許 皓，冷森林，劉方圓，王萃瑜，劉 瑩，袁 帥，張春宇

吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司,吉林長春 130122

近年來，面對抗生素的大量應(yīng)用及其殘留、細(xì)菌耐藥水平不斷增高等問題，為提高畜禽生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，減少抗生素、替代抗生素，安全有效的飼料添加劑成為目前研究重點。益生菌是對人和畜禽有益的活性微生物。益生菌在畜禽等養(yǎng)殖方面具有廣泛的應(yīng)用[2,3,4]。地衣芽孢桿菌一種能產(chǎn)生內(nèi)生芽孢的兼性厭氧革蘭氏陽性桿菌，其可作為替代抗生素的飼用益生菌。本研究從肉牛的腸道、肺部及墊料中分離出地衣芽孢桿菌，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為實際生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病例樣本來源

遼寧省某大型牛場一頭肉牛的腸道、肺部、墊料。

1.2 試驗動物

18 只18 ～20 日齡18 ～22 g SPF 級ICR 小鼠購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 主要培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂、液體培養(yǎng)基均為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司的產(chǎn)品；生化鑒定管、藥敏片均為杭州濱河微生物試劑有限公司的產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒、PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq ?、DL-3000Marker 為生工生物工程（上海）股份有限公司的產(chǎn)品；革蘭氏染色液試劑盒為青島海博生物公司的產(chǎn)品。

1.4 主要儀器

超凈工作臺（SW.CJ.2FD）購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備公司；空氣恒溫?fù)u床（KYC111）購自上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；PCR 儀（T100TM Thermal Cycler）購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；光學(xué)正置顯微鏡（Axio Lab.A1）購自卡爾蔡司公司；DNA 電泳槽（DYCP-31DN）、穩(wěn)壓電泳儀（DYY-5）均購自北京六一儀器廠；凝膠成像儀（FR980）購自上海復(fù)日科技儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)（HC-2518R）購自BBI 公司。

2 方法

2.1 病料處理

用無菌剪刀在肺組織、腸道剪開一個切口，將滅菌棉簽深入切口內(nèi)取樣，劃線接種于TSA 培養(yǎng)基；同時將墊料用滅菌的生理鹽水沖洗，用滅菌棉簽蘸取液體，劃線接種于TSA 培養(yǎng)基。

2.2 細(xì)菌分離、培養(yǎng)

37 ℃培養(yǎng)12 ～24 h 后觀察，挑取各種優(yōu)勢菌落傳代純化，再培養(yǎng)12 ～24 h 后觀察菌落形態(tài)。

2.3 細(xì)菌PCR 鑒定

2.3.1 DNA 制備。按照Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明進(jìn)行提取DNA。

2.3.2 PCR 引物。27-F：AGTTTGATCMTGGCTCAG（5’-3’）；1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT（5’-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物約1 500 bp。

2.3.3 PCR 反應(yīng)總體系25 μL：預(yù)混酶12.5 μL、上下引物 (10 μM)各1.0 μL、DNA 模版1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。

2.3.4 按以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取PCR 產(chǎn)物5 μL，1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min 電泳觀察。根據(jù)測序結(jié)果，在線生物學(xué)軟件BLAST 進(jìn)行NCBI 數(shù)據(jù)庫搜索比對分析。

2.4 生化鑒定

按照文獻(xiàn)采用細(xì)菌生化鑒定管對純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定，培養(yǎng)24 h，判定結(jié)果。

2.5 藥敏試驗

按照K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，進(jìn)行(高敏S、中敏I、耐藥R)結(jié)果的判斷。

2.6 小鼠致病性試驗

18 只小鼠，分為6 組，每組3 只；第1、3、5 組為攻毒組，分別注射菌液1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL，劑量分別為0.1、0.2、0.4 mL；第2、4、6 組為對照組，分別注射生理鹽水0.1、0.2、0.4 mL。觀察14 d，記錄不良反應(yīng)、精神狀態(tài)、臨床癥狀、采食情況及解剖后病理變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌的形態(tài)與培養(yǎng)特性

在TSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 ～24 h 菌落呈灰白色，表面平滑。菌落有時會形成放射狀，呈邊緣“毛刺狀”的形態(tài)；革蘭染色、鏡檢，分離菌株為革蘭陽性桿菌。

3.2 PCR 鑒定結(jié)果及測序結(jié)果

對分離菌株16S rDNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出大小為1 500 bp 左右的DNA 條帶。將分離菌株所測16S rDNA 基因序列與GenBank 中已收錄核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，經(jīng)比對后確定菌株為地衣芽孢桿菌，與登錄號MT642946.1、CP033218.1 的地衣芽孢桿菌16S rDNA 序列同源性均為99.77%。

3.3 生化試驗結(jié)果

采用細(xì)菌生化鑒定管對純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定，培養(yǎng)24 h，試驗結(jié)果為：接觸酶試驗、甘露醇試驗、阿拉伯糖試驗、7%NaCl 生長試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖試驗結(jié)果均為陽性；尿素酶試驗、靛基質(zhì)試驗、木糖試驗結(jié)果均為陰性，以上結(jié)果與地衣芽孢桿菌特征基本符合。

3.4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗的判定標(biāo)準(zhǔn)參照藥敏試紙廠家說明書，以及《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》（M100-S19）和中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)》（WS/T 125-1999）。藥敏試驗結(jié)果（表1）表明，該分離菌對阿莫西林、多粘菌素B、林可霉素均耐藥；對阿米卡星、慶大霉素、頭孢西叮、諾氟沙星、多西環(huán)素、恩諾沙星均為高度敏感；對氨芐西林、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶均為中度敏感。

表1 分離株藥敏試驗結(jié)果

3.5 小鼠致病性試驗結(jié)果

18只小鼠均沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，沒有死亡現(xiàn)象，精神狀態(tài)良好，采食良好。解剖后均沒有病理變化。

4 討論

本研究對所分離到菌株的菌體形態(tài)、細(xì)菌16SrDNA 基因測序分析方法、生化鑒定試驗、藥物敏感性試驗、小鼠致病性試驗等方法進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，確定從肉牛的腸道、肺部及墊料中分離到的菌株為地衣芽孢桿菌。

在試驗中，從地衣芽孢桿菌菌落形態(tài)上看，當(dāng)培養(yǎng)基上的菌落個數(shù)較少時，菌落呈灰白色，表面平滑；當(dāng)培養(yǎng)基上形成菌苔時，會向四周呈放射狀。

藥敏試驗結(jié)果表明，該分離菌株對12 種抗生素的敏感度不同：對阿莫西林、多粘菌素B、林可霉素均耐藥；對阿米卡星、慶大霉素、頭孢西叮、諾氟沙星、多西環(huán)素、恩諾沙星均為高度敏感；對氨芐西林、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶均為中度敏感。

小鼠致病性試驗結(jié)果表明，三種濃度的地衣芽孢桿菌均對小鼠沒有致病性，無不良反應(yīng)，采食正常；對小鼠本身體質(zhì)是否增強(qiáng)，有待進(jìn)一步研究。

地衣芽孢桿菌是一種基本無毒、無殘留、無抗性的益生菌，在飼料生產(chǎn)中可作為飼料添加劑。在畜禽腸道健康、免疫功能、生長性能等都有一定功效， 地衣芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿、耐膽堿、抗輻射等特點，決定了其在畜禽養(yǎng)殖過程中具有良好的應(yīng)用前景，且有較高的應(yīng)用價值。