劉瑞雪，張力為

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，新疆 烏魯木齊 830054）

食管癌是食管上皮來源的惡性腫瘤。據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，食管癌居世界惡性腫瘤發(fā)病率第6位，死亡率第8 位，由于種族、遺傳和生活環(huán)境等因素影響，發(fā)展中國(guó)家的食管癌發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國(guó)家，中國(guó)一直是食管癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一[1-2]。據(jù)我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查，中國(guó)食管癌90%以上是食管鱗癌，新疆是我國(guó)食管癌的高發(fā)區(qū)之一，而當(dāng)?shù)毓_克族食管癌的發(fā)病率相較同地區(qū)的漢族等其他民族，發(fā)病率顯得尤其高（68.8/10萬）[3]。盡管目前對(duì)新疆地區(qū)食管癌高發(fā)人群開展了大量研究，但其主要致病因素尚未明確，發(fā)病機(jī)制更需要進(jìn)一步探究。關(guān)于食管癌脂代謝相關(guān)分子改變的研究更是少見。

本課題組前期通過對(duì)哈薩克族食管鱗癌組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與食管鱗癌進(jìn)展相關(guān)的小分子代謝物和差異表達(dá)基因中，脂肪酸代謝途徑相關(guān)代謝物和能量代謝效應(yīng)分子腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性[4]。AMPK 是哺乳動(dòng)物組織中細(xì)胞代謝和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)器。研究表明，AMPK 活化后促進(jìn)丙二?；D(zhuǎn)移酶（N-malonyl transferase，ACC）磷酸化，使其活性降低，減少丙二酰輔酶A 合成，而丙二酰輔酶A 既是脂肪酸合成的底物，又是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶CPT-1 的別構(gòu)抑制劑，因此，丙二酰輔酶A合成減少可以增強(qiáng)CPT-1的活性，促進(jìn)脂肪酸氧化[5-6]。這些研究提示，哈薩克族食管鱗癌細(xì)胞可能利用代謝性信號(hào)傳導(dǎo)分子及轉(zhuǎn)錄因子微調(diào)脂肪合成和脂肪分解以滿足快速增殖的腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的需求。本研究通過免疫組織化學(xué)方法評(píng)估AMPK 在新疆哈薩克族食管鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，接著通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)技術(shù)，探索AMPK 通過介導(dǎo)脂質(zhì)代謝重編程調(diào)控食管鱗癌進(jìn)展的情況。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本文回顧性地收集2010年1月—2018年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科行食管鱗癌根治性切除術(shù)的65 例哈薩克族患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料（性別、年齡、分化程度、T分期、N分期和TNM分級(jí)）完整的哈薩克族食管鱗癌患者，患者的病理分期依據(jù)2009 年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Cancer Control，UICC）食管癌TNM分期系統(tǒng)（第7版）；②術(shù)前未進(jìn)行任何可能影響基因改變的治療；③由本院病理科兩位副主任醫(yī)師共同確定為原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌的患者，且確定癌旁組織（離食管癌組織≥5 cm）為無癌正常組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：①圍術(shù)期死亡患者（術(shù)后1月因嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥死亡患者）；②既往有其他惡性腫瘤病史患者。納入65例研究對(duì)象均采用電話隨訪方式，隨訪截止日期為2022 年12 月31 日。收集入組患者的組織蠟塊和新鮮組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測(cè)。研究實(shí)行之前，本研究得到新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（K202304-10）。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

食管鱗癌細(xì)胞系（KYSE150、TE-1）購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司，正常食管細(xì)胞系（SHEE）由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院盧曉梅教授課題組饋贈(zèng)。細(xì)胞均培育在加有雙抗（青霉素、鏈霉素）含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞孵育在溫度37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度90%的培養(yǎng)箱中。胎牛血清為上海睿鉑賽生物科技公司產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)海克隆公司，青霉素和鏈霉素、0.25%EDTA胰酶消化液均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液購(gòu)自北京索萊寶公司。Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、miScript SYBR Green PCR Kit均購(gòu)自TaKaRa 公司。RNA 提取試劑TRIzol 購(gòu)自Invitrogen 公司。兔抗AMPK 單克隆抗體購(gòu)自德國(guó)CST公司，山羊抗兔IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。AMPK和GAPDH引物在上海生工生物科技有限公司合成。引物序列如表1。

表1 PCR引物序列

1.3 方 法

1.3.1 qPCR 檢測(cè)腺苷酸活化蛋白激酶mRNA 表達(dá)將31 對(duì)哈薩克族食管鱗癌組織和癌旁組織切成50 g，采用Trizol 裂解組織，用氯仿和異丙醇提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定其純度。然后以提取的RNA 為模板，按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，在實(shí)時(shí)定量PCR儀（Thermo 7500）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，58 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)；所有步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行。以GAPDH 為參照，用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)重復(fù)3次。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腺苷酸活化蛋白激酶蛋白表達(dá)對(duì)65例哈薩克族食管鱗癌組織及配對(duì)癌旁組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察AMPK 蛋白表達(dá)水平，所有組織標(biāo)本石蠟切片均由本院病理科提供，石蠟組織切片常規(guī)60 ℃烤片60 min，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶、枸櫞酸鹽修復(fù)緩沖液中高火修復(fù)組織15 min，冷卻，PBS洗3遍，每次5 min。一抗AMPK（1∶400 稀釋）4 ℃孵育避光過夜；PBS 沖洗，山羊抗兔IgG 室溫孵育1 h；PBS沖洗3 遍。DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、分化、封片、觀察、拍照。

1.3.3 免疫組化染色結(jié)果的評(píng)分染色結(jié)果的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過兩位病理科副主任醫(yī)師在50倍視野下根據(jù)染色面積和強(qiáng)度評(píng)估染色程度。每一張圖取5 個(gè)視野，按陽(yáng)性細(xì)胞百分比分4 個(gè)等級(jí)：[0，25%）為0 分；[25%，50%）為1 分；[50%，75%）為2 分；[75%，100%]為3 分。組織染色強(qiáng)度分為4 個(gè)等級(jí)：未著色0分；淺棕色1分；棕色2分；深棕色3分。結(jié)果按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分，0～2 分為低表達(dá)，3～8分為高表達(dá)。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)腺苷酸活化蛋白激酶蛋白表達(dá)按照碧云天蛋白裂解液試劑說明書提取KYSE150、TE-1及SHEE細(xì)胞的總蛋白，根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)量試劑說明書測(cè)定細(xì)胞樣本的蛋白濃度，然后根據(jù)不同濃度進(jìn)行定量上樣（每孔上樣量40 μg），在10% SDS-PAGE 恒壓電泳法分離所有目的蛋白（60 V、30 min，120 V、90 min），然后恒流條件下（200 mA）濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出條帶洗膜10～15 min，室溫條件下5%牛奶在搖床上均勻封閉1 h，TBST 洗膜3 遍。然后孵育目的蛋白一抗4℃過夜，所用一抗為兔抗人AMPK（1：400 稀釋），β-action（1∶5 000稀釋），接著TBST洗膜3遍（每遍5 min），加山羊抗兔IgG 的二抗（1∶5 000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST充分洗掉背景后，用增強(qiáng)ECL底物發(fā)光法曝光蛋白條帶成像。以β-action 作為內(nèi)參，通過ImageJ 軟件分析蛋白條帶。以目的蛋白條帶的灰度值和內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值大小計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 慢病毒感染穩(wěn)定敲低腺苷酸活化蛋白激酶細(xì)胞均在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。當(dāng)6孔板中KYSE150處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用慢病毒載體感染。慢病毒載體構(gòu)建于上海漢恒科技有限公司，3 個(gè)敲低序列如下：shAMPK-1，GTTGCCTACCATCTCATAATA；shAMPK-2，GTGACCTCACTTGACTCTTCT；shAMPK-3，GTA GCTGTGAAGATACTCAAT。首先，用無血清RPMI-1640 在6 孔板中對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行感染。以MOI 值為20、20、15感染KYSE150細(xì)胞。操作均根據(jù)試劑盒說明書在37 ℃下用6 μg/mL 的Polybrene 混合物進(jìn)行感染48 h。然后取出培養(yǎng)液，換上含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)6～8 d，2 mg/mL 嘌呤霉素篩選，從而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過Western blot 方法驗(yàn)證AMPK敲低的效果。因?yàn)楦蓴_序列LV-shRNA-AMPK3敲低AMPK 效果最好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用此序列進(jìn)行敲低AMPK，統(tǒng)一命名為shRNA-AMPK，并將干擾組細(xì)胞命名為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，未處理組細(xì)胞命名為對(duì)照組細(xì)胞。

1.3.6 超高效液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行脂質(zhì)定性定量分析將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，去除完全培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 溶液迅速清洗細(xì)胞。隨后去除PBS 溶液，加入1 mL胰酶，消化至細(xì)胞呈球狀；然后加入1 mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，終止消化。然后快速計(jì)數(shù)，取1×107個(gè)細(xì)胞。離心機(jī)-20 ℃預(yù)冷，在4 ℃、2 500 g條件下離心5 min。去除上清，迅速放入液氮速凍30 s，然后放-80 ℃保存。寄送（干冰保存）到上海阿趣生物科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0 軟件和GraphPad Prism 9.3.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；AMPK 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用Spearman 相關(guān)分析法；總體生存預(yù)后分析采用Kaplan-Meier 曲線表示；各指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AMPK在哈薩克族食管鱗癌組織中高表達(dá)

通過qPCR評(píng)估哈薩克族ESCC腫瘤組織和癌旁正常組織中AMPK mRNA的表達(dá)，結(jié)果提示食管鱗癌組織中的AMPK mRNA 表達(dá)水平高于癌旁正常組織（P＜0.01，圖1A）。接著，對(duì)65 例哈薩克族食管鱗癌組織及配對(duì)正常組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示在食管鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（58.46%，38/65）高于癌旁正常食管組織（30.77%，20/65）（χ2=10.086，P＜0.01，圖2）。AMPK 的蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系提示，AMPK 的表達(dá)與年齡（P=0.045）、分化程度（P=0.006）有關(guān)（表2）。單因素Cox 回歸分析結(jié)果提示AMPK陽(yáng)性表達(dá)（P=0.01）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.003）可能是影響患者總生存期的因素。多因素Cox 回歸分析AMPK 陽(yáng)性表達(dá)是影響患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表3）。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果提示，AMPK高表達(dá)與ESCC 患者較短的OS 有關(guān)（P＜0.05，見圖3）。總之，上述數(shù)據(jù)表明，AMPK 在哈薩克族食管鱗癌中表達(dá)上調(diào)，其上調(diào)與ESCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

圖1 熒光定量PCR法檢測(cè)哈薩克族患者食管鱗癌組織中AMPK mRNA表達(dá)水平

圖2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)AMPK 蛋白的表達(dá)

圖3 AMPK 蛋白不同表達(dá)水平的哈薩克族ESCC 患者的Kaplan-Meier生存分析

表2 食管鱗癌組織中AMPK 蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

表3 食管鱗癌患者不良預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

2.2 AMPK基因敲低誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝變化

為了了解AMPK 在ESCC 細(xì)胞中是否參與調(diào)節(jié)哈薩克族食管鱗癌脂肪代謝重編程，我們?cè)u(píng)估AMPK 在食管癌細(xì)胞系和食管正常細(xì)胞（KYSE150、TE-1、SHEE）中的表達(dá)水平，結(jié)果提示相較于食管上皮正常細(xì)胞，AMPK 的蛋白表達(dá)水平在KYSE150 和TE-1 中明顯高表達(dá)，且在KYSE150 尤為明顯（圖4A、C）。因此，我們選擇慢病毒感染方式在KYSE150細(xì)胞系中敲低AMPK，篩選出敲低最明顯的shRNA-AMPK3（圖4B、D）。為了識(shí)別AMPK 改變可能導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因素，我們針對(duì)AMPK敲低的KYSE150細(xì)胞及相應(yīng)的對(duì)照組采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行脂質(zhì)定性定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同脂質(zhì)等級(jí)中脂質(zhì)含量及變化趨勢(shì)不同。6個(gè)樣本共鑒定出10種脂質(zhì)亞類，由脂肪酸類（7.88%）、甘油脂類（60.77%）、甘油鞘脂類（21.35%）、鞘脂類（9.62%）和固醇脂類（0.38%）組成。與未處理組比較，AMPK 敲低組食管癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝發(fā)生明顯變化，共發(fā)現(xiàn)76 個(gè)差異脂質(zhì)代謝物，其中37個(gè)上調(diào)，29 個(gè)下調(diào)（圖5A、B）。接著我們對(duì)差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析，觀察到甘油三酯（TAG）的上調(diào)及鞘磷脂（SM）、甘油二酯（DAG）和磷脂酰乙醇胺（PE）的下調(diào)（圖5C）。同時(shí)我們對(duì)差異代謝物的定量值進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算，結(jié)果提示甘油三酯與其他脂質(zhì)之間存在著更明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖5D）。

圖4 Western blot檢測(cè)KYSE150、TE-1、SHEE細(xì)胞中AMPK蛋白的表達(dá)情況和在KYSE150細(xì)胞中慢病毒敲低AMPK的效率

圖5 超高效液相色譜-質(zhì)譜法分析AMPK基因敲低誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝變化

3 討 論

糖酵解是腫瘤細(xì)胞中能量產(chǎn)生的主要途徑，其葡萄糖攝取和糖酵解能力維持在較高的水平，以增強(qiáng)其在應(yīng)激條件下的增殖和存活能力[7]。AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞的能量傳感器。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為AMPK 是腫瘤抑制因子，高表達(dá)AMPK 可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤治療相關(guān)藥物研究也主要集中于激活A(yù)MPK 的藥物。然而，近期AMPK 被證明在外部壓力及內(nèi)環(huán)境應(yīng)激下促進(jìn)腫瘤的生存[8]。AMPK在腫瘤中的作用及促癌或抑癌角色仍存在爭(zhēng)議。有研究表明，食管鱗癌組織中AMPK 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與正常食管黏膜組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同臨床病理特征的食管鱗癌組織中AMPK 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]。本研究結(jié)果卻提示AMPK 在哈薩克族食管鱗癌中高表達(dá)，且AMPK 的表達(dá)水平與年齡、腫瘤分化程度相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示，AMPK 的表達(dá)是新疆哈薩克族食管鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。結(jié)合新疆地區(qū)食管癌的流行病學(xué)特點(diǎn)及AMPK 的差異表達(dá)，其可能對(duì)哈薩克族食管癌的進(jìn)展有特殊影響。

在哺乳動(dòng)物中，AMPK 被認(rèn)為通過直接磷酸化蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)肝臟、脂肪和肌肉等特定組織中的基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[10]。有研究發(fā)現(xiàn)AMPK 活性與羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）和乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）有關(guān)，這兩種酶都是膽固醇和脂肪酸合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。腫瘤研究中提示AMPK 可能參與調(diào)控脂質(zhì)代謝重編程。在肺癌中，溶瘤腺病毒Ad-apoptin以AMPK 為靶點(diǎn)，通過AMPK/ACC 途徑，抑制腫瘤脂代謝促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。在乳腺癌的研究中指出，AMPK參與賴氨酸酶去甲基化5b介導(dǎo)的EMT和脂質(zhì)代謝重編程[13-14]。脂質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定和絕對(duì)定量對(duì)全面研究脂質(zhì)代謝具有重要意義。我們針對(duì)AMPK 敲低后的食管鱗癌細(xì)胞KYSE150 進(jìn)行了液相色譜質(zhì)譜-脂質(zhì)靶向定量分析，相較于空白對(duì)照組，AMPK 敲低組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量明顯降低；差異代謝物相關(guān)性分析結(jié)果顯示甘油三酯的一種類型TAG（46∶3）_FA14∶0與甘油二酯、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂明顯的負(fù)相關(guān)。細(xì)胞中脂肪酸合成活躍，甘油三酯被合成儲(chǔ)存在脂滴中，脂滴的數(shù)量和細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的濃度密切相關(guān)[15]。結(jié)果提示AMPK 可能參與食管鱗癌中的脂質(zhì)代謝重編程，在食管癌的進(jìn)展中扮演重要角色。Qu等[16]在腎細(xì)胞癌的研究中指出，抑制AMPK 可以促進(jìn)GATA3 上調(diào)，通過誘導(dǎo)脂質(zhì)積累，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。目前在食管鱗癌研究中指出，AMPK 可以與SIRT1 協(xié)同作用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[17]，但具體機(jī)制尚未闡明。

目前AMPK 在食管鱗癌脂質(zhì)代謝重編程中的研究較少，同時(shí)新疆哈薩克族又是食管鱗癌高發(fā)民族，結(jié)合本研究AMPK 在哈薩克族食管鱗癌中的表達(dá)特點(diǎn)，值得我們進(jìn)一步深究。