吳肇春 蘇琦桐 方琳 陳坤 姜政華 廖凱君

百草枯(Paraquat, PQ)是一種高效除草劑, 在發(fā)展中國(guó)家還廣泛使用。PQ 毒性極強(qiáng), 據(jù)報(bào)道, 只要服用5 ml 以上的PQ 溶液就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重毒性, 甚至死亡［1］。PQ 中毒后, 患者出現(xiàn)多器官急性衰竭, 接著是進(jìn)行性肺纖維化, 最后死于呼吸衰竭。肺纖維化是PQ 中毒最典型的特征, 也是其主要的死亡原因, 發(fā)生于PQ 攝入后的幾天到幾周［2］。紅花黃色素(Safflower yellow, SY)是從紅花的花瓣中提取出的天然黃色素單體, 為查耳酮類化合物, 臨床用于治療心絞痛［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SY 具有抗PQ 誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化作用［4］,SY 具有治療PQ 中毒引起的肺纖維化的應(yīng)用價(jià)值。然而, SY 抗PQ 中毒引起的肺纖維化的機(jī)制尚不明確,仍有待于探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 注射用紅花黃色素(浙江永寧藥業(yè)股份有限公司, 國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050146, 規(guī)格：50 mg, 批號(hào)：180205), 百草枯溶液(山東綠霸化工股份有限公司, 農(nóng)藥登記證號(hào)：PD200813, 規(guī)格：20%, 批號(hào)：171003),E-Cadherin、α-SMA、TGF-β1酶聯(lián)免疫試劑盒(上海拜沃生物科技有限公司, 批號(hào)分別為20200611、20200611、20200607), E-Cadherin、α-SMA、TGF-β1抗體(武漢博士德生物工程有限公司, 批號(hào)分別為200121、200122、200121)

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供的24 只體重約為200 g 的Sprague-Dawley 大鼠, 清潔級(jí), 雄性,許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002, 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)：FJMU IACUC 2019-0117。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 將24 只大鼠隨機(jī)分為NS組、PQ 組、SY 組、PQ+SY 組, 每組6 只。PQ 組和PQ+SY 組通過(guò)腹腔注射PQ 溶液(20 mg/kg)建立肺纖維化模型, NS 組和 SY 組給予等體積生理鹽水。24 h 建模成功后, SY 組和PQ+SY 組灌胃25 mg/(kg·d)的SY進(jìn)行干預(yù)治療, NS 組和PQ 組每天給予等體積的生理鹽水。7 d 后處死, 取出肺組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HE 染色和Masson 染色 取大鼠右肺, 用體積分?jǐn)?shù)為 4%的多聚甲醛固定, 常規(guī)石蠟包埋, 切片, 厚度5 μm, HE、Massion 染色后, 光學(xué)顯微鏡下鏡下觀察大鼠肺組織的病理改變。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)水平 組織總RNA 采用Trizol 試劑盒進(jìn)行提取, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增, PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min, 95℃變性5 s, 60℃退火10 s, 40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書法檢測(cè)靶基因mRNA 表達(dá), 通過(guò)2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 組織總蛋白采用RIPA 試劑盒進(jìn)行提取, 各組TGF-β1蛋白、E-Cadherin、α-SMA 采用BCA 試劑盒進(jìn)行定量, 每組使用相等的蛋白上樣量在100 g/L 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)濃縮膠上樣孔中進(jìn)行點(diǎn)樣并電泳分離, 通過(guò)半干轉(zhuǎn)膜法, 將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上, 5% 脫脂牛奶封閉2 h, 一抗4℃孵育過(guò)夜,通過(guò)TBST 緩沖液清洗PVDF 膜, 二抗孵育2 h, ECL 顯色液顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 兩組比較采用t 檢驗(yàn)；多組比較采用方差分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SY 減輕肺組織病理變化分析 NS 組和SY 組肺泡組織結(jié)構(gòu)正常；PQ 組展現(xiàn)了明顯的肺纖維病理改變：增厚的肺泡壁, 大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 膠原沉積；PQ+SY組展現(xiàn)了SY 減輕了炎癥程度。見圖1。

圖1 HE 染色檢測(cè)肺纖維化大鼠肺組織病理變化 (×200)

2.2 SY 減輕肺組織膠原沉積分析 NS 組和SY 組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯膠原沉積, 支氣管附近發(fā)現(xiàn)有少量膠原存在；PQ 組中發(fā)現(xiàn)有大量膠原纖維形成, PQ+SY 組中也發(fā)現(xiàn)了膠原纖維沉積, 但相比于PQ 組明顯減輕。見圖2。

圖2 Masson 染色檢測(cè)肺纖維化大鼠肺組織纖維化改變 (×200)

2.3 SY 降低TGF -β1基因表達(dá)分析 NS 組、PQ 組、SY 組、PQ+SY 組SY 組 大 鼠 肺 組 織 中TGF -β1相對(duì)mRNA 表達(dá)水平分別為(1.00±0.20)、(2.63±0.12)、(1.28±0.26)、(1.52±0.08)。NS 組與SY 組大鼠肺組織中TGF -β1相對(duì)mRNA 表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PQ 組大鼠肺組織中TGF -β1相對(duì)mRNA表達(dá)水平高于NS 組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SY+PQ 組大鼠肺組織中TGF -β1相對(duì)mRNA 表達(dá)水平低于PQ 組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 RT-PCR 檢測(cè)四組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA 的表達(dá)情況

2.4 SY 降低上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)分析NS 組、PQ 組、SY 組、PQ+SY 組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平分別為(0.150±0.012)、(0.340±0.013)、(0.120±0.034)、(0.290±0.020)μg/ml, E-Cadherin 表 達(dá)水平分別為(0.700±0.066)、(0.280±0.039)、(0.820±0.116)、(0.560±0.050)μg/ml, α-SMA 表達(dá)水平分別為(0.930±0.021)、(1.840±0.090)、(0.850±0.093)、(1.490±0.060)μg/ml。NS 組 與SY 組 大 鼠 肺 組 織 中TGF-β1蛋 白、E-Cadherin、α-SMA 表 達(dá) 水 平 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PQ 組大鼠肺組織中TGF-β1蛋 白、α-SMA 表 達(dá) 水 平 高 于NS 組,E-Cadherin 表達(dá)水平低于NS 組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SY+PQ 組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白、α-SMA 表達(dá)水平低于PQ 組, E-Cadherin 表達(dá)水平高于PQ 組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4, 圖5,圖6。

圖4 蛋白印跡法檢測(cè)四組大鼠肺組織TGF-β1 蛋白的表達(dá)情況

圖5 蛋白印跡法檢測(cè)四組大鼠肺組織E-Cadherin 的表達(dá)情況

圖6 蛋白印跡法檢測(cè)四組大鼠肺組織α-SMA 的表達(dá)情況

3 討論

引起肺纖維化的原因很多, 可被藥物、粉塵、病原微生物等最常見致病因素誘導(dǎo)［5］。PQ 是一種無(wú)選擇性的除草劑, 對(duì)人和動(dòng)物可致劑量依賴性肺纖維化,大鼠腹腔內(nèi)注射PQ 誘導(dǎo)肺纖維化模型與人類的病變類似, 被廣泛應(yīng)用于肺纖維化的研究。本實(shí)驗(yàn)利用PQ建立大鼠肺纖維化模型, 觀察了SY 對(duì)大鼠肺纖維化進(jìn)程的影響, 發(fā)現(xiàn)其可以緩解肺纖維化進(jìn)程, 具有較好的治療作用。

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子, 具有影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)組織形態(tài)和分化的作用［6］。研究者認(rèn)為TGF-β1是誘導(dǎo)組織纖維化包括肺纖維化的一個(gè)關(guān)鍵因子［7］。研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者肺中TGF-β1上調(diào), 大鼠肺中活性的TGF-β1表達(dá)誘發(fā)顯著的纖維化反應(yīng), 而沒(méi)有表達(dá)TGF-β1的大鼠肺纖維化程度較輕［8］。TGF-β1最初被描述為正常乳腺上皮細(xì)胞中上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的誘導(dǎo)物［9,10］,并且之后也被證明在體外許多不同的上皮細(xì)胞包括腎近端小管、晶狀體和肺泡上皮細(xì)胞中介導(dǎo)EMT［11］。本研究發(fā)現(xiàn)SY 可以同時(shí)抑制TGF-β1mRNA 和蛋白的表達(dá), 表明SY 可通過(guò)下調(diào)TGF-β1通路, 抑制PQ誘導(dǎo)的肺纖維化。

PQ 對(duì)肺上皮細(xì)胞的損傷引起促炎性和促纖維化細(xì)胞因子的釋放, 從而產(chǎn)生促纖維化環(huán)境, 其特征是(肌)成纖維細(xì)胞聚集、膠原和基質(zhì)沉積以及結(jié)構(gòu)重塑［12］。炎癥細(xì)胞的募集和肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生成的膠原能介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(excess accumulation of extracellular matrix, ECM)蛋白過(guò)度沉積, 繼而形成肺纖維［13］。最近的研究表明, 肌成纖維細(xì)胞是肺組織纖維化的標(biāo)志, 肌成纖維細(xì)胞的來(lái)源有多種, 上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是其重要來(lái)源之一［14］。上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是一種生物學(xué)現(xiàn)象, 極化的上皮細(xì)胞經(jīng)歷各種生化改變, 產(chǎn)生活動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞, 進(jìn)一步分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞［15］。上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和功能上不同：上皮細(xì)胞為極化粘附型細(xì)胞, 細(xì)胞粘附力強(qiáng), 遷移潛能有限, 其標(biāo)志物為E-Cadherin。間充質(zhì)細(xì)胞不極化, 呈紡錘形, 遷移能力強(qiáng), 其標(biāo)志物為α-SMA［16］。本研究發(fā)現(xiàn)SY 能夠提高肺纖維化大鼠肺組織中的E-Cadherin 表達(dá), 降低α-SMA 表達(dá), 表明EMT 作用可被SY 抑制。

綜上所述, SY 可能通過(guò)抑制TGF-β1蛋白、α-SMA 的表達(dá)來(lái)抑制PQ 誘導(dǎo)的肺纖維化。