董學(xué)峰，孫禎

（泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，福建泉州 362100）

睡眠呼吸暫停綜合征（Sleep Apnea Syndrome，SAS）是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率在2.6%～8.4%之間。其發(fā)生機(jī)制主要是在睡眠狀態(tài)下，上呼吸道軟組織、肌肉的塌陷引起呼吸道阻塞或狹窄，以及在睡眠期間，上呼吸道肌肉對缺氧和二氧化碳潴留的刺激反應(yīng)性下降，從而產(chǎn)生慢性低氧血癥和高碳酸血癥。睡眠呼吸暫停綜合征可進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生許多病理生理變化，可引起全身多系統(tǒng)、多器官的損害。

SAS導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制十分復(fù)雜。目前的研究結(jié)果是：SAS長期反復(fù)發(fā)生缺氧導(dǎo)致冠狀動脈內(nèi)皮功能紊亂，引起血管舒張因子合成分泌減少，血管收縮，加重缺氧致動脈內(nèi)皮損傷；SAS間歇性缺氧使游離氧自由基及炎癥介質(zhì)升高，出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生內(nèi)皮血管舒張功能障礙，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的出現(xiàn)；SAS間歇性缺氧刺激交感神經(jīng)興奮性增高，并激活腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)，導(dǎo)致心率增快、血壓升高、心肌代謝加快等一系列反應(yīng)，使冠脈供血與心肌代謝之間的平衡被破壞，心肌相對缺血，導(dǎo)致內(nèi)皮進(jìn)一步損傷，促使斑塊形成，加快了冠心病的發(fā)生和發(fā)展。在一定程度上，呼吸睡眠暫停缺氧的嚴(yán)重程度與冠狀動脈狹窄程度呈正相關(guān)。冠心病合并SAS患者的預(yù)后相對較差，這進(jìn)一步提升了冠心病患者的病死率。早期發(fā)現(xiàn)合并SAS，及時治療，對冠心病患者改善預(yù)后、減少心血管事件發(fā)生具有非常重要的臨床意義。

SAS可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的發(fā)病率升高，例如慢性肺源性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心律失常、高血壓、腦卒中、2型糖尿病等[1]。如果患者不及時發(fā)現(xiàn)以上病癥并進(jìn)行有效治療，這些病癥將對患者的生命產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅。在發(fā)病初期，如果患者能進(jìn)行有效的治療，可預(yù)防各種并發(fā)癥的發(fā)生、提高生活質(zhì)量、降低病死率。SAS的病理生理特征是慢性間歇性缺氧（Chronic Intermittent Hypoxia，CIH）。CIH指長期反復(fù)間歇低氧/再氧合交替出現(xiàn)，引起組織缺血再灌注損傷。一方面，長期缺氧可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管活性因子分泌平衡失調(diào)、血管收縮活性因子相對增加，使肺血管收縮，增加血管阻力；另一方面，長期缺氧可以導(dǎo)致血管壁張力升高，促使血管壁增生，從而導(dǎo)致低氧性肺血管重塑（Hypoxic Pulmonary Vascular Remodeling，HPVR），進(jìn)一步引起缺氧性肺動脈高壓（Hypoxic Pulmonary Hypertension，HPH）。肺動脈高壓是以肺血管抵抗和肺動脈壓力升高為主要特征的持續(xù)不可逆性疾病，肺動脈高壓是慢性肺心病發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理生理環(huán)節(jié)，最終可能導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡。目前，學(xué)界已有與CIH誘導(dǎo)HPH的機(jī)制相關(guān)的研究，但相關(guān)學(xué)者對于HPVR形成的細(xì)胞機(jī)制還不太清楚，也沒有代表性的細(xì)胞表型標(biāo)記物，學(xué)者們還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。筆者制作了該類動物模型，擬從CIH對血清HIF-1及HO-1的影響角度探討HIF-1和HO-1在CIH對HPH發(fā)生及發(fā)展過程中的可能機(jī)制。HPH的治療一直是研究熱點。筆者希望本研究能為慢性肺源性心臟病的防治提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）制作慢性間歇性缺氧模型

SPF級雄性C57BL/6小鼠20只 ，體質(zhì)量18～21g，購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。筆者采取隨機(jī)數(shù)字表法，把20只小鼠隨機(jī)分為缺氧組（10只）和 常氧組（10只）。筆者將常氧組的10只小鼠放在室溫23℃～25℃、濕度40%～50%的SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，將缺氧組的10只小鼠放在缺氧箱內(nèi)飼養(yǎng)，并通過氧氣監(jiān)測儀的監(jiān)測使缺氧箱的氧濃度維持在6±1% ～21±1%之間[2］，其他條件與常氧組相同。

（二）取材

在小鼠間歇性缺氧30天后，筆者先給小鼠稱重，再用1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)給小鼠的腹腔注射麻醉，固定小鼠。筆者給小鼠的胸部皮膚進(jìn)行消毒，穿刺小鼠心臟取血。取血后，筆者沿小鼠的劍突向上切開至胸腔，取出肺組織，置于10%甲醛中浸泡，固定1周。

（三）肺小動脈的HE 染色光鏡觀察

取出肺組織，經(jīng)過脫水透明；浸蠟和包埋；切片和貼片，每張片厚度為4um；再進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和封片。筆者使用光學(xué)顯微鏡觀察肺小動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)，用顯微鏡實時攝像系統(tǒng)攝像，隨機(jī)選取每只小鼠的5張肺組織切片，直徑約100um肺小動脈，橫斷面積較圓的3支，在血管內(nèi)膜的十個等距點測量內(nèi)膜和中膜的厚度，再取平均值。筆者使用Image-pro plus 6.0圖像軟件進(jìn)行分析。

（四）血清HIF-1ɑ 和HO-1 水平測定

筆者采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）提取血漿，按說明書操作。

二、統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件包，計量資料以表示，組間差異用t檢驗。有差異者，筆者采用LSP兩兩對比分析法，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

三、結(jié)果

（一）常氧組和缺氧組小鼠肺小動脈形態(tài)學(xué)比較

1.兩組小鼠的肺小動脈形態(tài)學(xué)，見圖1、圖2

圖2 缺氧組小鼠的肺小動脈形態(tài)學(xué)

常氧組：血管壁較薄、腔較大。內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞在管腔面均勻分布，光滑平整。中膜的平滑肌細(xì)胞和彈性纖維層呈環(huán)形規(guī)則排列。管壁三層結(jié)構(gòu)分界清楚。

缺氧組：管腔變窄，較粗糙。內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，內(nèi)彈力膜部分?jǐn)嗔?，?nèi)彈力膜厚薄不一。中膜平滑肌細(xì)胞增生肥大、結(jié)構(gòu)紊亂。彈性纖維層彈力蛋白增多、結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生，中膜層增厚。

2.兩組小鼠的肺小動脈內(nèi)膜厚度及中膜厚度比較，見表1

表1 兩組小鼠的肺小動脈內(nèi)膜及中膜厚度比較（μm，n=10）

與常氧組小鼠對比，缺氧組小鼠的內(nèi)膜及中膜均增厚，P＜0.05，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

（二）兩組小鼠的血清HIF-1ɑ 和HO-1濃度比較，見表2

表2 常氧組小鼠與缺氧組小鼠的血清HIF-1ɑ和HO-1 濃度比較（pg/ml，n=10）

與常氧組小鼠比較，缺氧組小鼠的血清HIF-1ɑ和HO-1濃度均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

（三）缺氧組小鼠的肺小動脈內(nèi)膜厚度與血清HIF-1ɑ 和HO-1 的相關(guān)性

表3 缺氧組小鼠的肺小動脈內(nèi)膜厚度與血清HIF-1ɑ和HO-1 的相關(guān)性

缺氧組小鼠的肺小動脈內(nèi)膜厚度與血清HIF-1ɑ的相關(guān)性r=0.751，P＜0.05，呈正相關(guān)；與血清HO-1的相關(guān)性r=0.887，P＜0.05，呈正相關(guān)。

（四）缺氧組小鼠的肺小動脈中膜厚度與血清HIF-1ɑ 和HO-1 的相關(guān)性

表4 缺氧組小鼠的肺小動脈中膜厚度與血清HIF-1ɑ和HO-1 的相關(guān)性

缺氧組小鼠的肺小動脈中膜厚度與血清HIF-1ɑ的相關(guān)性r=0.742，P＜0.05，呈正相關(guān)；與血清HO-1的相關(guān)性r=0.903，P＜0.05，呈正相關(guān)。

四、討論

本實驗顯示：缺氧組小鼠肺小動脈的病理變化與血清HIF-1ɑ和HO-1密切相關(guān)，這與目前的研究結(jié)論是一致的。

CIH可引起HIF-1表達(dá)升高。HIF-1為異源二聚體的核轉(zhuǎn)錄因子，是在缺氧時最主要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因之一。在缺氧狀態(tài)下，HIF-1在細(xì)胞核內(nèi)與下游上百種靶基因序列結(jié)合，如內(nèi)皮素、血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素等，介導(dǎo)糖酵解、血管新生、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及膠原合成等生物學(xué)效應(yīng)。為組織細(xì)胞提供氧和營養(yǎng)以適應(yīng)機(jī)體缺氧反應(yīng)是機(jī)體許多缺氧反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路[3]。機(jī)體先激活缺氧反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白，再與其靶基因相結(jié)合，再調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后過程，導(dǎo)致機(jī)體對缺氧發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)。缺氧產(chǎn)生的活性氧簇激活HIF-1α與 HIF-1β兩個亞基構(gòu)成的異二聚體HIF-1分子，與CIH病理生理機(jī)制相關(guān)。HIF-1β在缺氧狀態(tài)下幾乎沒有發(fā)生改變，穩(wěn)定表達(dá)。HIF-1α不僅是HIF-1的活性亞基，也是調(diào)節(jié)亞基。細(xì)胞內(nèi)氧濃度能調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。在常氧狀態(tài)下，HIF-1α在合成后經(jīng)蛋白酶和泛素途徑被迅速降解。在缺氧狀態(tài)下，因阻斷羥基化反應(yīng)，HIF-1α的降解減少，HIF-1α積聚和活化，其升高呈指數(shù)倍的增長。異常升高的HIF-1α導(dǎo)致調(diào)控因子的調(diào)控功能出現(xiàn)紊亂，引起血管活性物質(zhì)的分泌和降解、血管舒縮、細(xì)胞增殖等功能均產(chǎn)生異常，進(jìn)一步引起肺小動脈痙攣收縮、血管壁增生。肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡是決定缺氧性肺動脈高壓形成的重要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)，最終導(dǎo)致HPVR等變化，引起HPH的產(chǎn)生。

CIH還可引起HO-1表達(dá)升高，HO-1可以抑制慢性缺氧狀態(tài)下肺小動脈血管平滑肌細(xì)胞增生重構(gòu)、中層增厚管腔狹窄及HPH的產(chǎn)生。目前的研究表明血紅素氧合酶（HO）是目前發(fā)現(xiàn)最易受誘導(dǎo)的酶之一，它是將血紅素降解為一氧化碳（CO）、膽綠素和鐵離子的起始酶和限速酶。血紅素氧合酶（HO）具有HO-1、HO-2和HO-3 三種同工酶，他們都能分解血紅素，并產(chǎn)生CO和膽紅素。只有HO-1是HO唯一的誘導(dǎo)型。作為一種新的舒血管物質(zhì)，HO在CIH的刺激下，可引起紅細(xì)胞生成增多，并破壞血紅素的增加，不僅對限速酶HO-1有明顯的誘導(dǎo)作用，而且能提高代謝終產(chǎn)物CO的產(chǎn)量。HO-1可存在于呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等全身多個系統(tǒng)中，在對抗應(yīng)激反應(yīng)時起著非常重要的作用。HO催化降解血紅素的產(chǎn)物CO是內(nèi)源性CO最主要的來源，CO是繼一氧化氮（NO）之后被發(fā)現(xiàn)的另一種能快速自由地通過各種生物膜的新型細(xì)胞信使分子，內(nèi)源性CO可在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞中生成[4]。CO不僅具有舒張血管平滑肌細(xì)胞的作用，而且能調(diào)節(jié)血管壁張力、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制炎癥反應(yīng)、抑制血小板聚集及增加組織的血液灌注等生物學(xué)效應(yīng)，這些生物學(xué)功能在HPH的病理發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在CIH中，HO-1／CO體系可代償性增加，還參與了機(jī)體對HPVR的自身調(diào)節(jié)。內(nèi)源性HO／CO體系在HPH形成中的生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制是：CO通過自分泌或旁分泌的方式激活細(xì)胞質(zhì)中的鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），CO與鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）中的血紅素基團(tuán)上的鐵原子結(jié)合，活化的sGC再催化GTP生成cGMP，cGMP的生成減少Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+降低，使血管舒張和抑制血小板凝集。CO還可以通過細(xì)胞周期特異性轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的轉(zhuǎn)錄的影響，直接干預(yù)細(xì)胞的G1／S期。CO能抑制分裂素、ET-1、PDGF-β和VEGF等細(xì)胞因子，間接干預(yù)細(xì)胞中的G0／G1期，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。CO不僅能抑制肺小動脈損傷后新生內(nèi)膜的形成，而且能抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5]。

綜上所述，CIH可導(dǎo)致HIF-la的表達(dá)增加，并調(diào)控其下游的缺氧反應(yīng)基因HO-1的轉(zhuǎn)錄。二者協(xié)同作用，發(fā)揮抑制抗氧化損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖、舒張血管、抑制血小板凝聚等作用。CIH構(gòu)成了保護(hù)肺小動脈的HIF-1a/HO-1通路，通過對纖維蛋白溶解級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)來降低致死率[6]。但對于HIF-1a和HO-1在CIH的發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用，以及其在臨床上的使用還需相關(guān)學(xué)者進(jìn)行進(jìn)一步研究，以此為研發(fā)高效的治療缺氧性肺動脈高壓的藥物提供更多理論依據(jù)。