溫勝慧 楊俊偉 王洋 李公建 翁建峰 段燦星 賈鑫 王建軍

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所/國家植物保護(hù)忻州觀測實(shí)驗(yàn)站，034000，山西忻州；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，100081，北京）

玉米是我國主要糧食作物之一，可作飼料、食品原料和工業(yè)原料等，對國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展有巨大的推動(dòng)作用。根據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，2020 年我國玉米播種面積達(dá)4126 萬hm2，約占糧食作物播種面積的35%，產(chǎn)量達(dá)26 067 萬t，約占糧食總產(chǎn)量的39%[1]。近年來，在全球氣候變化的背景下，耕作制度的轉(zhuǎn)變、種植品種過于單一以及種植面積逐漸增加等因素使得玉米病蟲害流行加重，給生產(chǎn)帶來了巨大挑戰(zhàn)[2]。例如，2015 年玉米南方銹病大爆發(fā)，全國發(fā)病面積約523.9 萬hm2，其中黃淮海夏玉米發(fā)病面積占全國發(fā)病面積的87.8%，且大部分地區(qū)發(fā)生程度均比往年嚴(yán)重[3]。2020 年全國銹病發(fā)病面積約273.19 萬hm2，比2019 年增加78.1%，尤其在黃淮海及西北部分地區(qū)發(fā)生較重[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國玉米病害已有40 余種，在不同地區(qū)均有分布，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量與品質(zhì)[5]。因此，控制玉米病害對于保障玉米的安全生產(chǎn)具有重要意義，而種植抗病品種是控制病害的安全有效措施。篩選和鑒定抗病種質(zhì)資源，研究病害抗性遺傳、挖掘抗病優(yōu)異等位基因并解析其抗病機(jī)制，對推進(jìn)玉米抗病品種培育具有重要意義[6]。

1 常見玉米真菌病害抗性遺傳與基因克隆

1.1 葉部真菌病害

由真菌侵染造成的玉米病害有多種，其中發(fā)生玉米葉部常見的病害有圓斑病、大斑病、小斑病、灰斑病和銹病等，許多國內(nèi)外學(xué)者針對上述病害開展了生理小種的分離鑒定和抗性遺傳研究，定位了一批抗病位點(diǎn)，克隆了候選抗病基因。

1.1.1 圓斑病 圓斑病是由玉米生平臍蠕孢（Bipolaris zeicola）侵染引起的病害[7]，目前已報(bào)道的圓斑病菌生理小種有5 個(gè)，我國主要在東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)CCR1 和CCR2 生理小種，在西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)CCR3 小種，暫未報(bào)道CCR0 和CCR4 生理小種[8]。馬秉元[9]研究表明，玉米對圓斑病病原菌1 號(hào)生理小種的抗性是顯性單基因控制的，而對3 號(hào)生理小種的抗性受多基因控制。1992 年，Johal 等[10]和Sindhu等[11]通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)克隆了玉米第1 個(gè)抗病基因Hm1，該基因表現(xiàn)出對玉米圓斑病菌1號(hào)小種的抗性。另外，位于玉米9 號(hào)染色體上的抗性基因Hm2 對生理小種CCR1 具有抗性，但僅在成熟期發(fā)揮作用[11-12]。

1.1.2 大斑病 玉米大斑病是由大斑凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）侵染引起的病害[7]，Weems等[13]在美國鑒定了20 個(gè)不同的玉米大斑病菌生理小種，目前我國已鑒定的生理小種有16 個(gè)[14]。大斑病的抗性遺傳一般受多基因控制，且不同抗性基因?qū)ι硇》N具有特異性。Chung 等[15]研究表明，DK888 的抗性基因qNLB8.06 與Ht2 基因功能相關(guān)且緊密連鎖，其抗性具有小種特異性且表現(xiàn)為不完全顯性，僅對0 號(hào)和1 號(hào)生理小種具有抗性。Chen等[16]利用K22 和By815 構(gòu)建重組自交系（RIL），在2 個(gè)環(huán)境中均鑒定到了QTL qNCLB1.03 和qNCLB5.04，其中5 號(hào)染色體上（bin5.04）的qNCLB5.04 效應(yīng)最大。Wang 等[17]利用掖478 和齊319 重組自交系在2 個(gè)環(huán)境中共檢測到與0 號(hào)生理小種抗性相關(guān)的11 個(gè)QTL，人工接種后每個(gè)QTL可以解釋抗病性表型變異的3.53%～15.29%，其中7號(hào)染色體上的qNCLB7.02 效應(yīng)最大。Xia 等[18]分別以BB（B73×B97）和BC（B73×CML322）為群體材料，在3 號(hào)和1 號(hào)染色體上鑒定到最多的抗性基因/QTL。Ranganatha 等[19]以抗性自交系SKV50 和感病自交系CML153 進(jìn)行雜交，在2、5、8 號(hào)染色體上檢測到3 個(gè)抗病QTL，其中qNCLB-8-2 可以解釋16.34%的表型變異。目前，Hurni 等[20]以B37Htn1 與SE、RP1、RP3、RP4 為親本成功克隆到位于8 號(hào)染色體上的Htn1 基因；Yang 等[21]以A619Ht2×RP5 和A619Ht3×RP6 為親本成功克隆到Htn1 的等位基因Ht2/Ht3，Htn1 與Ht2/Ht3 基因均為編碼細(xì)胞壁相關(guān)受體蛋白激酶ZmWAK-RLK1 的等位基因，其氨基酸的多態(tài)性導(dǎo)致胞外結(jié)構(gòu)域的差異。

1.1.3 小斑病 小斑病是由玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolaris maydis）侵染引起的病害[7]，其病原菌主要包括4 種生理小種[22]，目前鑒定到的抗病基因較少。蔣鋒等[23]以玉米抗、感自交系T14 和T18為親本，分別在4 號(hào)和6 號(hào)染色體上定位了4 個(gè)和1 個(gè)抗小斑病的QTL。之后又以甜玉米T8 和T33為親本，在3 號(hào)染色體標(biāo)記區(qū)間umc1746～bnlg1523和5 號(hào)染色體標(biāo)記區(qū)間umc1746～bnlg1523 檢測到3個(gè)主效QTL[24]。Balint-Kurti 等[25]研究表明，染色體上bin3.04 和bin6.01 是鑒定小斑病抗性QTL 的重要區(qū)域。Zhao 等[26]以H95rhm與H95 為親本構(gòu)建群體，將6 號(hào)染色體上的玉米小斑病隱性抗病基因座rhm1 定位在InDel 標(biāo)記IDP961-503 與SSR 標(biāo)記A194149-1 之間的8.56kb 區(qū)間，并鑒定到rhm1 的1 個(gè)關(guān)鍵候選基因LHT。Xu 等[27]在玉米自交系B73的10 號(hào)染色體上克隆到1 個(gè)與小斑病抗性相關(guān)的NBS 基因ZmNBS42，該基因作為抗病性的重要調(diào)節(jié)劑，在玉米根、葉和莖等多個(gè)組織的生長發(fā)育過程中均有較高的表達(dá)。

1.1.4 灰斑病灰斑病主要由玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）或玉米尾孢（Cercospora Zeina）侵染引起[7]，其抗性多表現(xiàn)為加性遺傳效應(yīng)。Liu 等[28]以抗、感自交系YML 32 和掖478 為親本構(gòu)建群體，鑒定了抗灰斑病主效QTL qRgls.yaas-8-1/qFt.yaas-8。Du 等[29]以抗、感自交系Q1 和掖478、鄭58 構(gòu)建DH 群體，并檢測到22 個(gè)QTL，其中qGLS_YZ2-1 位于2 號(hào)染色體上2.40Mb 的基因組區(qū)域內(nèi)。Sun 等[30]以抗、感自交系WGR 和DZ01 為親本構(gòu)建群體，在1 號(hào)染色體上2.38Mb 區(qū)域內(nèi)鑒定了灰斑病主效抗性QTL qRgls1.06，該位點(diǎn)為灰斑病抗性熱點(diǎn)區(qū)域，可解釋55.0%的表型變異。Lü等[31]在齊319 自交系的1 號(hào)染色體約314kb 基因組區(qū)域內(nèi)鑒定了主效抗病QTL qGLS1.02，可解釋6.86%～36.24%的表型變異。Xu 等[32]利用高抗自交系Y32與高感自交系Q11 構(gòu)建群體，在8 號(hào)染色體1.4Mb區(qū)間精細(xì)定位了主效QTL qRgls1，病情指數(shù)降低12.2%～29.0%，并通過篩選Y32BAC 文庫等鑒定了qRgls1 的抗病候選基因ZmWAK-RLK 以及與其互作的ZmHR-like 蛋白[33-34]；在5 號(hào)染色體（bin5.03-5.04）上鑒定的灰斑病抗性QTL qRgls2 表現(xiàn)顯性加性遺傳效應(yīng)，能夠提高20.6%～24.6%的抗病性，進(jìn)一步利用分子標(biāo)記及PCR 技術(shù)篩選Y32BAC 文庫，通過指紋圖譜分析及序列比對等技術(shù)鑒定了qRgls2 的主效基因ZmPK，其表達(dá)量與抗病性呈負(fù)相關(guān)[32,35]。Welgemoed 等[36]將10 號(hào)染色體上鑒定的抗性QTL 導(dǎo)入B73 產(chǎn)生B73-QTL，并通過RNAseq 分析鑒定到抗灰斑病候選基因L-RLK-CML，該基因?yàn)榫幋a凝集素受體樣激酶的新型等位基因。

1.1.5 銹病玉米普通銹病由高粱柄銹菌（Puccinia sorghi）侵染引起，南方銹病由多堆柄銹菌（Puccinia polysora）侵染引起[7]。Collins 等[37]通過基因標(biāo)記和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等技術(shù)成功克隆了抗玉米銹病的基因Rp1-D。張小利[38]以冀庫12 和黃早四進(jìn)行雜交，通過田間接種鑒定表明冀庫12 的抗性由一對顯性基因控制，并在10 號(hào)染色體（bin10.02）上鑒定了Rpp12。Lu 等[39]通過掖478和齊319 構(gòu)建的RIL 群體及高密度遺傳圖譜定位了5 個(gè)抗南方銹病的QTL，其中qSCR6.01 效應(yīng)值最高，為主效抗性位點(diǎn)。Deng 等[40]在自交系CIMBL83的4 號(hào)染色體上鑒定到qSCR4.01，其可以解釋總表型變異的48.0%～65.0%。陳文娟等[41]利用黃早四和W456 為親本構(gòu)建的遺傳群體檢測到6 個(gè)抗病QTL，位于10 號(hào)染色體上的qSCR10 能夠解釋表型變異的24.19%。Zhou 等[42]將齊319 自交系10 號(hào)染色體上鑒定到的抗性基因RppQ 定位在SCAR 標(biāo)記MA7 和AFLP 標(biāo)記M-CCG/E-AGA 157 之間。Zhao等[43]以自交系P25 和F349 為親本在10 號(hào)染色體上鑒定了一個(gè)約40kb 的抗南方銹病基因座RppP25及一個(gè)編碼NBS-LRR 蛋白的候選基因。另外，在自交系W2D、SCML205、P25、1484（Jing2416k）、CML470 及CML496 的10 號(hào)染色體上也分別定位了抗南方銹病的基因RppD[44]、RppS[45]、Rpp3[46]、RppM[47]、RppC[48]及RppCML496[49]，并將RppM定位在110kb 的區(qū)域，主效抗病QTL RppCML496可解釋43.0%～78.0%的表型變異。上述研究表明10號(hào)染色體是富含南方銹病抗性基因的主要染色體，尤其在染色體bin10.00-10.02 區(qū)域含有多個(gè)抗南方銹病基因。

1.1.6 多種病原菌同時(shí)侵染 自然界中植物往往會(huì)同時(shí)受到多種病原菌的侵染，在自然選擇壓力下會(huì)進(jìn)化出廣譜抗性基因。目前，對玉米真菌病害廣譜抗性的研究主要集中在大斑病、小斑病與灰斑病上，Martins 等[50]對這3 種病害的抗病性QTL 進(jìn)行共定位，并構(gòu)建F2:3群體對病害相關(guān)的抗性標(biāo)記進(jìn)行基因分型，確定了與3 種病害抗性相關(guān)的2 個(gè)多重抗病性（multiple disease resistance，MDR）QTL。Yang 等[51]在玉米自交系NC292（NC250×B73）的9 號(hào)染色體上鑒定了與上述3 種葉斑病相關(guān)的抗病基因qMdr9.02，并鑒定了與小斑病和灰斑病抗性相關(guān)的微效持久性抗病基因ZmCCoAOMT2。Wang等[52]在大芻草中成功克隆了抗3 種病害的基因ZmMM1，該基因編碼含MYB-DNA 結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄抑制因子，并在含有大芻草基因組片段的導(dǎo)入系C117 的7 號(hào)染色體上克隆了控制ZmMM1 蛋白翻譯水平與病斑表型的稀有主效QTL qLMchr7，揭示了玉米廣譜抗病的分子機(jī)制。另外，Chung 等[15]研究表明，玉米染色體bin8.05-8.06 是與多種病害抗性相關(guān)的重要區(qū)域。Ranganatha 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗性自交系SKV50 的染色體bin8.03、bin5.03、bin5.04 以及bin3.04 區(qū)域存在對玉米大斑病和南方銹病等多種病害共同抗性的目標(biāo)QTL。Chung等[53]在自交系B73 上鑒定到qNLB1.02 與大斑病、斯圖爾特枯萎病和普通銹病抗性有關(guān)，在Tx303 上鑒定的qNLB1.06 與大斑病和斯圖爾特枯萎病抗性有關(guān)。

1.2 莖部真菌病害

1.2.1 莖腐病 莖腐病主要是由鐮孢菌（如禾谷鐮孢Fusarium graminearum）或腐霉菌（如腫囊腐霉Pythium inflatum）單獨(dú)或復(fù)合侵染引起[7]，較多學(xué)者對此病害進(jìn)行了抗性基因定位及遺傳機(jī)制的解析。Song 等[54]首次在自交系齊319 中鑒定到2 個(gè)獨(dú)立遺傳的顯性抗腐霉莖腐病基因RpiQI319-1 和RpiQI319-2，分別定位于bin1.03 和bin10.02；有研究者[55]在自交系X178 中也鑒定到2 個(gè)新的顯性抗腐霉莖腐病基因RpiX178-1 和RpiX178-2，分別定位于bin1.09 和bin4.08。Pè等[56]利用抗、感自交系B89 和33-16 構(gòu)建的群體鑒定了5 個(gè)抗性QTL。Ma 等[57]以抗、感自交系H127R 和昌7-2 構(gòu)建的RIL 群體，在3 號(hào)染色體上約350kb 區(qū)域內(nèi)檢測到鐮孢莖腐病的隱性抗性基因座qRfg3，占表型變異的10.7%～19.4%，可將病害發(fā)生嚴(yán)重程度降低約1/4。Chen 等[58]以自交系18237 和S72365 為親本在8 號(hào)染色體上精細(xì)定位了抗鐮孢莖腐病QTL Rgsr8.1，并在該區(qū)域鑒定到2 個(gè)候選抗性基因。也有研究者[34,59-61]以1145 和Y331 為親本，分別在10和1 號(hào)染色體上鑒定了qRfg1 和qRfg2，qRfg1 插入Y331 基因組可以將植株的抗性穩(wěn)定提高32.0%～43.0%，其抗性基因ZmCCT10 包含CCT 結(jié)構(gòu)域，通過修飾啟動(dòng)子區(qū)的作用元件可以導(dǎo)致抗性基因表達(dá)量發(fā)生變化，從而調(diào)控植物光周期與抵御禾谷鐮孢菌侵染之間的平衡；qRfg2 的抗性基因ZmAuxRP1 編碼質(zhì)體基質(zhì)定位的生長素調(diào)節(jié)蛋白，可以快速響應(yīng)病原菌的侵染，其表達(dá)量與莖腐病抗性呈負(fù)相關(guān)。另外，F(xiàn)rey 等[62]通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽在MP305 自交系4 號(hào)染色體上鑒定了與炭疽莖腐病抗性相關(guān)的基因Rcg1。

1.2.2 紋枯病 紋枯病是由茄絲核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）、玉蜀黍絲核菌（Rhizoctonia zeae）等病原菌侵染引起的病害[7]，唐海濤[63]研究表明，玉米紋枯病的抗性遺傳不僅受到主效基因的控制，也受微效基因的影響，其抗性基因的表達(dá)為組成型表達(dá)，不受病原菌的誘導(dǎo)而表達(dá)。程偉東等[64]研究表明，玉米紋枯病的抗性遺傳由2 對主效基因與多個(gè)微效基因混合控制。趙茂俊等[65]以抗、感自交系R15 和掖478 為親本構(gòu)建的群體檢測到9 個(gè)QTL，其中2 個(gè)抗病QTL位于染色體抗性基因簇6.01 附近。林海建等[66]以抗、感自交系R15 和掖478 為親本構(gòu)建群體，以病情指數(shù)與病斑高（病斑向上蔓延高度與穗位高之比）2 個(gè)指標(biāo)共檢測到18 個(gè)抗性QTL。Li 等[67]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定了與紋枯病抗性相關(guān)的28 個(gè)SNP，并克隆了位于4 號(hào)染色體上抗病基因ZmFBL41，該基因定位于細(xì)胞質(zhì)，編碼F-box 蛋白，通過與ZmCAD 相互作用調(diào)節(jié)對紋枯病的抗性。

1.3 穗部真菌病害

1.3.1 絲黑穗病 絲黑穗病是由絲孢堆黑粉菌玉米?；停⊿porisorium reilianum）侵染引起的病害[7]，常發(fā)生在玉米雌穗和雄穗上，劉玲玲等[68]以抗、感自交系吉846 和掖3189 為親本鑒定了10 個(gè)抗絲黑穗病QTL，其中bin2.09 和bin9.04 上的QTL具有較高的表型貢獻(xiàn)率，且bin9.04 上鑒定的QTL能夠在3 年內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。Weng 等[69]以Mo17 和黃早四構(gòu)建群體將主效QTL qHS2.09 精細(xì)定位在1.1Mb 的區(qū)間，與抗性最顯著相關(guān)的SNP PZE 102187611 可解釋39.7%～44.4%的表型變異；Li等[70]研究表明，絲黑穗病的抗性由加性和上位效應(yīng)控制，并以齊319 和黃早四為親本鑒定了q2.09HR和q5.03HR。Chen 等[71]分別以吉1037 和黃早4 構(gòu)建群體在玉米染色體bin2.09 上鑒定了抗絲黑穗病主效QTL qHSR1，可將病害發(fā)生率降低約1/4。Li等[72]以Mo17 和黃早四構(gòu)建群體鑒定到5 個(gè)QTL，其中主效QTL qHSR1 可解釋43.7%的表型變異；Zuo 等[73]圖位克隆了qHSR1 的抗病候選基因ZmWAK，該基因?yàn)榫幋a細(xì)胞壁相關(guān)激酶的數(shù)量性狀基因。

1.3.2 穗腐病 穗腐病可以由多種病原菌引起，常見的病原菌有輪枝鐮孢（Fusarium verticillioides）、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、黃曲霉（Aspergillus flavus）及綠色木霉（Trichoderma viride）等[7]。Li 等[74]以BT-1 和N6 構(gòu)建群體檢測到4 個(gè)抗穗腐病QTL，其中4 號(hào)染色體上的bin4.06效應(yīng)最大。Ding 等[75]以87-1 和綜3 構(gòu)建群體，在bin3.04 上鑒定的QTL 可解釋13.0%～22.0%的表型變異。Wen 等[76]利用3 個(gè)高抗穗腐病的自交系承351、丹598 和吉V203 分別與感病品系ZW18 雜交形成的3 個(gè)F2群體，共檢測到20 個(gè)穗腐病抗性相關(guān)QTL，其中qRfer1、qRfer10 和qRfer17 占表型變異的比例分別高達(dá)26.58%～43.36%、11.76%～18.02%和12.02%～21.81%。Guo 等[77]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）在509 個(gè)不同的自交系中鑒定了23 個(gè)與穗腐病抗性相關(guān)的SNP，并鑒定到1 個(gè)可能包含穗腐病重要抗性基因的關(guān)鍵位點(diǎn)bin10.03，該位點(diǎn)在之前研究[75,78]中已有報(bào)道。Kebede 等[79]利用B73 和CO441 構(gòu)建的含410 個(gè)家系的重組自交系檢測到可提高禾谷鐮孢穗腐病抗性和改善籽粒干枯率的多效性QTL。Butrón 等[80]研究表明，3 號(hào)染色體上210～220Mb 區(qū)域和7 號(hào)染色體上166～173Mb 區(qū)域是包含抗病QTL 的關(guān)鍵區(qū)域。Gao 等[81-82]研究表明，植物脂肪氧化酶LOX控制的寄主-病原物互作具有特異性，通過玉米LOX 表達(dá)序列標(biāo)簽在自交系B73 上鑒定的9-LOX抗病基因cssap 92（ZmLOX3）對黃曲霉穗腐病具有特異抗性，插入轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的ZmLOX3 突變體受擬輪枝鐮孢菌侵染時(shí)，產(chǎn)生的分生孢子與毒素均顯著減少，然而ZmLOX3 被破壞的lox3-4 突變體被黃曲霉侵染時(shí)，在籽粒上會(huì)產(chǎn)生更多的分生孢子和黃曲霉毒素；Christensen 等[83]在自交系B73 上成功鑒定并克隆了抗擬輪枝鐮孢的9-LOX 基因ZmLOX12。

2 玉米真菌病害抗性機(jī)制

隨著高通量基因組測序、組裝及轉(zhuǎn)錄組研究的不斷深入，越來越多的抗病基因被成功克隆，對病原菌致病與玉米抗病互作機(jī)制的研究也越來越深入。當(dāng)病原菌侵染植物時(shí)，植物會(huì)形成一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來阻止病原菌的侵染，病程相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）與效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）是2 種主要抗性機(jī)制。PTI 是病原物分泌的PAMPs 被植物中的模式識(shí)別受體PRR 特異性結(jié)合并激活植物抗病信號(hào)阻止病原菌侵染的過程，植物中的PRRs 主要包括受體類激酶及細(xì)胞壁相關(guān)激酶等；ETI 是當(dāng)PTI 反應(yīng)產(chǎn)生后，病原菌為繼續(xù)侵染寄主會(huì)分泌一些效應(yīng)蛋白干擾識(shí)別受體對PAMPs 的識(shí)別，此時(shí)植物體胞內(nèi)受體會(huì)直接或間接識(shí)別病原菌特異性的效應(yīng)蛋白，激活寄主特異的免疫機(jī)制[84-85]。2 種機(jī)制往往協(xié)同作用共同抵御病原菌的侵染，在PTI 機(jī)制中常伴隨細(xì)胞壁功能增強(qiáng)及次生代謝物的合成等來阻止病原菌侵染與定植，而ETI 機(jī)制則通過在侵染點(diǎn)形成過敏性壞死反應(yīng)等限制病原菌生長與繁殖，另外抗病蛋白還可以直接或間接識(shí)別病原菌分泌的特異效應(yīng)蛋白而引起ETI 免疫反應(yīng)，但在PTI 和ETI 機(jī)制中也會(huì)產(chǎn)生一些重疊的免疫反應(yīng)，如活性氧的產(chǎn)生及通過植物激素信號(hào)激發(fā)抗性反應(yīng)等，目前常見的植物激素包括水楊酸、茉莉酸和乙烯等[86-89]。

2.1 細(xì)胞壁相關(guān)激酶基因等激發(fā)的免疫反應(yīng)

編碼細(xì)胞壁相關(guān)的受體類激酶基因可以識(shí)別病原菌效應(yīng)分子，跨越質(zhì)膜感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)分子激活免疫反應(yīng)。定位于質(zhì)膜的大斑病抗性基因Htn1（ZmWAK-RLK1）及等位基因Ht2/Ht3 即通過該機(jī)制發(fā)揮作用，另外它們還通過減少病原體滲入宿主組織以及減少BX 次生代謝產(chǎn)物等來增強(qiáng)玉米對大斑病的抗性[20-21,90]。玉米抗灰斑病功能基因ZmWAK-RLK 定位在細(xì)胞膜上，也作為受體激酶來識(shí)別胞外信號(hào)。玉米抗絲黑穗病基因ZmWAK 編碼細(xì)胞壁相關(guān)激酶，當(dāng)病原菌從玉米幼根侵入韌皮部組織后，ZmWAK 在圍繞韌皮部的薄壁細(xì)胞中高表達(dá)，激活水楊酸依賴的抗病基因，抑制病原菌的頂向生長，從而達(dá)到最佳的抗病效果[73]。

2.2 植物組織結(jié)構(gòu)的變化

植物細(xì)胞壁形態(tài)的改變可以提高植物抗病能力，木質(zhì)素滲入細(xì)胞壁中可促進(jìn)機(jī)械組織形成及水分疏導(dǎo)，增強(qiáng)植物抵御病原菌侵害的能力。小斑病和灰斑病的微效持久性抗病基因ZmCCoAOMT2 會(huì)在病原菌侵染后誘導(dǎo)表達(dá)，通過參與苯丙素通路影響木質(zhì)素的合成，從而增強(qiáng)細(xì)胞壁功能，提高植株抵御病原菌侵染的能力，同時(shí)在擬南芥中，該基因的同源基因同樣也通過類似的機(jī)制參與多種抗性過程[51]。紋枯病抗病基因ZmFBL41 編碼蛋白的LRR 結(jié)構(gòu)域通過泛素化等蛋白修飾作用發(fā)生遺傳變異后，喪失了與木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶-肉桂醇脫氫酶ZmCAD 的互作能力，從而保證細(xì)胞壁木質(zhì)素正常合成，增強(qiáng)玉米抗病性[67]。

2.3 植物保衛(wèi)素的合成與積累

次生代謝物合成等是植物抗病的重要途徑，植物抗病基因可以通過影響代謝物的合成或調(diào)控代謝物表達(dá)量觸發(fā)植物免疫反應(yīng)，增強(qiáng)植物抗病性。位于葉綠體的基質(zhì)中的莖腐病抗病基因ZmAuxRP1 通過影響吲哚-3-乙酸（IAA）和苯并惡唑嗪酮類化合物（BXs）的生物合成調(diào)節(jié)植物生長與防御的平衡，ZmAuxRP1 高表達(dá)時(shí)促進(jìn)植物生長，當(dāng)病原菌侵染時(shí)，其表達(dá)量下降利于BXs 的合成，提高抗病性，但會(huì)導(dǎo)致根生長停滯[61]。脂氧化酶代謝通路中的產(chǎn)物會(huì)以植物激素信號(hào)等方式參與植物防御反應(yīng)，qMdr9.02 在受到小斑病菌的侵染后抗性植株中會(huì)積累更多的氧脂含量，而感病植株中肉桂酸等植物激素的含量更高[51]。另外，維生素代謝、苯丙烷生物代謝途徑等也直接或間接在玉米抗病免疫調(diào)控中起關(guān)鍵作用，次生代謝物萜類植物抗毒素、幼苗中形成的含鹽化學(xué)防御素BXs、玉米倍半萜化合物類植保素（zealexins）、二萜植保素類物質(zhì)（kauralexin）和倍半萜烯合成酶和細(xì)胞色素P450 等在抵御病原菌侵染過程中也發(fā)揮重要作用，不同基因簇還可能相互作用提高植物抗病性[91-93]。

2.4 植物抗病基因的直接或間接識(shí)別

LRR 類植物R 基因及含有特殊結(jié)構(gòu)域的抗病基因能直接或間接識(shí)別病原菌激發(fā)植物抗性反應(yīng)，如克隆的第1 個(gè)抗病基因玉米圓斑病抗性基因Hm1[10]，目前克隆的NBS-LRR 類植物R 基因還有抗玉米銹病的基因Rp1-D 及抗南方銹病的RppCML496 等[37,49]。

2.5 水楊酸和茉莉酸等信號(hào)分子介導(dǎo)的防御反應(yīng)

水楊酸和茉莉酸作為防御反應(yīng)中的信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性，調(diào)控防御基因的表達(dá)，抑制或延緩病原菌的生長與發(fā)育，增強(qiáng)植物抗性。Wang 等[94]研究表明，ZmREM1.3 通過水楊酸/茉莉酸介導(dǎo)的防御信號(hào)通路來積極調(diào)節(jié)玉米對銹菌的防御，過量表達(dá)ZmREM1.3 會(huì)導(dǎo)致水楊酸和茉莉酸的積累。小斑病抗病基因ZmNBS42 在受到小斑病病原菌侵染或水楊酸處理的誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)會(huì)顯著上升，在擬南芥中過表達(dá)該基因可以提高水楊酸的含量及防御基因的表達(dá)[27]。在抗擬輪枝鐮孢的9-LOX 基因ZmLOX12 中插入轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的突變體更易受到擬輪枝鐮孢的侵染，并伴隨著茉莉酸前體及生物合成基因表達(dá)水平的降低[83]。

2.6 活性氧迸發(fā)

活性氧及H2O2等過氧化物的積累可以造成局部組織壞死，從而阻止病原菌的擴(kuò)散，植物的NLR蛋白還可通過與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用來調(diào)控活性氧的生成，激活植物免疫反應(yīng)。大斑病、小斑病和灰斑病廣譜抗性基因ZmMM1 通過抑制ZmMT3的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)植物體內(nèi)活性氧的積累，從而增強(qiáng)植物對多種病害的廣譜抗病性[52]。

3 玉米抗真菌病害的主要基因資源

國內(nèi)外學(xué)者通過玉米種質(zhì)資源抗病性鑒定篩選出了針對各種病害的抗病資源，并在此基礎(chǔ)上挖掘了眾多的抗病QTL 或基因，各病害主要抗病基因位點(diǎn)及自交系來源見表1，上述抗病位點(diǎn)或基因主要來源于具有熱帶或亞熱帶血緣的自交系材料，這些位點(diǎn)或基因優(yōu)良單倍型的鑒定為玉米抗病分子育種利用提供了資源。

表1 玉米抗真菌病害主要基因自交系資源Table 1 Inbred line resources of resistance genes of fungal diseases in maize

4 玉米抗真菌病害分子育種應(yīng)用與展望

培育和種植抗病品種是解決病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施，抗性資源的篩選、抗病基因的定位與克隆為抗病育種奠定了基礎(chǔ)。隨著單一抗病品種的大面積種植，品種抗性逐漸減弱，同時(shí)新的病害生理小種不斷出現(xiàn)，廣譜持久抗病基因及其優(yōu)良抗病單體型相對匱乏，抗病基因的研究與利用仍有以下幾個(gè)方面亟待解決。

4.1 抗性資源的篩選鑒定

應(yīng)加大玉米種質(zhì)抗病鑒定與評(píng)價(jià)力度，篩選優(yōu)異抗性資源，挖掘新的優(yōu)異抗病等位基因。目前大量的玉米種質(zhì)資源尚未開展抗病鑒定，或僅針對部分病害進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。因此，需進(jìn)一步加強(qiáng)玉米種質(zhì)資源對不同病害的抗性鑒定評(píng)價(jià)，同時(shí)積極引進(jìn)國外優(yōu)良抗病自交系，拓展抗性種質(zhì)資源。加快構(gòu)建病害生理小種的標(biāo)準(zhǔn)鑒別體系，加強(qiáng)對玉米主產(chǎn)區(qū)田間病害種群結(jié)構(gòu)及生理小種變異的監(jiān)測，加強(qiáng)對不同生理小種抗病種質(zhì)資源的篩選鑒定及生理小種遺傳研究。

4.2 廣譜抗性基因的挖掘與利用

大斑病、圓斑病和小斑病等病害的病原菌生理小種復(fù)雜多變，隨著全球氣候變暖，病原菌生理小種會(huì)出現(xiàn)較大的變異，不同地區(qū)優(yōu)勢小種也在逐漸變化。目前已鑒定的抗病基因大多只對單一病原菌具有抗性，或只對病原菌群體中的一個(gè)或幾個(gè)特定小種具有抗性，培育的抗性品種很難同時(shí)抵御多種病原菌或多個(gè)生理小種的侵染。廣譜持久抗病基因的嚴(yán)重匱乏限制了多抗優(yōu)質(zhì)品種的培育，因此加快挖掘廣譜抗性的調(diào)控基因意義重大；GWAS 等多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用也為抗性基因的快速鑒定提供了技術(shù)支撐。

4.3 植物抗病基因與病原菌無毒基因互作的分子機(jī)理解析

病原菌侵染寄主包括識(shí)別、侵染和繁殖等多個(gè)階段，每個(gè)階段寄主與病原菌之間的協(xié)同進(jìn)化、共同生存涉及復(fù)雜的生物學(xué)途徑及調(diào)控機(jī)制；另外植物抗病反應(yīng)是由包括外界環(huán)境在內(nèi)的多種因素共同作用的結(jié)果，其抗病基因通過各種不同的生理生化途徑引起抗病，植物廣譜持久抗病性的表現(xiàn)與生長發(fā)育等其他農(nóng)藝性狀也存在復(fù)雜的聯(lián)系，因此通過組學(xué)深入研究抗病基因與病原菌無毒蛋白之間的互作關(guān)系，明確植物受體識(shí)別病原菌及抗病基因激發(fā)免疫反應(yīng)的分子機(jī)制、解析PTI 與ETI 的協(xié)同抗病機(jī)制與廣譜抗性的分子機(jī)制等對于抗病基因的挖掘和育種利用具有重要意義。

4.4 玉米抗病分子育種體系

4.4.1 分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù) 玉米常規(guī)育種需要依賴育種者的經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)表型特征選擇，而且會(huì)受到基因型和環(huán)境相互作用的影響，因此，選擇優(yōu)良的基因型和雜交組合較難，分子標(biāo)記輔助選擇（molecular marker assisted selection，MAS）等生物技術(shù)的發(fā)展為改良玉米抗病性狀提供了重要方式，在絲黑穗病和莖腐病等病害的品種改良中已得到廣泛的應(yīng)用，但其容易受到QTL 的精細(xì)定位以及與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記開發(fā)的限制。余輝等[95]利用回交轉(zhuǎn)育與分子標(biāo)記輔助育種相結(jié)合的技術(shù)成功選育了一批單抗絲黑穗病與單抗莖腐病的抗病改良材料。Zhao 等[96]將主要絲黑穗病抗病基因通過MAS 滲入10 個(gè)感病自交系，均表現(xiàn)出對絲黑穗病的抗性，且其他農(nóng)藝性狀不變。李莉等[97]利用MAS 技術(shù)與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，對骨干自交系8902、昌7-2 和吉853 等進(jìn)行了改良，顯著提高了抗絲黑穗病效果。邸宏等[98]通過回交及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良了塘四平頭類群的自交系昌7-2，在田間可以降低絲黑穗病發(fā)病率約89%。Sun等[30]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將灰斑病抗病基因qRgls1.06運(yùn)用于自交系改良，顯著提高了7 個(gè)玉米自交系的抗性，其中改良系DZ01RR/SL06 比改良前減少病害損失約22%。李少博等[99]以高抗南方銹病的齊319 自交系作為供體親本，通過MAS與回交轉(zhuǎn)育相結(jié)合，提高了京24 對南方銹病的抗性。張斌[100]利用MAS 技術(shù)將玉米自交系90110 攜帶的抗粗縮病基因與自交系齊319 攜帶的抗南方銹病基因RppQ聚合在一起，獲得了同時(shí)抗2 種病害的材料。楊華等[101]通過分子標(biāo)記輔助選擇獲得了高抗紋枯病的材料，并選育了渝單24 等抗性雜交種。

4.4.2 全基因組選擇的分子育種技術(shù)的建立 目前使用的分子標(biāo)記輔助選擇常與回交轉(zhuǎn)育相結(jié)合，需要考慮背景選擇、回交次數(shù)、群體大小、標(biāo)記數(shù)目和基因型數(shù)據(jù)等多種因素，在選擇過程中一些復(fù)雜性狀QTL 的表達(dá)易受環(huán)境等外在因素影響，因此建立簡單規(guī)范的操作體系，提高M(jìn)AS 技術(shù)應(yīng)用的效益和效率具有重要意義。建立基于全基因組選擇的分子育種技術(shù)，有針對性地將目標(biāo)性狀基因進(jìn)行聚合以拓寬植物抗性是加速育種進(jìn)程的關(guān)鍵。利用分子標(biāo)記對種質(zhì)資源進(jìn)行雜種優(yōu)勢群劃分，有針對性地進(jìn)行雜交種組配，將遺傳距離遠(yuǎn)、遺傳多樣性高的組合合理配置，提高新抗病系的利用效率；通過分子標(biāo)記輔助選擇、遺傳修飾及基因編輯等技術(shù)結(jié)合單倍體誘導(dǎo)技術(shù)利用抗病基因改良品種已逐漸成為培育高抗優(yōu)質(zhì)品種必不可少的方式；通過覆蓋整個(gè)基因組的分子標(biāo)記來捕獲變異，將基因型與表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，聯(lián)合分析群體中的所有標(biāo)記，建立模型計(jì)算育種值可以高效選擇優(yōu)良株系，尤其在由多個(gè)微效基因控制的數(shù)量性狀改良中有重要意義。

4.4.3 基因編輯技術(shù) 隨著基因編輯技術(shù)的開發(fā)與利用，通過抗病基因的插入、啟動(dòng)子編輯、功能位點(diǎn)定向編輯和感病基因敲除等方式獲得抗病株系已逐漸成為分子育種新的趨勢。CRISPR/Cas 技術(shù)在玉米基因組定向編輯中已有應(yīng)用，Dong 等[102]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)培育出了甜、糯及甜糯玉米，豐富了特用玉米資源。Gao 等[103]通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)促進(jìn)復(fù)雜性狀基因座（complex traits of loci，CTL）的堆疊，證明位于CTL 內(nèi)不同位點(diǎn)的2 個(gè)性狀可以通過基因重組進(jìn)行組合，促進(jìn)了多性狀玉米雜交種的培育，未來應(yīng)加強(qiáng)CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在玉米抗病育種中的利用。目前，基因編輯技術(shù)在其他病原菌誘導(dǎo)的禾本科植物病害如水稻白葉枯病、條斑病、稻瘟病及小麥白粉病等抗病育種中被廣泛應(yīng)用。通過TALEN 誘導(dǎo)突變及CRISPR/Cas9 技術(shù)在3 個(gè)MLO蛋白的同源等位基因中引入靶向突變，增強(qiáng)了小麥白粉病的可遺傳廣譜抗性，并產(chǎn)生了攜帶突變的轉(zhuǎn)基因小麥[104]。通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除感病基因Pi21或Bsr-d1可增強(qiáng)對稻瘟病的抗性，而敲除感病基因Xa5增強(qiáng)對白葉枯病的抗性，同時(shí)敲除這3 個(gè)感病基因可獲得對稻瘟病與白葉枯病均具有抗性的株系[105]?？顾景兹~枯病基因Xa23是多數(shù)水稻攜帶的基因，但其廣譜抗性的表達(dá)需要EBEAvrxa23元件，通過CRISPR/Cas9 技術(shù)將EBEAvrxa23元件插入感病品種ORFxa23的啟動(dòng)子區(qū)，創(chuàng)制出了其他農(nóng)藝性狀不受影響、但對20 個(gè)白葉枯病病原菌小種高抗的株系[106]。Oliva 等[107]也通過CRISPR/Cas9 技術(shù)在易感基因啟動(dòng)子區(qū)引入突變培育了廣譜抗性水稻品系。上述研究為玉米抗病分子育種提供了新思路。