寧霄，金紹明，劉彤彤，趙梅，曹進(jìn)

（中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050）

維生素A、D、E（VA、VD、VE）均屬于脂溶性維生素。這三種維生素對(duì)人體均有重要的作用,一但缺乏將導(dǎo)致一些疾病如夜盲、骨質(zhì)疏松、易感染癌癥等[1]。另一方面,該類脂溶性維生素不易通過(guò)尿液排出體外,容易在體內(nèi)大量蓄積,因此VA,VD,VE攝入過(guò)量時(shí),可能引起皮膚、骨骼、腦、肝等多種臟器組織病變,對(duì)人體健康造成巨大影響[2]。由于嬰兒食物來(lái)源單一,相關(guān)維生素在乳粉中的含量直接影響嬰幼兒健康。GB10765—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》及GB10767—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 較大嬰兒和幼兒配方食品》中均嚴(yán)格限定了這3種維生素的含量范圍[3-4]。

嬰兒配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜,牛乳、脫鹽乳清粉、乳清蛋白粉等牛乳分離提取物為主要蛋白原料,復(fù)配植物油和乳糖,是脂肪、碳水化合物的原料來(lái)源,形成了嬰兒配方乳粉的主體原料,同時(shí)強(qiáng)化維生素、礦物質(zhì)等一定量的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[5]。產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中存在分布不均的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí),其穩(wěn)定性受環(huán)境影響較大。據(jù)宇盛好等統(tǒng)計(jì)的2015～2020 年全國(guó)抽檢嬰幼兒配方乳粉結(jié)果[6],這三種維生素指標(biāo)不合格是存在的主要問(wèn)題之一,因此,準(zhǔn)確測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中VA,VD和VE的含量尤為重要。

為監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室對(duì)三種維生素的檢測(cè)能力,保證檢測(cè)結(jié)果有效可靠,且具有溯源性、可比性和準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)室研制了嬰兒配方乳粉中VA,VD和VE含量分析混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用固相萃取法取代國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7]中的有機(jī)溶劑萃取法,并使用二維液相色譜法對(duì)目標(biāo)溶液進(jìn)行分析,省去正相制備步驟,簡(jiǎn)化樣品處理流程,實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣同時(shí)完成VA,VD和VE含量的測(cè)定,可以滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的要求。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三種組分分析方法的同步確認(rèn)、過(guò)程質(zhì)量控制及分析儀器校準(zhǔn)等工作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：U3000 型雙三元液相色譜(2DLC)系統(tǒng),配有DAD 檢測(cè)器,美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

電子天平：XPE205 型,感量為 0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多公司。

維生素專用固相萃取柱：TUP-E76-2060 型,天津誠(chéng)軸生物科技有限公司。

VA（視黃醇）對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）不小于98.7%,相對(duì)擴(kuò)展不確定度為 1.77%（k=2）,美國(guó)西格瑪公司。

VD3對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）不小于99.8%,相對(duì)擴(kuò)展不確定度為 0.3%（k=2）,德國(guó)DR.E公司。

VE(D-α-生育酚) 對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）不小于98.2%,相對(duì)擴(kuò)展不確定度為 2.0%（k=2）,德國(guó)DR.E公司。

無(wú)水乙醇、乙腈、甲醇：色譜純,德國(guó)默克公司。

1.2 樣品制備

向乳粉企業(yè)采購(gòu)分裝前的成品乳粉（生產(chǎn)工藝為濕法噴霧制備,已定量加入維生素A、D、E）,混勻,包裝。最終用棕色玻璃瓶帶硅膠墊塑料蓋包裝,鋁塑袋真空密封,共制備300 瓶,每瓶?jī)艉坎簧儆?0 g,保存條件：溫度為（25±2）℃,相對(duì)濕度為（60±10）%。

1.3 VA、VD和VE含量測(cè)定方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

精密稱取嬰兒配方乳粉5 g 于250 mL 錐形瓶中,加入20 mL 溫水（50 ℃）溶解后,加入抗壞血酸1.0 g,BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）0.1 g,無(wú)水乙醇50 mL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的KOH 溶液15 mL,在65 ℃水浴中震蕩皂化50 min。將上述皂化液冷卻,用水-乙醇(體積比為1∶1)混合液轉(zhuǎn)移定容至100 mL,搖勻,以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min,取20 mL上清液,轉(zhuǎn)移至TUP-E76-2060固相萃取柱（20 g/60 mL）中,用100 mL正己烷(含BHT,BHT的質(zhì)量濃度為 50 mg/L)以約5 mL/min的流量洗脫,將洗脫液收集至旋蒸瓶中,使用旋蒸儀于40 ℃旋蒸至約2 mL,將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中,用氮?dú)獯蹈珊鬁?zhǔn)確加入2 mL 甲醇復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,作為樣品溶液。

1.3.2 定量方法

所制備的乳粉中混合維生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中VA、VD和VE含量采用液相色譜法測(cè)定。流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水；將2D-LC系統(tǒng)的右泵作為一維分析泵,以賽默飛FOODKIT1 ADE-C18色譜柱(150 mm×3.0 mm,3 μm)為一維分析柱,流量為0.5 mL/min；將2D-LC系統(tǒng)的左泵作為二維分析泵,以賽默飛FOCDKIT1& 2ADE-C18色譜柱(100 mm ×4.6 mm,2.6 μm)為二維分析柱,流量為0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為264 nm(VD)、296 nm(VE)和325 nm(VA)；進(jìn)樣體積為20 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4 均勻性和穩(wěn)定性檢查

根據(jù)CNAS—GL 03：《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和評(píng)價(jià)指南》中關(guān)于均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)的要求進(jìn)行試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析[8]。

1.4.1 均勻性檢查

隨機(jī)抽取15份樣品進(jìn)行均勻性測(cè)定,每份樣品做 2 次獨(dú)立平行測(cè)定,對(duì)處理得到的待測(cè)液按隨機(jī)順序進(jìn)樣,采用單因素方差分析和F檢驗(yàn)對(duì)樣品的均勻性進(jìn)行考察,當(dāng)測(cè)定結(jié)果的F值小于Fα（γ1,γ2）時(shí),認(rèn)為樣品為充分均勻的。

1.4.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

按照先密后疏的原則設(shè)置不同的采樣時(shí)間點(diǎn),采用同步穩(wěn)定性評(píng)估方法進(jìn)行穩(wěn)定性分析。實(shí)驗(yàn)溫度選擇(25±2)℃,相對(duì)濕度選擇為(60±10)%,進(jìn)行儲(chǔ)存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將樣品分別在上述條件下存放,于1、3、6、12個(gè)月后分別抽取3份樣品, 每份樣品檢測(cè)2次。以均勻性檢測(cè)結(jié)果為長(zhǎng)期穩(wěn)定性0 點(diǎn),采用回歸分析評(píng)定樣品的穩(wěn)定性。

1.5 定值

參 考 JJF 1343—2012[9]和ISO GUIDE 35:2017[10],采用同一方法多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方式,穩(wěn)健的統(tǒng)計(jì)方法定值。選擇8 家行業(yè)領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)豐富且經(jīng)國(guó)家認(rèn)證的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)中心,分別向每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室提供樣品5 份,每個(gè)樣品分別平行測(cè)定 2 組數(shù)據(jù)。各定值機(jī)構(gòu)提供 10 組測(cè)量數(shù)據(jù)?；厥斩ㄖ禉z測(cè)結(jié)果后,對(duì)每一組獨(dú)立測(cè)量結(jié)果采用格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)進(jìn)行離群值檢驗(yàn),采用狄克森（Dixon）檢驗(yàn)對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行離群值檢驗(yàn)。剔除離群值后,采用 Kolmogorov-Smirnor（KS）檢驗(yàn)對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。在符合正態(tài)分布的情況下,計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果中位值的中位值,該總體中位值即樣品的定值結(jié)果,同時(shí)進(jìn)行定值的不確定度評(píng)定并給出最終結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 定量分析條件的優(yōu)化

由于VA和VE光敏性較強(qiáng),遇光極易分解,因此嬰兒配方乳粉制備工藝中需要通過(guò)乙酸酯化并微膠囊化處理,從而減少這三種類脂溶性維生素在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中的流失。在定量分析中,樣品需經(jīng)過(guò)皂化處理,才能將VA、VD、VE溶解出來(lái)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[11]采用有機(jī)溶劑萃取法進(jìn)一步凈化皂化液,由于該方法易出現(xiàn)兩相界面乳化現(xiàn)象,導(dǎo)致目標(biāo)組分在從皂化液轉(zhuǎn)移到萃取液的過(guò)程中產(chǎn)生損失,且光敏性強(qiáng)的目標(biāo)組分在萃取液濃縮過(guò)程中極易見光分解,從而該方法回收率較低[12-16]。筆者采用固相萃取柱凈化皂化液,減少了復(fù)雜操作導(dǎo)致的目標(biāo)組分損失?？紤]到乳粉中VD含量低,為實(shí)現(xiàn)與VA、VE的同步檢測(cè),需通過(guò)大容量的固相萃取柱富集。通過(guò)對(duì)比,最終選擇規(guī)格為20 g/60 mL 的TUP-E76-2060 維生素專用固相萃取柱。該固相萃取柱采用特殊工藝處理的硅藻土填充而成,具有最大的比表面積和均衡的表面活性,可給樣品提供一個(gè)理想的液液分配支撐表面。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明,樣品快速通過(guò)親水材料篩板后,水和無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)被保留,弱極性物質(zhì)被正己烷洗脫下來(lái)。

2.2 樣品的均勻性和穩(wěn)定性考察

2.2.1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

按1.4.1進(jìn)行均勻性檢測(cè),采用單因素方差分析方法對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。三種維生素含量測(cè)定結(jié)果列于表2（“組內(nèi)1”“組內(nèi)2”表示兩個(gè)平行操作樣品）,F檢驗(yàn)分析結(jié)果列于表3。結(jié)果顯示：樣品的F計(jì)算值小于F臨界值,表明樣品均勻性良好。

表2 嬰兒乳粉樣品中三種維生素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

表3 嬰兒乳粉樣品中三種維生素含量測(cè)定方差分析結(jié)果

2.2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

按1.4.2 進(jìn)行穩(wěn)定性考察,結(jié)果見表4。對(duì)表4檢測(cè)結(jié)果以時(shí)間-質(zhì)量分?jǐn)?shù)做線性擬合,并進(jìn)行回歸方差分析,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,在95%的置信水平下,斜率的P>0.05,說(shuō)明樣品在考察期限內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性檢測(cè)回歸方差分析結(jié)果

2.3 定值結(jié)果及離群值檢驗(yàn)

按照1.5 方法發(fā)放協(xié)作定值樣品,統(tǒng)一采用1.3定量方法,聯(lián)合8 家行業(yè)領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)豐富且經(jīng)國(guó)家認(rèn)證的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值,實(shí)驗(yàn)室分別編號(hào)為A～H,各協(xié)作單位定值檢測(cè)結(jié)果見表6。采用格拉布斯(Grubb’s) 檢驗(yàn),對(duì) 8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行離群值檢驗(yàn)。采用狄克森(Dixon) 檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在95% 的置信水平,均無(wú)離群值。計(jì)算各協(xié)作定值單位結(jié)果的中位值,并對(duì)各協(xié)作定值單位中位值結(jié)果做二次中位值計(jì)算,作為指定值。最終VA、VD和VE含量定值結(jié)果分別為4 987 μg/kg、104 μg/kg和90 mg/kg。

表6 嬰兒配方乳粉中三種維生素協(xié)作定值結(jié)果

2.4 定值不確定度的評(píng)定

2.4.1 樣品協(xié)作定值引入的不確定度

計(jì)算各協(xié)作定值單位結(jié)果的中位值,記為Ni。以這些中位值的中位值作為指定值,記為X。計(jì)算N1,N2…Ni與X之差的絕對(duì)值,記為Qi。Q1,Q2…Qi的中位值記為Qˉ。各定值實(shí)驗(yàn)室結(jié)果及統(tǒng)計(jì)見表6。協(xié)作定值的不確定度按式(1)計(jì)算,結(jié)果見表6。

式中：uD——協(xié)作定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

n——協(xié)作標(biāo)定的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量；

sQˉ——正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差,sQˉ=Qˉ/0.674。

協(xié)作定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(2)計(jì)算,結(jié)果見表8。

式中：uD,rel——協(xié)作定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

X——各實(shí)驗(yàn)室報(bào)告值的中位值。

2.4.2 樣品均勻性引入的不確定度

均勻性引入的不確定度及相對(duì)不確定度分別按式(3)、式(4)計(jì)算,結(jié)果見表7。

表7 定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算結(jié)果

式中：ubb——均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

n——每份樣品平行測(cè)定的次數(shù)；

ems-in——組內(nèi)的均方差；

vin——組內(nèi)自由度。

式中：ubb,rel——均勻性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

m——均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。

2.4.3 樣品穩(wěn)定性引入的不確定度

將樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果按時(shí)間–質(zhì)量分?jǐn)?shù)做線性擬合,所得擬合直線的殘差為斜率不確定度,如式(5)。按式(6)、式(7)分別計(jì)算樣品穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,結(jié)果見表7。

式中：s(b1)——斜率b1的不確定度；

sˉ——回歸直線殘留平均標(biāo)準(zhǔn)偏差。

式中：ults——樣品穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

s(b1)——樣品穩(wěn)定性考察直線擬合斜率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

t——樣品的有效期（穩(wěn)定性考察期）。

式中：ults,rel——樣品穩(wěn)定性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;

m——所有穩(wěn)定性檢驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的平均值。

2.4.4 合成不確定度

以定值、均勻性、穩(wěn)定性引入的不確定度分量合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,按式(8)計(jì)算。按式(9)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度,結(jié)果見表7。

按95%的置信區(qū)間,取k=2,按式(10)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度,VA、VD和VE結(jié)果分別為3.10、1.59和1.30。

式中：uCRM——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

UCRM——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度；

k——包含因子。

2.5 嬰兒配方乳粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果

經(jīng)過(guò)均勻性檢驗(yàn),12 個(gè)月內(nèi)的3 個(gè)月次的穩(wěn)定性檢驗(yàn)和8 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值,最終確定嬰兒配方乳粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中VA、VD和VE含量定值結(jié)果及其擴(kuò)展 不 確 定 度(k=2) 分 別 為(4987±3.1) μg/kg、(104±1.59) μg/kg和(90±1.3) mg/kg。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)優(yōu)化樣品處理及檢測(cè)方法,建立了嬰兒配方乳粉中VA、VD和VE含量同步分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的二維液相色譜定值方法,該方法利用固相萃取方式,省去了有機(jī)溶劑液液萃取的繁雜步驟,實(shí)現(xiàn)了三種脂溶性維生素的同步檢測(cè),在提升方法的準(zhǔn)確率及靈敏度的基礎(chǔ)上,提高了效率,適用于大批量樣品的同時(shí)測(cè)定。用此法檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性,均滿足要求；且多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值方式,也再次驗(yàn)證該方法具備重現(xiàn)性、可靠性和準(zhǔn)確性。通過(guò)該方法制備的嬰兒配方乳粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于日常食品質(zhì)量控制、檢測(cè)方法的開發(fā)及實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證等領(lǐng)域,也為其他基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備提供了參考。