周永富 徐海英

骨質疏松癥是一種由于骨代謝失衡, 致使以骨組織顯微結構異常和骨密度降低為特征, 從而導致骨骼脆性增加, 并容易引發(fā)骨折的一種全身性骨代謝性疾病。骨質疏松癥也是中老年的常見病和多發(fā)病, 根據(jù)發(fā)病性質分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。它的防護和治療不僅需要巨大的人力和物力, 還會給家庭乃至整個社會帶來沉重的負擔［1］。據(jù)統(tǒng)計, 2010 年內, 美國50 歲以上的人群中>1/10 患有骨質疏松癥［2］。若不采取干預措施, 未來25 年內, 全球范圍內骨質疏松癥患者的數(shù)量預估將增加兩倍［3］。全球每年約有8900 萬人確診有骨質疏松性骨折, 這意味著每3 秒鐘則有一例骨質疏松性骨折發(fā)生［4］。而現(xiàn)在對骨質疏松性骨折的治療仍有諸多困難, 其總體療效難讓醫(yī)生和患者滿意。隨著全球老齡化進程加劇, 由骨質疏松導致的骨折,不僅嚴重影響患者個人, 還會給醫(yī)療系統(tǒng), 甚至整個社會造成沉重負擔［5］。有研究已證明, 褪黑素能通過促進成骨細胞增殖分化, 抑制破骨細胞形成從而維持骨代謝的穩(wěn)態(tài)并發(fā)揮防治骨質疏松癥的作用［6］。本實驗從生物力學的角度, 觀察褪黑素干預措施對去勢小鼠L3椎體生物力學性能的影響, 旨在探討并驗證褪黑素防治原發(fā)性骨質疏松癥的療效, 報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供, 48 只9 周齡SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境：環(huán)境溫度20～25℃(恒溫), 濕度40～60%(恒濕), 光照每12 小時明暗交替。小鼠分籠飼養(yǎng), 4 只/籠, 自由飲食, 干燥飼料均按照國家嚙齒類動物喂養(yǎng)標準。

1.1.2 藥品與試劑 己烯雌酚(純度99%, 上海信誼藥業(yè)有限公司)；褪黑素(純度99%, 美國Sigma 公司),乙醇(濃度2%, 上海碧云天生物技術有限公司)。

1.1.3 儀器 lnstron 萬能材料試驗機(美國lnstron公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及手術造模 48 只9 周齡的雌性C57BL/6J 小鼠在SPF 動物房適應性喂養(yǎng)3 周至12 周齡,到達性成熟后使用隨機數(shù)字表法將48 只小鼠分為假手術組(Sham 組, 12 只)和去卵巢組(36 只)。去卵巢組小鼠采取背側切口行雙側卵巢切除術, 而Sham 組小鼠行雙側卵巢周圍少量脂肪組織切除術。術后更換墊料,注意保暖, 保持籠內清潔, 觀察所有小鼠至麻醉完全清醒。所有小鼠均采用頸部皮下注射0.1%氨芐西林溶液0.2 ml/d, 術后連續(xù)給藥3 d, 并預防感染。飼養(yǎng)期間及時觀察小鼠的傷口愈合、進食和活動情況。

1.2.2 分組及藥物干預 術后1 周, 將去卵巢組36 只小鼠按體重隨機分為模型組(Control 組)、己烯雌酚組(DES 組)和褪黑素組(Melatonin 組), 每組12 只。所有小鼠自由飲食, 飼養(yǎng)標準均由南方醫(yī)科大學實驗動物中心保證。Melatonin 組小鼠以褪黑素溶液灌胃,褪黑素使用前需要溶于2%的乙醇溶液中, 按40 mg/kg的量給藥, 1 次/d；DES 組小鼠以己烯雌酚溶液灌胃,按22.5 μg/kg 的量給藥, 1 次/d；Control 組小鼠以等體積的2%乙醇溶液灌胃, 1 次/d；Sham 組以等體積的蒸餾水灌胃, 1 次/d。

1.2.3 取材 所有小鼠經(jīng)過不同方式干預后, 分別于第4、8、12 周末應用CO2氣體窒息方法, 每組小鼠隨機處死3 只, 完整取出各組小鼠的L3椎體。用剪刀剪除L3椎體棘突及附件, 并用細砂紙將其打磨成與縱軸垂直, 并上下平面平行的高度約為5 mm 三棱柱體。制取過程中, 各標本均用生理鹽水紗布包裹, 處理結束的L3椎體標本均置于-20℃冰箱保存, 在生物力學測試前晚取出解凍。

1.2.4 椎體生物力學測試 利用Instron 萬能材料試驗機進行椎體壓縮試驗, 將4 組小鼠的L3椎體置于試驗機上, 取加載速度1 mm/min 進行測試, 增大負載至椎體破裂, 觀察受力峰值分布并記錄最大壓力負荷。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠L3椎體最大壓力負荷的變化分析 各組小鼠L3椎體最大壓力負荷隨時間的變化均呈現(xiàn)下降的趨勢, 其中Sham 組和DES 組最大壓力負荷高于Control 組和Melatonin 組, 且曲線變化幅度稍??；Melatonin 組最大壓力負荷高于Control 組。見圖1。

圖1 各組小鼠L3 椎體最大壓力負荷的變化

2.2 第4 周末時各組小鼠L3椎體的最大壓力負荷比較 第4 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為31.67 N, 小于Sham 組的35.67 N 和DES 組的36.67 N,但顯著高于Control 組的27.00 N, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 第4 周末各組小鼠L3 椎體的最大壓力負荷比較

2.3 第8 周末時各組小鼠L3椎體的最大壓力負荷比較 第8 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為28.00 N, 小于Sham 組的32.67 N 和DES 組的33.33 N,但顯著高于Control 組的23.33 N, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 第8 周末各組小鼠L3 椎體的最大壓力負荷比較

2.4 第12 周末時各組小鼠L3椎體的最大壓力負荷比較 第12 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為23.33 N, 小于Sham 組的29.00 N 和DES 組的29.33 N,但顯著高于Control 組的18.67 N, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 第12 周末各組小鼠L3 椎體的最大壓力負荷比較

3 討論

褪黑素是一種主要由腦部松果體分泌的吲哚雜環(huán)類激素, 又稱為松果體素, 在神經(jīng)保護、睡眠、晝夜節(jié)律調節(jié)、學習記憶、情緒調控和多種癌癥中發(fā)揮著有益的作用［7,8］。褪黑素主要儲存在松果體中, 但研究發(fā)現(xiàn), 如胸腺、脾臟、胃腸、睪丸、卵巢和骨髓等其他組織,也可合成并分泌褪黑素［8］。褪黑素的分泌具有晝夜節(jié)律性, 夜間高于白天, 約凌晨2:00 達到峰值；骨重建受多種激素及細胞因子調節(jié)的影響, 在骨細胞方面也表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性, 夜間骨髓的褪黑素分泌水平是血漿2 倍, 骨組織在夜間生長速度最快, 進一步提示褪黑素的分泌可能與骨代謝有關聯(lián)［9］。隨著年齡增長, 褪黑素夜間分泌濃度下降, 晝夜節(jié)律變緩, 女性絕經(jīng)后夜間血漿褪黑素分泌濃度及時長均低于絕經(jīng)前［6］。

有研究報道, 骨折發(fā)生的風險程度與夜晚工作存在相關性, Feskanich 等［10］發(fā)現(xiàn)夜晚工作經(jīng)歷超過20 年的人群, 其手腕和髖部骨折風險程度在未來8 年中顯著升高, 推測其可能的機制是由于夜晚工作影響褪黑素分泌水平, 進而影響骨生長, 增加骨折風險。Amstrup 等［11］通過對81 例絕經(jīng)后女性進行為期一年的高低劑量褪黑素或安慰劑治療后, 發(fā)現(xiàn)褪黑素有助于提升患者睡眠質量, 且未影響肌肉功能, 且低劑量褪黑素治療組女性的股骨頸的骨密度增加, 高劑量治療組女性的股骨頸和脊柱骨密度增加, 提示保證良好的睡眠及褪黑素的夜間分泌水平, 有減緩骨丟失和骨質疏松的可能。Kotlarczyk 等［12］通過對18 名圍絕經(jīng)期女性進行褪黑素和安慰劑治療半年后, 用超聲評估發(fā)現(xiàn)兩組跟骨骨密度無顯著變化和差異, 但測定骨形成標志物血清骨鈣素(OC)和骨吸收標志物尿Ⅰ型膠原交聯(lián)氨基末端肽(NTX)后發(fā)現(xiàn), 褪黑素組OC/NTX 比值顯著升高, 而安慰劑組OC/NTX 比值則無顯著變化, 提示褪黑素有維持成骨細胞和破骨細胞之間的平衡的作用。

骨重建的持續(xù)及其礦化平衡的維持是維持骨骼自身結構完整的前提, 而成骨細胞和破骨細胞之間的動態(tài)平衡和調節(jié), 是實現(xiàn)骨形成和骨吸收平衡的基礎。褪黑素不僅能通過誘導成骨細胞的增殖與分化, 從而促進骨形成, 而且能通過多種途徑直接或間接抑制破骨細胞的生成與活化, 減少骨質的溶解［6］。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠通過增加骨鈣素的表達, 促進骨生成, 抑制骨質流失, 而且能通過上調神經(jīng)肽Y 和神經(jīng)肽Y 受體Y1的表達, 促進間充質干細胞的增殖和遷移, 從而促進骨折愈合［13］。Maria 等［14］研究發(fā)現(xiàn)褪黑素對成骨細胞的誘導作用、骨增強作用和生活質量的改善表明,褪黑素是一種安全有效的骨丟失治療方法。Koyama等［15］研究發(fā)現(xiàn), 藥用劑量的褪黑素能夠通過抑制破骨細胞的生成和活化, 抑制骨吸收水平, 從而提高骨量。此外, 劉俊華等［16］研究發(fā)現(xiàn), 褪黑素能夠通過Nrf-2途徑, 降低成骨細胞的氧化應激反應水平, 進而降低高鐵引起的成骨細胞凋亡。

本實驗中, 各組小鼠L3椎體最大壓力負荷隨時間的變化均呈現(xiàn)下降的趨勢, 其中Sham 組和DES 組最大壓力負荷高于Control 組和Melatonin 組, 且曲線變化幅度稍小；Melatonin 組最大壓力負荷高于Control 組。第4 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為31.67 N,小于Sham 組的35.67 N 和DES 組的36.67 N, 但顯著高于Control 組的27.00 N, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第8 周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為28.00 N,小于Sham 組的32.67 N 和DES 組的33.33 N, 但顯著高于Control 組的23.33 N, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第12周末時, Melatonin 組平均最大壓力負荷為23.33 N,小于Sham 組的29.00 N 和DES 組的29.33 N, 但顯著高于Control 組的18.67 N, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。從生物力學的角度驗證了褪黑素對去勢小鼠骨質疏松癥椎體能生物力學性能的影響。

綜上所述, 褪黑素能通過多種不同途徑促進成骨細胞增殖分化, 抑制破骨細胞生成活化, 從而維持骨代謝的穩(wěn)態(tài), 并發(fā)揮防治骨質疏松癥的作用。但目前可能需要更多的轉化研究以及實驗研究提供更多的證據(jù)支持, 以推進褪黑素在骨質疏松癥領域的臨床應用, 為臨床上防治原發(fā)性骨質疏松癥探索更優(yōu)的新方法。