 方法專屬性

取空白溶劑（流動(dòng)相A）、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、陰性樣品溶液、樣品溶液注入液相色譜儀,記錄相應(yīng)色譜圖,各色譜圖分別見(jiàn)圖1～圖4。結(jié)果表明,各輔料峰對(duì)主藥成分色譜峰無(wú)干擾,鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬各峰分離度較好。

圖1 空白溶劑色譜圖

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

圖3 陰性樣品溶液色譜圖

圖4 樣品溶液色譜圖

2.3 線性關(guān)系

在1.2色譜條件下測(cè)定系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,記錄色譜圖。以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得鹽酸去氧腎上腺素線性方程為y=4 957.8x+2 771.8,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9；馬來(lái)酸氯苯那敏線性方程為y=5 325.9x–193.6,相關(guān)系數(shù)r=0.999 7；氫溴酸右美沙芬線性方程y=2 168.2x+1 346.1,相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。結(jié)果表明鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬的線性范圍分別為38.876～64.793 μg/mL、16.256～24.384 μg/mL、76.723～127.872 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

同法制備6份樣品,取樣品溶液測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知,鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬含量測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%,表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液,分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、14、18 h,進(jìn)樣10 μL,在1.2 色譜條件下測(cè)定色譜峰面積,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明樣品溶液中鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.04%、0.17%、0.08%,表明室溫條件下,樣品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取陰性樣品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,分別加入4、5、6 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用流動(dòng)相A 定容,即得相對(duì)鎮(zhèn)咳口服液處方含量80%、100%、120%的加標(biāo)樣品,同法配制3 份,取續(xù)濾液測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3數(shù)據(jù)可知,測(cè)得的各點(diǎn)回收率為98.65%～99.65%,表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 比對(duì)試驗(yàn)

分別采用文獻(xiàn)[12]方法檢測(cè)鹽酸去氧腎上腺素含量（下稱“對(duì)照方法1”）,文獻(xiàn)[14]方法檢測(cè)氫溴酸右美沙芬、馬來(lái)酸氯苯那敏含量（下稱“對(duì)照方法2”）,所建方法同時(shí)檢測(cè)3 種成分含量,對(duì)三批制劑進(jìn)行對(duì)比分析,平行測(cè)定6 次,取平均值,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同方法鎮(zhèn)咳口服液樣品測(cè)定結(jié)果

采用t檢驗(yàn)法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,表明本方法與對(duì)照方法1、2檢測(cè)結(jié)果都無(wú)顯著性差異。但兩種對(duì)照方法需要不同色譜條件,檢測(cè)步驟比較繁瑣；本方法可在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定3 種成分含量,操作簡(jiǎn)便。

3 結(jié)語(yǔ)

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定鎮(zhèn)咳口服液中鹽酸去氧腎上腺素、馬來(lái)酸氯苯那敏、氫溴酸右美沙芬,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法精密度好,專屬性強(qiáng),靈敏度高,具有良好的線性關(guān)系,為國(guó)內(nèi)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了有價(jià)值的參考。