李 平，呂瑩果,2,*，李雪琴,2，陳 潔,2

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省面制主食工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450001）

螺旋藻是一種高營養(yǎng)密度食品原料，其干粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～70%，糖類質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～23%，脂類質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%～13%，并含有豐富的鈣、鐵、鋅、鈉等礦物質(zhì)和微量元素、維生素和生物活性物質(zhì)，被稱為21世紀(jì)最具營養(yǎng)價(jià)值的食物之一，也是“植物基蛋白”的優(yōu)秀來源[1]。螺旋藻粉作為食品配料在面制品中具有提高營養(yǎng)價(jià)值、增色、抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂等功效[2]，其應(yīng)用不僅符合健康理念而且滿足低碳、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的消費(fèi)需求。

已有將螺旋藻在面制品中應(yīng)用以提高其營養(yǎng)價(jià)值的研究。王宏[3]將螺旋藻粉添加到面粉中，制作出營養(yǎng)健康的螺旋藻饅頭；Mostolizadeh等[4]在意大利面的制作中添加螺旋藻粉，增加了意大利面的必需氨基酸和不飽和脂肪酸含量。Ahin[5]在餅干中加入螺旋藻，發(fā)現(xiàn)餅干的蛋白質(zhì)含量增加，營養(yǎng)價(jià)值提高。螺旋藻不僅能夠改善面制品的營養(yǎng)價(jià)值，還會(huì)影響面制品的加工特性與質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。Shahsavani等[6]將螺旋藻添加到面條中，發(fā)現(xiàn)隨著螺旋藻的添加，面條的吸水性增加，面條的拉伸強(qiáng)度增強(qiáng)，硬度降低，黏彈性得到改善；Zouari等[7]在制作意大利面時(shí)加入螺旋藻，由于面條面筋結(jié)構(gòu)的強(qiáng)化，使意大利面的硬度增加，蒸煮損失下降。Shobha等[8]指出，在無麩質(zhì)面條中添加螺旋藻粉有助于形成淀粉分散較好的蛋白質(zhì)基質(zhì)，同時(shí)螺旋藻粉具有吸收水的能力，并將其保持在蛋白質(zhì)-淀粉網(wǎng)絡(luò)中，從而使面條具有較高的膨脹指數(shù)。面團(tuán)的流變學(xué)特性、面筋蛋白組成和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等對(duì)面制品的加工和品質(zhì)有重要影響，Uribe-Wandurrage等[9]測定了螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)螺旋藻粉增大了面團(tuán)的硬度，增大了面團(tuán)的儲(chǔ)存模量（G′），降低了面團(tuán)的損耗模量（G″），顯著降低了面團(tuán)tanδ。Montevecchi等[10]的研究表明，螺旋藻粉增大了半全麥粉面團(tuán)的吸水率和韌性，面團(tuán)的面筋含量下降，可擴(kuò)展性顯著降低。

目前相關(guān)研究主要集中在探討螺旋藻粉對(duì)面制品的營養(yǎng)、感官及質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的影響，關(guān)于螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)流變性質(zhì)和面筋結(jié)構(gòu)的影響研究不全面，理論機(jī)制研究缺失。因此，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究螺旋藻粉對(duì)小麥粉揉混特性、拉伸特性的影響，并通過面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)觀察、面筋蛋白傅里葉變換紅外光譜和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，探討螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性和面筋結(jié)構(gòu)的影響，以期為螺旋藻粉在面制品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香滿園特一粉 益海嘉里（鄭州）食品工業(yè)有限 公司；螺旋藻粉（80 目）鄂托克旗德榮藻業(yè)有限責(zé)任公司；亮綠、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DTNB）（均為分析純）上海麥克林生化科技有限公司；碘、碘化鉀（均為分析純）山東佰仟化工有限公司；溴化鉀（光譜純）上海展云化工有限公司；考馬斯亮藍(lán)（分析純）上海華碩精細(xì)化工有限公司；丙烯酰胺（分析純）、甲叉雙丙烯酰胺（分析純）、Tris（分析純）、溴酚藍(lán)、甘氨酸、過硫氨酸（分析純）、脲（分析純）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker 北京索萊寶科技有限 公司；SDS（分析純）天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ124BC型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；JHMZ200型針式和面機(jī) 北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司；LHS-100CL型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科技儀器有限公司；PHS-25 TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；E5型光學(xué)顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；LGJ-10C型真空冷凍干燥機(jī) 四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司；505SS型揉混儀 美國National公司；THZ-82型水浴振蕩鍋 杭州旌斐儀器科技有限公司；H-1850型離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；24EN型垂直電泳 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 面粉揉混特性的測定

面粉揉混參數(shù)根據(jù)AACC 54-40A標(biāo)準(zhǔn)[11]方法進(jìn)行測定，小麥粉面團(tuán)記為WF；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～10%（以混合粉總質(zhì)量計(jì)）螺旋藻粉的面團(tuán)分別記為S1～S10；螺旋藻粉記為SP。

將樣品倒入揉面缽中，加入適量的蒸餾水，固定揉面缽，利用Mixsmart程序，記錄揉混曲線并計(jì)算揉混參數(shù)。根據(jù)研究需要，選擇測定的參數(shù)包括峰值時(shí)間、8 min帶寬、峰值曲線面積、右側(cè)斜率。

1.3.2 面團(tuán)、面筋蛋白的制備

稱取100 g特一粉和一定質(zhì)量螺旋藻粉于針式和面機(jī)中，加入適量的蒸餾水和面至其最佳狀態(tài)，形成面團(tuán)備用。

將制備好的面團(tuán)手洗得到濕面筋，然后把濕面筋放入速凍機(jī)冷凍40 min，速凍好的濕面筋用真空冷凍干燥機(jī)干燥48～72 h，得到凍干的面筋蛋白。

1.3.3 面團(tuán)拉伸特性的測定

將制備好的面團(tuán)，靜置5 min使其應(yīng)力松弛后，采用A/KIE拉伸測定標(biāo)準(zhǔn)探頭。參數(shù)設(shè)定：測前速率2.00 mm/s，測試速率3.30 mm/s，測后速率10.00 mm/s；應(yīng)變位移100.0 mm；自動(dòng)引發(fā)，引發(fā)力5.0 g。具體操作：取10 g面團(tuán)進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)，將準(zhǔn)備好的面團(tuán)放置在模具里，壓成2 mm×60 mm的面團(tuán)條。取出面團(tuán)條立即用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)，直至將面團(tuán)條拉斷，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.4 濕面筋含量的測定

參照GB/T 5506.1—2008《小麥和小麥粉 面筋含量 第1部分：手洗法測定濕面筋》測定[12]。按下式計(jì)算濕面筋質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以每百克含水率為14%的小麥粉面筋含量表示：

式中：m為濕面筋質(zhì)量/g；m1為每百克小麥粉水 分質(zhì)量/g；86為換算成14%基準(zhǔn)水分試樣的系數(shù)；10為試樣質(zhì)量/g。

1.3.5 面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的觀察1.3.5.1 光學(xué)顯微鏡觀察

將制備好的面團(tuán)放入冰箱冷凍2 h，用小刀切出呈現(xiàn)透明狀態(tài)的薄面片，將其展平鋪在載玻片上，用0.1%亮綠水溶液染色1 min，再用Lugol氏碘液（含0.33 g/100 mL I2）和0.67 g/100 mL KI染色1 min[13]。面筋蛋白被亮綠水溶液染成綠色，直鏈淀粉被Lugol氏碘液染成藍(lán)色，支鏈淀粉被染成紫色。蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下于40 倍物鏡和10 倍目鏡下觀察后拍照。

1.3.5.2 掃描電子顯微鏡觀察

取冷凍干燥后的面團(tuán)切成表面平整的小面塊，面塊用戊二醛固定48 h，再用鋨酸固定2 h；CO2超臨界點(diǎn)干燥后，將樣品固定在樣品臺(tái)上。采用Hitachi IB-5離子鍍膜儀進(jìn)行噴金處理后，置于S-570掃描電子顯微鏡下放大2000 倍并拍照。

1.3.6 面團(tuán)中游離巰基含量的測定

參考石長碩[14]的方法，先用0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液（pH 8.0，含有8 mol/L尿素、1% SDS、3 mmol/L乙二胺四乙酸）將-半胱氨酸配成2 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度稀釋為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mmol/L。分別取4 mL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入0.1 mL 10 mmol/L DTNB溶液，混勻后在室溫下顯色20 min，在412 nm波長處測定溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考Chan等[15]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取不同螺旋藻粉添加量的凍干面團(tuán)樣品400 mg溶于10 mL 0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液中，渦旋振蕩5 min后，5000 r/min離心15 min。取4 mL上清液，加入0.1 mL 10 mmol/L DTNB溶液，混和均勻，顯色20 min，在412 nm波長處測定吸光度，并通過L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中游離巰基含量。按下式計(jì)算面團(tuán)中游離巰基含量：

式中：n為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的溶液中游離巰基含量/（μmol/mL）；c為樣品質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.7 面團(tuán)中二硫鍵含量的測定

參考Chan等[15]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。取1.3.6節(jié) 中離心后的上清液1 mL，加入0.1 mLβ-巰基乙醇和4 mL 0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液，混勻后在室溫下靜置1 h，加入10 mL 12%三氯乙酸溶液，混勻靜置1 h后，4500 r/min離心15 min。倒掉上清液，加入5 mL 12%三氯乙酸溶液洗滌沉淀2 次，然后在沉淀中加入10 mL 0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液，復(fù)溶后加入0.1 mL 10 mmol/L DTNB，顯色20 min，測定412 nm波長處的吸光度，通過L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中總巰基含量。按下式計(jì)算面團(tuán)中總巰基含量：

式中：n為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的溶液中巰基含 量/（μmol/mL）；c為樣品質(zhì)量濃度/（g/mL）；V1為上清液體積/mL；V2為沉淀復(fù)溶后體積/mL。

按下式計(jì)算面團(tuán)中二硫鍵含量：

1.3.8 SDS-PAGE分析

稱取5 mg面筋蛋白或螺旋藻粉樣品，溶于1 mL樣品緩沖液中，振蕩使其充分溶解后，煮沸5 min，10000 r/min離心5 min。利用垂直PAGE進(jìn)行分析，分離膠12%，濃縮膠5%，上樣量10 μL；設(shè)置初始電壓為80 V，待其將進(jìn)入分離膠時(shí)調(diào)至120 V，離底部1 cm左右時(shí)停止電泳。染色脫色處理后，使用Quantit One軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜分析

將制備好的面筋蛋白冷凍干燥后磨粉，過80 目篩，稱取1～2 mg樣品和干燥后的溴化鉀100 mg于研缽中，充分研磨均勻，壓片。然后將制得的均勻透明薄片轉(zhuǎn)移到傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行全波段（4000～400 cm-1）掃描，掃描次數(shù)為32 次。用Peakfit 4.12 軟件對(duì)1700～1600 cm-1吸收峰處圖譜依次進(jìn)行基線校正、高斯去卷積和二階導(dǎo)數(shù)擬合，分析面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Waller-Duncan多重比較，P＜0.05，差異顯著。用Origin 2021軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻粉對(duì)面粉揉混特性的影響

揉混參數(shù)主要反映面團(tuán)在揉混、攪拌過程中的面團(tuán)塑性、彈性和黏性特征，特別是中線峰值處的指標(biāo)與加工品質(zhì)密切相關(guān)，是面團(tuán)流變學(xué)特性的重要參數(shù)[16]。由圖1可知，添加螺旋藻粉后面團(tuán)的揉混曲線有明顯的變化，添加量高于8%后，面團(tuán)的耐揉性質(zhì)明顯降低（圖1A10、A11）。

圖1 添加螺旋藻粉的面粉揉混圖Fig.1 Mixographs of wheat flour with Spirulina powder

由表1可知，添加螺旋藻粉之后，面團(tuán)的加水量和峰值時(shí)間增大。峰值時(shí)間代表了面團(tuán)形成所需要的攪拌時(shí)間，此時(shí)的面團(tuán)流動(dòng)性最小、可塑性最大，通常面團(tuán)和面時(shí)間越長，耐揉性越好[17]。添加螺旋藻粉后面團(tuán)峰值時(shí)間增大，可能是由于螺旋藻中的多糖、膳食纖維和面筋蛋白、淀粉顆粒競爭吸收水分，從而提高了吸水量，降低了淀粉顆粒和面筋蛋白的吸水速度，增加了和面時(shí)間。壇紫菜與螺旋藻同屬于可食用藻類，師文濤[18]研究發(fā)現(xiàn)，面團(tuán)的形成時(shí)間隨著壇紫菜粉的增加呈上升趨勢，推測其中豐富的膳食纖維與面團(tuán)面筋蛋白競爭水分，與本研究結(jié)論相同。另外，小麥粉中的蛋白質(zhì)含量也會(huì)影響揉混曲線的峰值時(shí)間[19-20]，趙惠賢等[21]指出，形成面團(tuán)的峰值時(shí)間和面粉的蛋白質(zhì)含量顯著正相關(guān)，蛋白質(zhì)含量越高，峰值時(shí)間越長。螺旋藻中蛋白質(zhì)含量豐富，添加到小麥粉后使其總體蛋白質(zhì)含量提高，從而也可能提高峰值時(shí)間。8 min帶寬能夠反映面團(tuán)的面筋強(qiáng)度和黏度，帶越寬，表示面筋的強(qiáng)度越強(qiáng)，面團(tuán)的黏度越小[22-23]。由表1可知，隨著螺旋藻粉的添加，8 min帶寬整體呈下降趨勢，說明螺旋藻粉降低了面團(tuán)的強(qiáng)度和黏度。但添加量為3%～4%時(shí)，8 min帶寬有小幅度升高，說明此時(shí)螺旋藻粉在面團(tuán)中混合均勻，交聯(lián)性較好。峰值曲線面積是形成面團(tuán)所需要做功的一個(gè)量度[16]。添加螺旋藻粉后，峰值曲線面積呈增加趨勢，可能是因?yàn)樘砑勇菪宸酆螅鎴F(tuán)硬度增加，增大了面團(tuán)攪拌時(shí)的阻力。右側(cè)斜率一般是指峰值時(shí)間后1 min曲線的斜率，其絕對(duì)值越小，面粉的耐揉性越好[24]。由表1可知，隨著螺旋藻粉的添加，右側(cè)斜率的絕對(duì)值整體呈增大趨勢，說明螺旋藻粉的加入使面團(tuán)體系不穩(wěn)定，耐揉性變差。

從揉混性質(zhì)來看，螺旋藻粉的添加總體上提高了面團(tuán)的吸水率、面團(tuán)形成時(shí)間和峰值曲線面積，形成面團(tuán)所需的能量增加，從揉混數(shù)據(jù)來看，少量添加螺旋藻粉能增強(qiáng)面團(tuán)耐揉強(qiáng)度，但添加量較高時(shí)面團(tuán)的耐揉性變差。

2.2 螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)拉伸特性的影響

面團(tuán)拉伸特性是指面團(tuán)受力后發(fā)生形變，外力消失后，面團(tuán)表現(xiàn)出的彈性和可塑性[25]。拉斷力可以反映面團(tuán)的強(qiáng)度，拉斷距離可以反映面團(tuán)的延展性和可 塑性[26]。由圖2可知，添加螺旋藻粉后，面團(tuán)的拉斷力增加，拉斷距離降低。此結(jié)果表明螺旋藻粉的添加增強(qiáng)了面團(tuán)強(qiáng)度，增大了面團(tuán)被拉斷所需要的阻力，這和揉混特性中螺旋藻粉的加入增大了峰值曲線面積的結(jié)果一致，這可能是因?yàn)槁菪宸壑械纳攀忱w維吸水后發(fā)生膨脹，填充在面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)中，增加了面團(tuán)的強(qiáng)度[27]；同時(shí)，螺旋藻粉的加入阻礙了面團(tuán)面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，蛋白分子間的作用力降低，使面團(tuán)的延展性降低，拉斷距離降低。田海娟等[28]的研究表明，紫蘇葉中膳食纖維含量較高，會(huì)增大面團(tuán)的拉斷阻力，降低面團(tuán)的延展度，與本研究結(jié)果一致。張?jiān)虑傻萚29]指出，香菇粉阻塞了面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使面團(tuán)變硬，導(dǎo)致面團(tuán)的拉斷阻力變大，延伸度變小。

圖2 螺旋藻粉添加量對(duì)面團(tuán)拉伸性能的影響Fig.2 Effect of Spirulina powder addition on tensile properties of dough

2.3 螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)濕面筋含量的影響

面粉揉混特性和面團(tuán)流變學(xué)性質(zhì)的變化可能與面筋蛋白的含量和強(qiáng)度有關(guān)[30]。由圖3可知，添加螺旋藻粉后，混粉面團(tuán)濕面筋含量顯著降低（P＜0.05），添加量高于6%后濕面筋含量下降趨勢愈發(fā)迅速。直觀來看，這是因?yàn)槁菪宸廴〈瞬糠中←湻郏軌蛐纬蓾衩娼畹柠湽鹊鞍缀望湸既艿鞍缀拷档?。為了進(jìn)一步說明螺旋藻粉添加對(duì)面筋形成的影響，將混粉面團(tuán)的濕面筋含量與除去螺旋藻粉的小麥粉面團(tuán)（即100%、98%、96%、94%、92%、90%小麥粉）的濕面筋含量對(duì)比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)螺旋藻粉的添加量為2%和4%時(shí)，混粉面團(tuán)濕面筋含量相對(duì)于98%和96%的純小麥粉面團(tuán)，濕面筋含量并沒有顯著降低，說明螺旋藻粉添加量為2%和4%時(shí)，其對(duì)面筋蛋白形成的負(fù)面影響較小。但當(dāng)螺旋藻粉的添加量達(dá)到6%和8%時(shí)，混粉面團(tuán)濕面筋含量明顯低于小麥粉面團(tuán)的濕面筋含量，這表明面團(tuán)濕面筋含量的區(qū)別不僅在于面筋蛋白數(shù)量，螺旋藻粉添加量過多，會(huì)破壞麥醇溶蛋白和麥谷蛋白之間的交聯(lián)，阻礙面筋的形成，還可能會(huì)導(dǎo)致部分面筋蛋白無法與其他面筋蛋白相互作用，在沖洗過程中被沖去，從而使混粉濕面筋含量顯著下降。添加8%、10%螺旋藻粉的面團(tuán)基本洗不出面筋，說明該添加量條件下小麥面筋蛋白難以形成完整的面筋網(wǎng)絡(luò)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將螺旋藻粉的最高添加量限定在8%以下，在面筋蛋白的研究中螺旋藻粉的最高添加量為6%。

圖3 添加螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)濕面筋含量的影響Fig.3 Effect of Spirulina powder on wet gluten content of dough

2.4 螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的影響

面團(tuán)是由面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)和鑲嵌在面筋蛋白中的淀粉顆粒組成的系統(tǒng)[31]。為了直觀觀察螺旋藻粉對(duì)面筋網(wǎng)絡(luò)和面團(tuán)結(jié)構(gòu)的影響，分別使用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察面團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)。由于螺旋藻粉本身為綠色，面筋蛋白染色后也呈綠色，為了區(qū)分兩者，分別對(duì)面團(tuán)進(jìn)行僅將淀粉顆粒染色和淀粉、蛋白同時(shí)染色兩種處理方式進(jìn)行對(duì)照。

由圖4可明顯觀察到，在僅將淀粉顆粒染色的面團(tuán)中，淀粉顆粒呈紫色，螺旋藻粉呈淺綠色，隨著螺旋藻粉添加量的增加，面團(tuán)體系中的淀粉濃度被明顯稀釋，這也證實(shí)了螺旋藻粉中的淀粉含量較少。對(duì)面團(tuán)的淀粉和蛋白均進(jìn)行了染色處理后，淀粉顆粒呈紫色，面筋蛋白呈深綠色，螺旋藻粉呈淺綠色，但多被深綠色的面筋蛋白包裹和覆蓋。染色照片可以清晰看到不添加螺旋藻粉的小麥粉面團(tuán)有完整連續(xù)的綠色面筋網(wǎng)絡(luò)，淀粉顆粒均勻分布于面筋網(wǎng)絡(luò)之間，從掃描電子顯微圖也可以看到淀粉顆粒鑲嵌于面筋網(wǎng)絡(luò)之中。當(dāng)螺旋藻粉添加量為2%、4%時(shí)，從光學(xué)顯微圖可以看到綠色的面筋網(wǎng)絡(luò)有序性變差，但更加連續(xù)和明顯，包裹住了大部分的淀粉顆粒（圖4B2、B3）。面團(tuán)的掃描電子顯微圖顯示蛋白質(zhì)形成網(wǎng)絡(luò)黏結(jié)交聯(lián)狀態(tài)，面團(tuán)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)緊密均勻，淀粉顆粒被面筋蛋白緊緊包裹和覆蓋。當(dāng)螺旋藻粉的添加量為6%、8%時(shí)，光學(xué)顯微圖顯示面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不再連續(xù)，被破壞成“節(jié)狀”，部分淀粉顆粒重新顯露出來（圖4B4、B5），掃描電子顯微圖也顯示出面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)不再完整，脆弱的面筋結(jié)構(gòu)不能完全包裹住淀粉顆粒，甚至出現(xiàn)大量的空洞（圖4C中紅圈標(biāo)注）?？赡苁且?yàn)殡S著螺旋藻粉的增多，面筋蛋白質(zhì)被稀釋，影響了面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性，因此出現(xiàn)裂縫。同時(shí)，面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果很好地解釋了適量的螺旋藻粉添加提高了面團(tuán)的強(qiáng)度，而過量的螺旋藻粉使面團(tuán)和面筋的結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而對(duì)面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生不利影響。這也解釋了螺旋藻粉添加量高于6%的面團(tuán)在揉混測試中右側(cè)斜率和8 min帶寬降低，濕面筋含量顯著下降以及面團(tuán)拉伸特性變差的現(xiàn)象。

圖4 螺旋藻粉添加量對(duì)面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of Spirulina powder addition on the microstructure of dough

2.5 螺旋藻粉對(duì)面團(tuán)中游離巰基和二硫鍵含量的影響

小麥粉在和面過程中吸收水分，面筋蛋白與水發(fā)生水化作用，游離巰基彼此相互結(jié)合形成二硫鍵，或與二硫鍵相互交換[18]。面筋蛋白由麥谷蛋白和麥醇溶蛋白通過二硫鍵交聯(lián)而成，游離巰基和二硫鍵的含量可以反映面筋網(wǎng)絡(luò)的形成程度，影響著面制品的品質(zhì)[32]。由圖5可知，與小麥面團(tuán)相比，添加螺旋藻粉的面團(tuán)游離巰基含量增加，二硫鍵含量顯著下降（P＜0.05）。這一方面是因?yàn)槁菪宸鄞媪瞬糠中←湻?，面筋蛋白含量減少，另一方面因?yàn)槁菪宸鄣奶砑酉♂屃嗣娼畹鞍?，阻礙了面筋蛋白二硫鍵的形成。朱璠等[33]研究發(fā)現(xiàn)麩皮膳食纖維使得面團(tuán)中的二硫鍵含量下降，游離巰基含量增多，也是由于面筋蛋白被相對(duì)稀釋，交聯(lián)作用減弱。有研究發(fā)現(xiàn)[34]，面筋蛋白還原程度越高，二硫鍵斷裂越多，面團(tuán)的延展性越差。本研究結(jié)果也解釋了螺旋藻粉添加面團(tuán)拉斷距離顯著下降的現(xiàn)象。

圖5 面團(tuán)中游離巰基和二硫鍵含量的變化Fig.5 Changes in contents of free sulfydryl and disulfide bonds in dough

2.6 面筋蛋白的SDS-PAGE分析

根據(jù)分子質(zhì)量大小，麥谷蛋白可以分為高分子質(zhì)量麥谷蛋白（HMW-GS）（65～90 kDa）和低分子質(zhì)量麥谷蛋白（LMW-GS）（30～60 kDa），麥醇溶蛋白分子質(zhì)量多在30～75 kDa之間[35]。為了方便分析，根據(jù)麥谷蛋白的分子質(zhì)量分區(qū)，將蛋白分為高于60 kDa的HMW區(qū)域和30～60 kDa的LMW區(qū)域，如圖6所示。

圖6 面筋蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE patterns of gluten proteins in dough with Spirulina powder

螺旋藻是一類蛋白含量較高的原料，其蛋白含量大于60%。由圖6可知，螺旋藻粉的蛋白分子質(zhì)量在50 kDa以下，Quantity One分析結(jié)果顯示分子質(zhì)量18 kDa的蛋白約占總蛋白的62.69%，其余蛋白主要分布在30～50 kDa之間的低分子質(zhì)量區(qū)。通過Quantit One對(duì)兩個(gè)區(qū)域條帶進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明相對(duì)于小麥面團(tuán)而言，螺旋藻粉的面團(tuán)面筋蛋白的高分子質(zhì)量區(qū)域蛋白含量明顯下降，低分子質(zhì)量區(qū)域蛋白含量有所增加，添加6%螺旋藻粉的面團(tuán)面筋蛋白的高分子質(zhì)量蛋白降低為小麥面團(tuán)的一半，低分子質(zhì)量區(qū)域的蛋白含量也稍有下降。說明螺旋藻粉的添加阻礙了高分子質(zhì)量面筋蛋白的形成，從而阻礙了面筋網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)展并影響面團(tuán)流變學(xué)特性，這一結(jié)果與面團(tuán)揉混特性、濕面筋含量、微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

2.7 螺旋藻粉對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

由圖7可知，添加螺旋藻粉后，面筋蛋白的紅外光譜圖與原小麥粉面團(tuán)面筋蛋白大致相似，但整體上降低了面筋蛋白的譜圖強(qiáng)度，包括3323 cm-1處羥基的伸縮振動(dòng)峰[36]、1652 cm-1處羰基的伸縮振動(dòng)峰[37]、1539 cm-1處—NH的彎曲振動(dòng)峰以及1360～1320 cm-1處C—N的伸縮振動(dòng)峰[38]，這些都是蛋白質(zhì)酰胺結(jié)構(gòu)的組成部分。未添加螺旋藻粉時(shí)，蛋白質(zhì)通過谷氨酰胺的殘基相互作用形成酰胺鍵，肽鏈之間通過氫鍵連接，添加螺旋藻粉后，促進(jìn)水與氨基酸、肽鏈、面筋蛋白等競爭分子間、分子內(nèi)的—OH、C＝O、—NH等位點(diǎn)的結(jié)合，減弱了谷氨酰胺殘基以及肽鏈氫鍵之間的相互作用，導(dǎo)致肽鏈之間因分子間作用力減弱而伸直，面筋蛋白的無序結(jié)構(gòu)增多，從而破壞了面筋蛋白結(jié)構(gòu)[39]。在1500～1400 cm-1區(qū)間的吸收峰表示糖類C—H 彎曲振動(dòng)，與其他樣品相比，添加6%螺旋藻粉的面團(tuán)面筋蛋白出現(xiàn)較明顯的吸收峰，可能是螺旋藻粉中獨(dú)有的多糖成分的吸收峰[40]。

圖7 面筋蛋白的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of gluten proteins in dough with Spirulina powder

紅外圖譜中，酰胺I帶（1700～1600 cm-1）為C＝O、C—N的伸縮振動(dòng)、N—H彎曲振動(dòng)的偶合，包含了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，常用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分 析[37]。此光譜區(qū)域中，1665～1652 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1640～1610 cm-1和1700～1685 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)，1682～1665 cm-1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1652～1644 cm-1為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[41]。α-螺旋結(jié)構(gòu)依靠鏈內(nèi)的氫鍵保持穩(wěn)定，β-折疊由兩條及以上伸展的多肽鏈依靠鏈間的氫鍵相連，β-折疊結(jié)構(gòu)比α-螺旋更加穩(wěn)定[42]。通常認(rèn)為β-折疊和α-螺旋屬于蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲屬于無序結(jié)構(gòu)[43]。根據(jù)紅外光譜圖，利用Peakfit軟件對(duì)酰胺I帶進(jìn)行處理和分析，得到不同樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。由圖8可知，與小麥粉面筋蛋白相比，隨著螺旋藻粉添加量的增加，面筋蛋白中α-螺旋和β-折疊相對(duì)含量降低，說明螺旋藻粉的添加可能破壞了多肽鏈鏈間的氫鍵。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對(duì)含量升高?？傮w來講，添加螺旋藻粉后，面筋蛋白中有序結(jié)構(gòu)降低，無序結(jié)構(gòu)增多的現(xiàn)象明顯，這可與面筋網(wǎng)絡(luò)顯微圖互相印證。

圖8 面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量變化Fig.8 Changes in relative content of secondary structure in gluten proteins

2.8 螺旋藻粉在面筋形成中的作用模型假設(shè)

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果及現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)在小麥粉面團(tuán)中少量添加螺旋藻粉能提高面團(tuán)的強(qiáng)度，這可能是由于螺旋藻粉中的膳食纖維吸水后填充在面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)中，強(qiáng)化了面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)的黏結(jié)狀態(tài)，提高了面團(tuán)強(qiáng)度；但添加較多的螺旋藻粉時(shí)，會(huì)阻礙面筋蛋白的交聯(lián)，從而弱化面筋，減少面筋蛋白的有序結(jié)構(gòu)，使面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)劣變。其作用模型假設(shè)如圖9所示。

3 結(jié)論

研究了螺旋藻粉對(duì)小麥粉面團(tuán)揉混特性、拉伸特性、面團(tuán)濕面筋含量、微觀結(jié)構(gòu)、面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及面筋蛋白亞基組成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)少量螺旋藻粉的添加總體上提高了面團(tuán)的吸水率、面團(tuán)形成時(shí)間和峰值曲線面積，形成面團(tuán)所需的能量增加，面筋強(qiáng)度增強(qiáng)，面團(tuán)延展性降低，但添加量較高時(shí)面團(tuán)的耐揉性變差。螺旋粉添加量高于6%時(shí)，面團(tuán)游離巰基含量顯著增加，二硫鍵含量顯著下降，濕面筋含量顯著下降，面筋網(wǎng)絡(luò)破壞嚴(yán)重，面筋蛋白中HMW-GS含量降低；LMWGS含量增加，同時(shí)面筋蛋白中有序結(jié)構(gòu)降低，無序結(jié)構(gòu)增多。推測面團(tuán)中少量添加螺旋藻粉，其膳食纖維吸水后填充在面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)中，增強(qiáng)了面團(tuán)強(qiáng)度，隨著但螺旋藻粉添加量的提高，面筋蛋白的交聯(lián)受到阻礙，從而弱化面筋，導(dǎo)致面團(tuán)流變學(xué)性質(zhì)發(fā)生劣變。