張 琪，吳 菁，張晨璐，

（1．復旦大學附屬中山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200032；2．復旦大學附屬金山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 201508）

髓母細胞瘤是兒童常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，占兒童顱內(nèi)胚胎源性腫瘤的63%[1]。外科、放療和化療的綜合運用已經(jīng)使得髓母細胞瘤患者的生存率有了很大的提高，然而仍有25%～30%的患者死于該病。治療會給患者帶來不同程度的長期后遺癥，約70%接受治療的患者存在聽力喪失、認知障礙等[2]。核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RR）是DNA合成和DNA修復的關(guān)鍵酶，存在于所有真核生物和一些原核生物中，由M1亞基（RRM1）和M2亞基（RRM2）組成[3]。準確的DNA 復制和修復對于所有多細胞生物的正常發(fā)育、生長和無瘤生存至關(guān)重要。RRM2 作為核糖核苷酸還原酶的限速酶，其過度表達與多種癌癥的預后不良相關(guān)[4-5]。在RRM2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，RRM2的過度表達可誘導肺癌發(fā)生，可與DNA錯配修復缺陷協(xié)同促進肺腫物向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變[6]。然而RRM2在小腦髓母細胞瘤中的作用及機制研究尚不清楚。本研究旨在探討RRM2 在小腦髓母細胞瘤中的生物學功能和分子機制，為髓母細胞瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RRM2 抗體、GAPDH 抗 體購自Santa Cruz 公司。CCK-8試劑盒購自同仁公司。Transwell 小室購自美國康寧公司。細胞周期試劑盒和凋亡試劑盒購自北京索萊寶公司。DMEM、MEM、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司。RRM2過表達及敲低慢病毒購自上海吉凱基因。

1.2 小腦髓母細胞瘤細胞系和腫瘤組織臨床樣本芯片

細胞系Daoy 購自中國科學院上海細胞庫，D283細胞系購自美國細胞培養(yǎng)物收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細胞庫，以上2 種細胞系由本實驗室保存。本研究所使用的小腦髓母細胞瘤和癌旁組織臨床樣本芯片購自陜西愛維拉生物科技有限公司，貨號為DC-Bra01022。

1.3 實驗方法

1.3.1 通過GEO 數(shù)據(jù)庫分析髓母細胞瘤患者RRM2表達水平和生存的關(guān)系對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE85217）中612 例髓母細胞瘤患者的生存和基因表達信息進行分析，繼續(xù)通過對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE86574、GSE74195、GSE35493）中髓母細胞瘤和正常小腦組織RRM2 的表達水平進行分析，然后對RRM2 在髓母細胞瘤不同分子分型中表達水平進行比較。進一步通過免疫組化染色在組織樣本芯片上驗證。

1.3.2 免疫組化實驗將組織芯片脫蠟、水化等處理后，使用PBS洗滌3次，每次5 min。置入檸檬酸緩沖液中進行抗原修復，高溫加熱7 min，緩沖液中浸泡5 min，再次使用PBS 洗滌。加入RRM2 一抗（sc-398294，小鼠）抗體按1∶500稀釋，4 ℃過夜。PBS清洗3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次后，進行DAB 顯色及蘇木素復染。乙醇、二甲苯脫水后，使用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染Daoy 細胞（含1%青、鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基）及D283細胞（含1%青、鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基）分別于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d進行傳代。將處于對數(shù)生長期的Daoy或D283細胞接種至6孔板，分為過表達實驗，即對照組（空載體慢病毒）和RRM2 過表達組；敲低實驗，即shRNA 對照組（含無義鏈的慢病毒）和RRM2 敲低組。培養(yǎng)至70%匯合度時，分別加入慢病毒，6 h 后更換培養(yǎng)基。48 h后細胞表達熒光，利用嘌呤霉素進行抗性篩選，建立穩(wěn)定感染細胞株Daoy 和D283 并進行后續(xù)體外實驗。慢病毒過表達載體為pGC-FU-3FLAGCBh-gcGFP-IRES-puromycin，敲低載體為pFU-GW-016。敲低RRM2 的慢病毒靶向序列為cgGAGGAGAG AGTAAGAGAAA。

1.3.4 Western blot 實驗細胞用胰蛋白酶消化，PBS 清洗后離心，加入蛋白裂解液，收集蛋白上清。將變性后的蛋白樣品進行蛋白電泳后，轉(zhuǎn)膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的一抗（RRM2 抗體、GAPDH 抗體），4 ℃孵育過夜。PBST 洗膜，再以1∶2 000 稀釋的二抗（辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG），室溫孵育2 h，加入化學發(fā)光劑后利用成像系統(tǒng)分析蛋白表達水平。

1.3.5 CCK-8 細胞增殖實驗細胞用胰蛋白酶消化后重懸，進行細胞計數(shù)，在96 孔板中每孔加入5×103個細胞，每個時間點設(shè)置3 個復孔。分別在4 個不同時間點即0、24、48和72 h，加入CCK-8試劑，孵育0.5～2 h后使用酶標儀檢測D（450）值。

1.3.6 Transwell 實驗細胞用無血清培養(yǎng)基稀釋為5×105/mL，將200 μL 細胞懸液加入24 孔板上層小室，含有10% FBS 培養(yǎng)基的500 μL 細胞懸液加入到下層小室，繼續(xù)孵育48 h。吸去培養(yǎng)基，用4%甲醛固定15 min，用0.5%結(jié)晶紫染色15 min，觀察細胞遷移情況。

1.3.7 細胞周期和細胞凋亡檢測細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，使用PBS 漂洗2 次。用結(jié)合緩沖液重懸細胞并加入PI，避光孵育15 min后，采用流式細胞儀檢測細胞周期；用結(jié)合緩沖液重懸細胞，并加入Annexin V-FITC 和PI，避光孵育15 min 后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.8 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）為了探索RRM2 在髓母細胞瘤中發(fā)揮功能的相關(guān)分子機制，我們對敲低RRM2 的髓母細胞瘤細胞系Daoy 進行了轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）檢測分析。RRM2 敲低組和對照組細胞系Daoy，由諾禾致源醫(yī)學公司進行RNA提取和檢測，建庫后進行Illumina 測序，對原始數(shù)據(jù)進行過濾后，使用HISAT2 v2.0.5 將預處理序列與參照基因組比對。后續(xù)使用DESeq 1.20.0軟件進行兩組之間的差異表達分析；使用Cluster Profiler 3.4.4 軟件分析KEGG 通路中差異表達基因的統(tǒng)計富集。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。數(shù)據(jù)以±s表示，實驗組和對照組比較采用配對或獨立樣本t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 RRM2在髓母細胞瘤中高表達

對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE85217）中612 例髓母細胞瘤患者的生存和基因表達信息進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達RRM2 的髓母細胞瘤患者相較于低表達組的總生存期更短、預后更差（圖1A）。繼續(xù)通過對GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE86574、GSE74195、GSE35493）中髓母細胞瘤和正常小腦組織RRM2 的表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)RRM2在髓母細胞瘤中較正常小腦組織高表達（P＜0.01，圖1B）。根據(jù)基因改變，髓母細胞瘤可以分為4個分子亞型，分別是WNT 型、SHH 型、第3 組（Group3）、第4組（Group4）[7]。其中WNT型預后最好，5年生存率超過95%；而第3組預后最差，5年生存率小于60%。GEO數(shù)據(jù)庫（GSE85217）分析結(jié)果顯示RRM2 在4 種不同分子亞型中表達水平不同，RRM2 在第3 組中表達量最高，在SHH型表達量最低（圖1C）。進一步通過免疫組化染色，證實RRM2 在髓母細胞瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織（圖1D）。

圖1 RRM2在小腦髓母細胞瘤中高表達

2.2 RRM2增強髓母細胞瘤細胞的增殖和遷移能力

利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建過表達RRM2 和敲低RRM2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系Daoy 和D283。Western blot 檢測了不同細胞系中RRM2 蛋白的表達水平（圖2A）。體外CCK-8 實驗結(jié)果顯示，過表達RRM2 的Daoy 和D283細胞增殖能力均明顯高于對照組，而敲低RRM2基因的Daoy和D283細胞增殖能力明顯低于對照組（均為P＜0.01，圖2B）。Transwell 實驗結(jié)果表明，在Daoy 中過表達RRM2 能夠增強腫瘤細胞的遷移能力，敲低RRM2減弱細胞的遷移能力（圖2C和D）。

圖2 RRM2促進髓母細胞瘤細胞系的增殖和遷移

2.3 RRM2影響髓母細胞瘤細胞的周期和凋亡

結(jié)果顯示，在Daoy 和D283 細胞中過表達RRM2可增加S 期細胞比例、減少G0/G1 期細胞比例；敲低RRM2 則減少S 期細胞比例、增加G0/G1 期細胞比例（均為P＜0.01，圖3A 和B）。細胞凋亡檢測實驗顯示，在Daoy 和D283 細胞中，過表達RRM2 減少早期凋亡（Annexin V+PI-）和晚期凋亡（Annexin V+PI+）的細胞比例。而敲低RRM2 能夠顯著增加早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例（均為P＜0.01，圖3C 和D）。細胞凋亡實驗結(jié)果見表1。

表1 RRM2對髓母細胞瘤細胞凋亡的影響（±s，%）

表1 RRM2對髓母細胞瘤細胞凋亡的影響（±s，%）

分組對照組RRM2過表達組shRNA對照組RRM2敲低組Daoy細胞早期凋亡細胞比例6.44±0.96 0.66±0.20 5.74±1.01 22.62±0.98晚期凋亡細胞比例3.14±0.29 0.34±0.11 2.47±0.48 7.19±1.10 D283細胞早期凋亡細胞比例6.92±2.25 0.73±0.18 6.73±1.48 13.40±0.50晚期凋亡細胞比例3.20±0.49 0.47±0.31 3.90±1.13 11.48±1.00

圖3 RRM2增加S期細胞比例并減少細胞凋亡

2.4 RNA-seq分析結(jié)果

火山圖結(jié)果顯示敲低RRM2 后表達水平發(fā)生變化的基因，其中有3 454個基因表達上調(diào)，3 332個基因表達下調(diào)（圖4A）。KEGG 分析顯示RRM2 敲低后受到影響的信號通路，包括FOXO、細胞周期、核糖體生物合成等信號通路（圖4B）。后續(xù)將通過更多分子實驗明確RRM2發(fā)揮促癌作用的下游信號通路。

圖4 Daoy細胞敲低RRM2的RNA-seq分析結(jié)果

3 討 論

髓母細胞瘤是一種主要發(fā)生在兒童的惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展和研究的推進，促進了人們對髓母細胞瘤生物學特點和發(fā)病機制的理解[8]。通過基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等不同維度的研究，繪制成髓母細胞瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和耐藥的分子圖譜，也為改進診斷和治療措施提供了新希望。盡管該腫瘤的治療情況較十余年前已有較高的提升，但仍有接近20%～30%的患者在接受綜合治療后死亡，因此也亟需新的治療策略。

RRM2是核糖核苷酸還原酶的M2亞單位，是DNA合成和修復過程中的關(guān)鍵酶[9-10]。RRM2被認為行使著癌基因的作用，在多種類型的惡性腫瘤中表達升高[11-12]。在本研究中通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)RRM2 在小腦髓母細胞瘤中呈高表達，并和小腦髓母細胞瘤的預后不良有關(guān)。進一步通過臨床組織標本，在蛋白水平驗證RRM2 在小腦髓母細胞瘤中的表達高于正常小腦組織。

RRM2 的致癌能力在多種類型的惡性腫瘤中已有報道。既往的研究結(jié)果顯示，在人膠質(zhì)母細胞瘤中，RRM2 能夠促進細胞增殖、遷移和侵襲，并減少細胞凋亡[13]；在鼻咽癌中，RRM2 過表達增強了集落形成以及細胞增殖、遷移和侵襲[14]。本研究通過體外實驗，明確了RRM2 的促癌作用，證實RRM2 能夠促進髓母細胞瘤細胞系的增殖和遷移，增加S 期細胞的比例，并能抑制腫瘤細胞的凋亡，表明RRM2 在髓母細胞瘤的發(fā)展中起著重要作用。

以往的研究結(jié)果表明，RRM2 能夠調(diào)控AKT、WNT 等信號通路[15]。例如在腎癌中RRM2 能夠通過上調(diào)ANXA1 的表達激活AKT 通路，從而促進腫瘤生長和舒尼替尼耐藥[16]。目前對RRM2 在小腦髓母細胞瘤中發(fā)揮生物學作用的分子機制仍然缺乏綜合性了解。在本研究中，通過RNA-seq 測序和KEGG 分析提示差異基因主要富集的生物學過程，其中包括FOXO 信號通路、細胞周期等。FOXO3屬于FOXO 家族的一個亞型，是抑癌基因，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、細胞周期、凋亡、DNA 損傷等過程中發(fā)揮重要作用[17]。在前列腺癌中AKT能夠通過磷酸化FOXO3，使其失去轉(zhuǎn)錄活性，并從細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移[18]。因此我們推測，RRM2可能通過AKT/FOXO3通路調(diào)控髓母細胞瘤的發(fā)展，但需要進一步的深入研究。

綜上所述，本研究通過數(shù)據(jù)庫、臨床樣本和體外實驗證實了RRM2 在小腦髓母細胞瘤中發(fā)揮促癌基因的作用。通過對其上下游分子機制深入研究，RRM2有可能作為評估髓母細胞瘤惡性程度、預后和治療靶點的潛在分子。