孔義華 王顯河 師海瑞 吳秋陽 梅艷 吳治平 戴志敏

(貴州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床檢驗中心,貴州 凱里 556000)

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球最常見的肝原發(fā)性惡性腫瘤,也是癌癥相關(guān)死亡率第三大主要原因,嚴(yán)重威脅人們的健康和生命〔1,2〕。盡管有多種治療方式可用于治療HCC,例如手術(shù)切除或靶向治療等,但由于其腫瘤浸潤性,HCC通常被診斷為晚期,預(yù)后較差。手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與不良預(yù)后有關(guān)〔3〕。因此,檢測HCC早期新型生物標(biāo)志十分必要〔4〕。大量證據(jù)表明,非編碼RNAs(ncRNAs)的表達(dá)與HCC進(jìn)程有關(guān)〔5〕。環(huán)狀RNAa(circRNAs)是ncRNA的一種新亞型,具有共價的閉環(huán)結(jié)構(gòu),其反向剪接位點位于5′-3′端之間,并且比相應(yīng)的線性RNAs對RNase R的抵抗力更高,具有更高的保守性〔6〕。circRNA在多種分子機(jī)制中起關(guān)鍵作用,包括腫瘤生物標(biāo)志物、調(diào)控基因表達(dá)和使miRNA呈海綿狀〔7～9〕。微小RNA(miRNA)作為小型ncRNA的另一個亞組,負(fù)調(diào)控其靶基因,并在HCC中起癌基因或抑癌作用。研究表明,hsa_circ_0009910、hsa_circ_0049783和hsa_circ_0089172在HCC組織和血漿中上調(diào),其表達(dá)增加與HCC患者的預(yù)后不良相關(guān)〔10〕。另有研究也證實,hsa_circ_0003855(circDUSP16)通過刺激miR-145-5p促進(jìn)胃癌的發(fā)生和侵襲〔11〕,但在HCC中的作用未見報道。此外,miR-136-5p被報道在HCC中表達(dá)下調(diào),作為抗癌miRNA,通過對各種通路的調(diào)節(jié),影響肝癌的進(jìn)展。

Yes相關(guān)蛋白(YAP)1過表達(dá)與HCC的血管浸潤、細(xì)胞分化、腫瘤大小和TNM腫瘤分期有關(guān),可能是HCC形成的危險因素〔12〕。YAP1在人類HCC中高表達(dá),其通過上調(diào)Jagged1和激活Notch途徑來促進(jìn)HCC的發(fā)展和進(jìn)程〔13〕。通過Circular RNA Interactome及Targetscan在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-136-5p同時具有circDUSP16和YAP1的結(jié)合位點。并且,前期研究證實circDUSP16在HCC腫瘤組織中顯著高表達(dá),且其表達(dá)與YAP1呈正相關(guān);雙熒光素酶實驗證實miR-136-5p與circDUSP16和YAP1存在相互作用。因此,本研究旨在探討circDUSP16在肝癌中的表達(dá)特征并探討其與miR-136-5p和YAP1的潛在關(guān)系,以期為HCC患者提供預(yù)后生物標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株 LO2細(xì)胞系(人類永生化的正常肝細(xì)胞系)和人類HCC細(xì)胞系(MHCC97、Huh7、SK-Hep1、Hep3B和HepG2)購自中國科學(xué)院。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞培養(yǎng)在含有100 U/ml青霉素(Sigma),100 μg/ml鏈霉素(Sigma)和10%胎牛血清(Gibco, Thermo Fisher Scientific)的DMEM(Gibco, Thermo Fisher Scientific)中,并在含5%CO2的潮濕氣氛中保持在37 ℃。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 慢病毒介導(dǎo)的sh-circDUSP16(靶序列:ACCTGCTTGCAGGCTTTCAGT),質(zhì)粒介導(dǎo)的circDUSP16,miR-136-5p模擬物(mimic),miR模擬對照(NC),miR-136-5p抑制劑(inhibitor)和miR抑制劑對照(inhibitor NC)購自Genomeditech(上海,中國)。根據(jù)制造商說明,在轉(zhuǎn)染之前,將HCC細(xì)胞種植在6孔板中24 h,然后在HCC細(xì)胞中融合。將Lipofectamine2000試劑(Invitrogen,美國)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染測定。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 根據(jù)制造商說明,使用RNAiso Plus試劑盒(Takara)從HCC細(xì)胞中提取總RNA,使用RNAiso試劑盒(Takara)提取miRNA。為了評估circDUSP16、miR-136-5p和YAP1在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平,進(jìn)行qRT-PCR分析。使用PrimeScript RT Reagent試劑盒(Takara)通過逆轉(zhuǎn)錄總RNA,合成提取總RNA的互補(bǔ)DNA(cDNA);使用Mix-X miRNA第一鏈合成試劑盒(Takara)合成miRNA的cDNA;使用SYBR Premix Ex Tap(Takara)進(jìn)行qPCR,并在LightCycler 480Ⅱ(Roche,Switzerland)中擴(kuò)增。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)用作內(nèi)源對照。使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)。

1.5細(xì)胞活力、菌落形成和凋亡 根據(jù)制造商說明,使用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)分析0、24、48和72 h細(xì)胞活力。使用分光光度計評估每個樣品在450 nm處的吸光度(OD)值。為了評估菌落形成,在轉(zhuǎn)染后48 h將低細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)皿中,并形成可見的菌落,然后用1%結(jié)晶紫染色后對菌落計數(shù)。將細(xì)胞以5×105個細(xì)胞/孔的密度鋪在6孔板中,并且當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時,收獲細(xì)胞并計數(shù)。離心后,通過添加195 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合溶液重懸細(xì)胞。加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 μl碘化丙啶染色溶液以混合。將細(xì)胞在黑暗中孵育10～20 min,然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.6Western印跡法 RIPA緩沖液(Beyotime,中國上海)用于提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度,并使用上樣緩沖液使蛋白質(zhì)變性。蛋白樣品(20 μg)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中電泳,并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,美國)上。用5%脫脂牛奶封閉,然后與特異性一抗在4 ℃下孵育過夜?？贵w是抗YAP1(1∶1 000,目錄號ab52771,Abcam)和抗GAPDH(1∶3 000,目錄號5174S,Cell Signaling Technology)。將膜與二抗在室溫下孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑〔PierceTM電化學(xué)發(fā)光(ECL),Thermo ScientificTM,美國〕用于檢測蛋白質(zhì)。

1.7熒光素酶報告基因檢測 將HCC細(xì)胞系接種到24孔板中。孵育24 h后,將含有野生型(WT)或突變體(MUT)circDUSP16和YAP1的3′非翻譯區(qū)(UTR)的報告載體與miR-136-5p mimic共轉(zhuǎn)染到Huh7和Hep3B細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染48 h后,使用Luc-Pair TM雙熒光素酶測定試劑盒(Genecopoeia)定量熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件和GraphPad Prism進(jìn)行獨立或配對t檢驗及方差分析(ANOVA);Pearson相關(guān)分析用于分析相關(guān)性;Kaplan-Meier方法和對數(shù)秩檢驗分析生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1circDUSP16在不同HCC細(xì)胞系中表達(dá)水平 qRT-PCR結(jié)果表明,與LO2正常細(xì)胞系circDUSP16相對表達(dá)量(1.00±0.12)比較,HCC細(xì)胞系MHCC97(1.34±0.23)、Huh7(2.76±0.14)、SK-Hep1(1.84±0.16)、Hep3B(2.81±0.26)及HepG2(2.43±0.28)顯著升高(t=2.27、16.53、7.27、10.95、8.13;P=0.07、<0.001、0.001、<0.001、<0.001)。

2.2抑制circDUSP16可抑制HCC細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡 與sh-NC組比較,sh-circDUSP16組circDUSP16基因表達(dá)水平明顯降低(1.00±0.09 vs 0.35±0.05,t= 10.94,P<0.001;1.00±0.11 vs 0.42±0.08,t=7.39,P<0.001),說明轉(zhuǎn)染成功。通過在Huh7和Hep3B細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染sh-circDUSP16發(fā)現(xiàn),相比于sh-NC組,sh-circDUSP16顯著抑制了Huh7和Hep3B細(xì)胞系在48 h和72 h的細(xì)胞活力(均P<0.05),抑制菌落形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡(均P<0.05)。見表1、圖1、表2。

A.在Huh7和Hep3B細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染sh-circDUSP16后對細(xì)胞菌落數(shù)的影響。B.在Huh7和Hep3B細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染sh-circDUSP16后對細(xì)胞凋亡的影響圖1 抑制circDUSP16可抑制HCC細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡

表1 轉(zhuǎn)染sh-circDUSP16后對肝癌細(xì)胞活力的影響

表2 轉(zhuǎn)染sh-circDUSP16后對肝癌細(xì)胞菌落數(shù)和凋亡的影響

2.3circDUSP16在HCC中靶向miR-136-5p miR-136-5p與circDUSP16的3′UTR結(jié)合位點見圖2。將miR-136-5p mimic和WT、MUT circDUSP16共轉(zhuǎn)染到Huh7和Hep3B細(xì)胞系中,發(fā)現(xiàn)miR-136-5p顯著降低了Huh7和Hep3B細(xì)胞系中WT circDUSP16的熒光素酶活性(均P<0.001),但在MUT circDUSP16中沒有改變(均P>0.005)。見表3。

圖2 miR-136-5p與circDUSP16的3′UTR結(jié)合位點

表3 轉(zhuǎn)染miR-136-5p mimic后對肝癌細(xì)胞WT、MUT circDUSP16及YAP1 WT、MUT熒光素酶活性的影響

2.4circDUSP16和miR-136-5p調(diào)控HCC中Hippo/YAP信號通路 miR-136-5p與YAP1的3′UTR結(jié)合位點見圖3。將miR-136-5p mimic和YAP1 WT、MUT共轉(zhuǎn)染到Huh7和Hep3B細(xì)胞系中,發(fā)現(xiàn)miR-136-5p顯著降低了Huh7和Hep3B細(xì)胞系中YAP1 WT的熒光素酶活性(均P<0.05),但在YAP1 MUT中沒有改變(均P>0.05)。過表達(dá)Huh7和Hep3B細(xì)胞系中miR-136-5p后,與mimic-NC組比較,miR-136-5p mimic組miR-136-5p表達(dá)明顯升高(P<0.001);而抑制Huh7和Hep3B細(xì)胞系中miR-136-5p后,與Inhibitor NC組比較,miR-136-5p inhibitor組miR-136-5p表達(dá)明顯下降(P<0.001),見表4。Western印跡結(jié)果表明,過表達(dá)miR-136-5p可以降低細(xì)胞中YAP1表達(dá),而抑制miR-136-5p可以增加細(xì)胞中YAP1表達(dá)。見圖4。

圖3 miR-136-5p與YAP1的3′UTR結(jié)合位點

表4 過表達(dá)或抑制miR-136-5p后對肝癌細(xì)胞中miR-136-5p表達(dá)影響

1～4:mimic-NC組、miR-136-5p mimic組、Inhibitor NC組、miR-136-5p inhibitor組;圖5同圖4 Western印跡檢測Huh7和Hep3B細(xì)胞系中YAP1表達(dá)

2.5circDUSP16通過靶向miR-136-5p/YAP1調(diào)控HCC細(xì)胞增殖和凋亡 在Huh7和Hep3B細(xì)胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p表達(dá),Western印跡結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染sh-circDUSP16降低細(xì)胞中YAP1表達(dá),而抑制miR-136-5p可以逆轉(zhuǎn)YAP1表達(dá),見圖5。MTT分析發(fā)現(xiàn),sh-circDUSP16顯著降低Huh7及Hep3B細(xì)胞系48、72 h細(xì)胞活力,而抑制miR-136-5p可以顯著逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活力(均P<0.05)。見表5。此外,菌落分析和流式分析表明,sh-circDUSP16顯著抑制Huh7及Hep3B細(xì)胞系菌落形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而抑制miR-136-5p可以顯著逆轉(zhuǎn)這些變化(均P<0.05)。見圖6、圖7、表6。

圖5 Western印跡法檢測Huh7和Hep3B細(xì)胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后YAP1表達(dá)

圖6 在Huh7和Hep3B細(xì)胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對細(xì)胞菌落數(shù)的影響(結(jié)晶紫染色)

圖7 在Huh7和Hep3B細(xì)胞系中同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對細(xì)胞凋亡的影響

表5 同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對肝癌細(xì)胞活力的影響

表6 同時干擾circDUSP16和miR-136-5p后對肝癌細(xì)胞菌落數(shù)和凋亡的影響

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明,circRNAs可作為HCC患者潛在的生物標(biāo)志物〔14～16〕。例如,在具有較高體脂比的HCC患者中,circ-DB表達(dá)上調(diào),而circ-DB抑制miR-34a,激活泛素特異性蛋白酶(USP)7/細(xì)胞周期蛋白(Ciclin)A2信號傳導(dǎo)途徑,加速腫瘤生長并減少DNA損傷〔17〕。TWIST1通過增加CIRC-10720表達(dá),從而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在HCC波形蛋白表達(dá)〔18〕;circ-ADD3通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)1介導(dǎo)的泛素化促進(jìn)zeste基因增強(qiáng)子同源物(EZH)2降解,從而抑制HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移〔19〕。本研究發(fā)現(xiàn),抑制circDUSP16表達(dá)可抑制HCC細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡,可能通過競爭性結(jié)合miR-136-5p,調(diào)控YAP1的表達(dá),進(jìn)而參與HCC進(jìn)展。這些結(jié)果表明,circDUSP16可能是HCC的潛在生物標(biāo)志物。

在功能上,circRNA可以充當(dāng)HCC中的癌基因或抑癌基因。一方面,環(huán)狀RNA同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶(circ_HIPK)3、circ_UBXN7和circ-PRKCI促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并加速HCC細(xì)胞的凋亡〔20～22〕。另一方面,circZKSCAN1抑制HCC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和侵襲〔23〕。但是,circDUSP16在HCC中的功能作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),抑制circDUSP16表達(dá)可抑制Huh7和Hep3B細(xì)胞系的增殖并促進(jìn)凋亡。這些研究表明,circDUSP16可能是HCC細(xì)胞中的腫瘤促進(jìn)因子。

MiRNA參與各種生理和病理過程〔24～26〕。據(jù)報道,多種miRNA調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,包括HCC在內(nèi)的多種癌癥的增殖、遷移、凋亡、自噬,耐藥性和血管生成〔27～29〕。miR-136-5p是miRNA(非編碼RNA家族)的成員,可以通過使目標(biāo)mRNA的3′-非翻譯區(qū)沉默來調(diào)節(jié)靶基因,從而抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔30〕。研究表明,miR-136-5p在上皮性卵巢癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)〔31,32〕,而在非小細(xì)胞肺癌中miR-136-5p被上調(diào)〔33〕。此外,miR-136-5p可以促進(jìn)化療誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡〔31〕。根據(jù)上述研究,miR-136-5p可能在不同的癌癥中異源表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),在HCC細(xì)胞系中miR-136a-5p表達(dá)下調(diào)。與預(yù)期一致,證明circDUSP16靶向HCC細(xì)胞中miR-136-5p表達(dá)。

在當(dāng)前研究中,YAP1被確定為miR-136a-5p的靶標(biāo)。YAP1在Hippo信號通路中起著重要作用,該通路是細(xì)胞增殖、凋亡和器官生長調(diào)節(jié)中必不可少的通路〔34〕。YAP1也據(jù)報道參與了癌癥的發(fā)展,因為它可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的EMT和耐藥性〔35〕。這項研究發(fā)現(xiàn),YAP1是circDUSP16和miR-136-5p的靶基因。miR-136-5p過表達(dá)降低了YAP1表達(dá)水平,而抑制miR-136-5p增加了YAP1表達(dá)水平。此外,轉(zhuǎn)染circDUSP16可以增加YAP1表達(dá)水平,而miR-136-5p的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這一變化,并進(jìn)一步影響HCC細(xì)胞的增殖和凋亡。這些數(shù)據(jù)表明,circDUSP16通過靶向miR-136-5p/YAP1調(diào)控HCC細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上,circDUSP16的異位表達(dá)通過競爭性結(jié)合miR-136-5p,從而調(diào)控YAP1的表達(dá),參與HCC進(jìn)展。本研究可能為HCC患者提供預(yù)后生物標(biāo)志物。