劉佐忠，黃黎黎

（重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院，重慶 402160）

骨質(zhì)疏松癥目前已經(jīng)成為全球最為常見的老年性疾病之一，而骨質(zhì)疏松壓縮性骨折為骨質(zhì)疏松患者最為嚴重的癥狀，可致嚴重疼痛及重度傷殘，甚至死亡。目前，如何預防骨質(zhì)疏松癥患者骨折后再次骨折成為醫(yī)學界新的研究方向。目前，特立帕肽是唯一具有促進成骨作用的抗骨質(zhì)疏松藥物，其有效成分為甲狀旁腺激素（1-34）（Parathyroid Hormone1-34，PTH 1-34）。本研究將特立帕肽（PTH 1-34）與具有緩釋特點的聚乳酸-乙醇酸（Poly-Lactic-Co-Glycolic Acid，PLGA）及具有良好機械性能的磷酸鈣骨水泥（Calciu m Phosphate Cement，CPC）復合構建成復合組織工程骨，觀察復合組織工程骨的微粒結構和生物相容性，為下一步驗證體內(nèi)注射CPC后持續(xù)藥物緩慢釋放達到抗骨質(zhì)疏松及促進成骨的效果奠定理論基礎。

一、材料與方法

（一）材料

可注射磷酸鈣骨水泥（20g/盒）購置于上海瑞邦生物材料有限公司。聚乳酸-乙醇酸購于美國威爾明頓的Alkermes公司（乙酸/乙醇酸：50：50，分子量：28 000）。特立帕肽注射液（重組人甲狀旁腺激素1-34，分子量：4 177）購于美國禮來制藥公司。聚乙烯醇（PVA）（88mol% 水解，MW=25 000）購于 Polyscience公司。掃描電子顯微鏡（SEM）（型號S800；日本東京日立）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、牛血清白蛋白（BSA）來自Sigma公司。二氯甲烷來自Aldrich Chemical公司。

（二）方法

1.載特立帕肽聚乳酸乙醇酸微粒的制備

筆者采用復乳溶劑蒸發(fā)法制作載PTH（1-34）的聚乳酸乙醇酸微粒，將100ul BSA（3% w/v）溶液或PTH緩沖溶液（0.1% BSA溶液中）在10%二氯甲烷聚合物溶液（DCM）中乳化，乳化時間約20 s，形成一次油包水（w/o）乳液。在快速攪拌的作用下，筆者將w/o乳液逐漸加入250ml PVA水溶液中，形成水包油水（w/o/w）雙重乳劑。隨后，筆者將水包油水（w/o/w）雙重乳劑在室溫下高速攪拌3小時，使二氯甲烷蒸發(fā)，然后離心收集固體微球。合成的微球用蒸餾水洗滌三次，然后冷凍干燥。

2.微球的材料學特性

將微球樣品鍍金后，筆者分別取載PTH（1-34）的聚乳酸微球（PTH-PLGA）和聚乳酸乙醇酸微球，使用掃描電子顯微鏡（SEM）（日立S3200，東京，日本）檢查微球的微觀形態(tài)，計算粒徑的大小和分布。

3.微球的載藥率及緩釋規(guī)律

筆者將PTH-PLGA微球及單純的PLGA微球與乙腈充分混合達24h，再用PBS緩釋液稀釋至10ug/ml，使用酶標儀在250nm波長下測定溶液中PTH的吸光度值。筆者將加載有PTH-PTH的微球及單穿PLGA的微球分別浸泡于10ml的PBS緩沖鹽溶液中，37℃恒溫水浴持續(xù)震蕩，分別于1d、3d、5d、7d、9d、11d、14d、21d、28d取其上清液。筆者使用波長為250nm的酶標儀測定吸光度值，繪制緩釋曲線。

4.載PTH-PLGA的磷酸鈣復合組織工程骨的制備

注射用磷酸鈣骨水泥的成分包括固相的粉末和液相的固化液。筆者分別將PTH-PLGA微球，PLGA微球及磷酸鈣固相粉末、固化液在室溫下充分攪拌混合2min，然后將混合物置于直徑為5mm、長度為8mm的圓柱形模具中。待復合物充分凝固干燥后，筆者將其冷凍備用，從而制備出載甲狀旁腺激素（1-34）的聚乳酸-乙醇酸磷酸鈣復合組織工程骨（PTH-PLGA-CPC）。

5.組織工程骨的孔徑、孔隙率及力學性能

筆者將PTH-PLGA-CPC組織工程骨及PLGA-CPC組織工程骨置于蒸餾水中，其空隙率測算的公式為：（M2-M0）/（M2-M1）×100%。其中，M0為工程骨的干重，M1為懸浮濕重，M2為飽和濕重。筆者將PTHPLGA-CPC復合物及PLGA-CPC復合物充分浸泡于二氯甲烷中以溶解PLGA，然后固定、脫水及醋酸異戊酯置換，在真空環(huán)境中進行干燥，并在表面噴金。筆者利用掃描電鏡觀察顯微結構，計算孔徑大小及孔隙率。筆者隨機選取PTH-PLGA-CPC及PLGA-CPC復合物各10份，在電子萬能試驗機上測試力學性能。

6.組織工程骨生物相容性及成骨活性

筆者采用PerColl密度分離法分離、培養(yǎng)和純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞，取活力良好的3-5代干細胞接種于載PTH-PLGA-CPC組織工程骨表面及空白培養(yǎng)孔，于37℃、5%CO2和95%濕度條件下培養(yǎng)，2～3日更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)5d后，筆者利用掃描電鏡觀察復合組織工程骨與空白組表面細胞形態(tài)，將細胞以4×104密度分別接種于PTH-PLGA-CPC培養(yǎng)板、PLGA-CPC培養(yǎng)板及空白培養(yǎng)板。在4h、8h及12h后，筆者用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）來測定細胞在復合組織工程骨表面的粘附及增殖情況。筆者將細胞以4×104密度分別接種于PTH-PLGA-CPC培養(yǎng)板、PLGA-CPC培養(yǎng)板及空白培養(yǎng)板后，2～3d更換一次培養(yǎng)基，于7d及14d時，使用對硝基苯磷酸酯二鈉試劑檢測細胞堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性。

二、結果

（一）載PTH-PLGA 微球的材料學特性

制備出的PTH-PLGA及PLGA微球外觀呈光滑平整、微孔狀結構。單純PLGA微球的粒徑分布均值為203+83μm，PTH-PLGA微球的粒徑分布均值為216+94μm，兩種微粒之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。PTH-PLGA微球的載藥率約為76.4%，其藥物釋放表現(xiàn)出雙相模式，具體為早期的突釋，在最初的48小時累計釋放約65%的PTH，然后緩慢釋放達28d，如圖1所示。藥物的初期突然釋放與PTH的表面吸附有關。

圖1 PTH 隨著時間的釋放比例

（二）PTH-PLGA-CPC 復合組織工程骨的材料學特性

筆者在掃描電鏡下觀察PTH-PLGA微球及PLGA微球在CPC上的分布，在PLGA微球被二氯甲烷溶解后，組織工程骨呈多孔網(wǎng)狀結構。PTH-PLGA-CPC的孔徑率均值為62.4+5.6%，孔徑大小均值為212+76μm。PLGA-CPC孔徑率均值為60.3+7.2%，孔徑大小均值為205+83μm。PTH-PLGA-CPC抗壓強度的均值為5.63+2.12Mpa，而PLGA-CPC抗壓強度的均值為5.79+1.52Mp。兩組組織工程骨的孔徑大小、孔隙率及抗壓強度無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。具體如表1所示。

表1 PTH-PLGA-CPC 復合組織工程骨與PLGA-CPC 材料學性質(zhì)對比

（三）PTH-PLGA-CPC 復合組織工程骨的生物相容性及成骨活性

筆者通過掃描電鏡觀察到骨髓間充質(zhì)干細胞可在PTH-PLGA-CPC復合組織工程骨表面粘附和生長，細胞形態(tài)正常。骨髓間充質(zhì)干細胞與PTH-PLGA-CPC復合組織工程骨、PLGA-CPC及空白對照組共培養(yǎng)1d后，CCK-8細胞計數(shù)盒檢測的細胞數(shù)量PTH-PLGA-CPC組高于PLGA-CPC及空白對照組（P＜0.05），如圖2所示。這表明PTH-PLGA-CPC可以明顯促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增生。ALP通常用于反應組織細胞的成骨活性，廣泛存在于成骨細胞內(nèi)及細胞外。結果顯示，在7d及14d時，PTH-PLGA-CPC組的ALP活性明顯高于PLGACPC組及空白組（P＜0.05），如圖2所示。這表明PTHPLGA-CPC可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨轉(zhuǎn)化，誘導細胞的體外礦化。

圖2 接種于PTH-PLGA-CPC 組織工程骨表面的細胞增殖及堿性磷酸酶活性測定

三、討論

骨質(zhì)疏松癥為老年人最為常見的疾病之一，骨質(zhì)疏松壓縮性骨折為骨質(zhì)疏松癥最為嚴重的癥狀。目前，治療的方式為以抗骨質(zhì)疏松藥物為基礎的保守治療和手術治療。保守治療時，不論是抑制骨吸收的藥物還是促進成骨類藥物，均需要患者長期使用，并且藥物生物利用度較低，患者依從性較差，導致治療效果差。若研發(fā)載抗骨質(zhì)疏松藥物的緩釋復合體，骨質(zhì)疏松藥物能緩慢釋放，將會起到持續(xù)抗骨質(zhì)疏松的作用，能在很大程度上改善上述情況。目前，作為藥物緩釋體的有機聚合物載體主要包括明膠、白蛋白及多糖類高分子物質(zhì)。其中，聚乳酸-乙醇酸（Poly-Lactic-Co-Glycolic Acid，PLGA）為常用的藥物緩釋載體，具有化學性質(zhì)穩(wěn)定、可緩慢降解的特點。聚乳酸-乙醇酸的降解產(chǎn)物為二氧化碳和水，因此，其具有良好的機械強度及生物相容性。故筆者選擇PLGA作為PTH的載藥緩釋體進行相關的研究。

目前，用于椎體強化治療的最常見的高分子物質(zhì)為聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl-Methacrylate，PMMA）。其能經(jīng)椎弓根注入椎體，具有快速緩解局部疼痛、快速恢復椎體高度、及時提供支撐的作用，但是具有固化過程中會放熱、無法生物降解、力學強度大而力學傳導性差等缺點[1]。因此，諸多研究對聚甲基丙烯酸甲酯進行了改良。其中，與磷酸鈣骨水泥（Calcium Phosphate Cement，CPC）相關的研究最多，已運用于臨床，具有生物相容性好、固化過程不放熱、可被生物降解及具有力學傳導性等優(yōu)點[2]。結合CPC的材料學優(yōu)勢和PLGA的緩慢釋放特點可知[3]，椎體壓縮性骨折經(jīng)皮穿刺向椎體內(nèi)注射PTHPLGA-CPC組織工程骨復合物不僅可以強化椎體，而且能使PTH在局部緩慢釋放的同時實現(xiàn)治療骨質(zhì)疏松的目標。在該部分中，我們首先對該組織工程骨的材料學特性、力學特性及細胞生物學特性進行了研究。

組織工程骨合適的孔隙率及孔徑大小是骨細胞及相關組織長入的條件。研究表明，成骨細胞及成纖維細胞的遷移及生長空間在100～300μm之間。我們的研究中制備的PLGA-CPC及PTH-PLGA-CPC組織工程骨的孔徑均在200μm左右，可以滿足細胞的長入及遷移。在滿足合適的孔徑大小的同時，孔隙之間還需要相互連通，這樣有利于新生骨組織的相互交聯(lián)及營養(yǎng)物質(zhì)的交換。通過掃描電鏡，我們發(fā)現(xiàn)PTH-PLGA-CPC存在相互交聯(lián)的孔隙，孔徑率可以達到60%左右。而在抗壓強度方面，在載入PTH后，組織工程骨的強度并沒有發(fā)生顯著的改變，能夠滿足生物力學的要求。組織工程骨的載藥率及緩慢且持續(xù)的釋放具有治療骨質(zhì)疏松、促進成骨的重要作用。研究表明，作為最常用的載藥緩釋體，PLGA的載藥率可以達到90%，并且藥物持續(xù)緩釋超過3周。在我們的研究中，PTH-PLGA緩釋體的載藥率約為76.4%。在48小時內(nèi)經(jīng)歷爆發(fā)式釋放后，緩慢釋放可以達到28天。與Gentile等人將PLAG負載PTH（1-34）構建的微球材料學特性相一致。

組織工程骨的生物相容性及成骨活性通常通過通體外細胞試驗及體內(nèi)動物實驗來進行評價，本研究通過體外的細胞實驗來進行評價。Gentile等人對PTH（1-34）-PLGA復合微粒和骨髓間充質(zhì)干細胞進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)24小時內(nèi)就可以促進干細胞的分化，并且與對照組相比，PTH（1-34）-PLGA組在48小時內(nèi)的細胞數(shù)量顯著增加，證明了PTH的釋放可以促進細胞的增殖、分化。我們將活力良好的骨髓間充質(zhì)干細胞接種于PTH-PLGACPC組織工程骨表面進行共培養(yǎng)。細胞活力研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞可在PTH-PLGA-CPC復合物表面粘附、生長，細胞形態(tài)正常。這表明PTH-PLGA-CPC具有良好的生物相容性。我們通過CCK-8細胞計數(shù)盒測定細胞數(shù)量，PTH-PLGA-CPC組大于PLGA-CPC組及空白對照組，這也表明PTH-PLGA-CPC組釋放的PTH促進了骨髓間充質(zhì)細胞的增殖。ALP作為成骨細胞增殖分化的檢測指標之一，廣泛存在于成骨細胞內(nèi)及周圍。王晶晶[4]構建的載PTH（1-34）PLGA聚合物微球在體外成骨活性的檢測中，在成骨誘導培養(yǎng)72小時后，即檢測到實驗組ALP染色程度遠高于空白對照組。這表明緩釋體中釋放的PTH可以促進成骨分化。在本實驗中，我們構建的PTH-PLGA-CPC復合組織工程骨對骨髓間充質(zhì)干細胞進行了成骨誘導，檢測的ALP活性顯著高于對照組。這間接提示復合的CPC不會影響PTH的分子構象，緩慢釋放的PTH具有促進成骨分化的作用。

四、結論

載PTH的PLGA微球表面光滑，呈微孔狀的結構，具有合適的粒徑大小、較高的載藥率及藥物緩慢釋放特性。我們構建的PTH-PLGA-CPC復合組織工程骨有多孔網(wǎng)狀結構及良好的力學性能。體外細胞試驗顯示，PTH-PLGA-CPC具有良好的生物相容性及成骨活性，可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞粘附、增殖及成骨分化。我們構建的PTH-PLGA-CPC組織工程骨為下一步的抗骨質(zhì)疏松動物實驗及臨床試驗奠定了理論基礎。