張 藝,張 繼,葉彩云,王瑞華,黨 璇

0 引言

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種以慢性無排卵、高雄激素血癥為特征的內(nèi)分泌異常的疾病,患者臨床表現(xiàn)為多毛、經(jīng)期不規(guī)律、不孕[1-2]。患者卵巢增大、白膜增厚,并伴有顆粒細胞黃素化。顆粒細胞是雌激素、孕激素的主要來源,是組成卵泡的最大細胞群,支撐卵母細胞,在PCOS中發(fā)揮重要作用[3]。暴露于雄激素下的顆粒細胞可導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯[4]。在小鼠PCOS模型中,顆粒細胞增殖受限,大量凋亡,無法為卵泡提供營養(yǎng)[5]。因此促進顆粒細胞的存活增殖是恢復(fù)PCOS模型卵泡正常發(fā)育的方式之一。研究顯示,芍藥苷在大鼠體內(nèi)可減輕脫氫表雄酮(DHEA)誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵巢纖維化[6]。芍藥苷能否影響PCOS大鼠顆粒細胞仍有待研究。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1-α(PGC-1α)為線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子,PGC-1α在卵巢顆粒細胞中表達降低與卵巢顆粒細胞損傷有關(guān),可能是PCOS發(fā)生發(fā)展的重要原因[7]。PGC-1α由線粒體能量代謝相關(guān)調(diào)節(jié)因子控制,如單磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1),AMPK和SIRT1分別通過磷酸化和脫乙?；苯佑绊慞GC-1α活性[8]。研究顯示,AMPK/SIRT1信號通路在PCOS小鼠卵巢顆粒細胞中被抑制,與卵巢中的顆粒細胞數(shù)量減少有關(guān),且可能是PCOS中胰島素抵抗的分子機制,可作為開發(fā)改善PCOS代謝和生殖功能的治療靶點[9]。因此,調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路可被視為對抗PCOS的潛在藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑 SPF級SD雌性大鼠10只,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2022-0063。芍藥苷、脫氫表雄酮(DHEA)購自上海源葉生物科技有限公司;Compound C(AMPK抑制劑)、EX527(SIRT1抑制劑)購自MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 PCOS模型建立 10只大鼠模型建立前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,按照隨機數(shù)字表法選取5只作為對照組,剩余大鼠皮下注射DHEA(6 mg/100 g),連續(xù)注射21 d,從第16天開始連續(xù)4 d觀察大鼠陰道涂片,連續(xù)出現(xiàn)角質(zhì)細胞為造模成功[10]。對照組以等量豆油代替。

1.2.2 卵巢顆粒細胞的分離與鑒定 沖洗大鼠卵巢組織(生理鹽水),去除脂肪與輸卵管等組織,DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),穿刺竇卵泡使顆粒細胞釋放于培養(yǎng)基內(nèi),過濾純化,將顆粒細胞重懸、過濾。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細胞貼壁后,去除未貼壁細胞,每2天更換培養(yǎng)基,鏡下觀察細胞形態(tài)。免疫細胞化學(xué)法鑒定顆粒細胞:制備細胞爬片,洗滌、固定,過氧化氫孵育、封閉,加入兔抗鼠促卵泡激素受體(FSHR)(1∶200)(顆粒細胞標(biāo)志物),孵育過夜,清洗,加入相應(yīng)二抗(1∶2 000),熒光顯微鏡拍照。

1.2.3 細胞分組 取培養(yǎng)對數(shù)生長期顆粒細胞,正常大鼠顆粒細胞作為對照組,將模型大鼠顆粒細胞分為PCOS組、芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組[6]、芍藥苷高濃度+Compound C組[11]、芍藥苷高濃度+EX527組[12],芍藥苷低、高濃度組分別添加200 μg/ml、800 μg/ml芍藥苷,芍藥苷高濃度+Compound C組在800 μg/ml芍藥苷基礎(chǔ)上添加20 μmol/L的Compound C,芍藥苷高濃度+EX527組在800 μg/ml芍藥苷基礎(chǔ)上添加100 μmol/L EX527,培養(yǎng)細胞。

1.2.4 卵巢顆粒細胞雌二醇(E2)和孕酮(P)含量 收集“1.2.3”中各組顆粒細胞,接種到24孔板,每孔105個細胞,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后收集細胞培養(yǎng)液,終止前3 h 加入100 ng/ml FSH,放射免疫法測定E2與P含量。

1.2.5 CCK8法測定顆粒細胞活性 收集“1.2.3”中各組顆粒細胞,按照5 000/孔細胞數(shù)量接種至96孔,48 h后添加CCK-8試劑孵育,4 h后酶標(biāo)儀測定450 nm處光密度(OD450)。

1.2.6 克隆形成試驗 收集“1.2.3”中各組顆粒細胞,接種至6孔板中(200個/孔),2周后觀察克隆形成,棄上清,加入甲醇固定15 min,加入Giemsa染色液,為紫色,拍照并計數(shù)。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 按照“1.2.3”中分組方法將顆粒細胞接種于6孔板(5×105/孔),每組設(shè)置6個復(fù)孔,加入Annexin V-FITC和PI 染料,避光孵育20 min,流式細胞儀檢測。

1.2.8 Western blot法測定細胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達 提取細胞總蛋白并定量,SDS-PAGE電泳后,將部分蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉(5%脫脂奶粉),添加兔抗p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、SIRT1(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、GAPDH(作為內(nèi)參,稀釋比1∶5 000),孵育過夜,添加二抗,孵育1 h,ECL試劑進行顯色后經(jīng)凝膠成像儀曝光、觀察,Image-J軟件分析蛋白含量,每組設(shè)置3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 顆粒細胞的鑒定 對照組大鼠卵巢顆粒細胞呈多邊形或梭形,細胞間由偽足連接在一起(圖1A);PCOS組大鼠卵巢顆粒細胞呈多形性或纖維狀(圖1B);免疫細胞化學(xué)法檢測結(jié)果顯示,對照組與PCOS組大鼠顆粒細胞FSHR均呈陽性表達(圖1C-D)。

圖1 顆粒細胞形態(tài)以及免疫熒光圖注:A.培養(yǎng)3 d的對照組大鼠卵巢顆粒細胞形態(tài);B.培養(yǎng)3 d的PCOS組大鼠卵巢顆粒細胞形態(tài);C.免疫細胞化學(xué)法檢測對照組大鼠卵巢顆粒細胞FSHR陽性表達;D.免疫細胞化學(xué)法檢測PCOS組大鼠卵巢顆粒細胞FSHR陽性表達

2.2 各組卵巢顆粒細胞雌激素、孕激素分泌情況 與對照組相比,PCOS組卵巢顆粒細胞E2、P水平降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組及芍藥苷高濃度組卵巢顆粒細胞的E2、P水平升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組卵巢顆粒細胞的E2、P水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組卵巢顆粒細胞E2、P水平測定

2.3 各組卵巢顆粒細胞活性情況 與對照組相比,PCOS組顆粒細胞OD450值降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組顆粒細胞OD450值升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組顆粒細胞OD450值降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組顆粒細胞OD450值情況

2.4 各組卵巢顆粒細胞克隆形成數(shù)情況 與對照組相比,PCOS組顆粒細胞克隆形成數(shù)降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組顆粒細胞克隆形成數(shù)升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組顆粒細胞克隆形成數(shù)降低(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組顆粒細胞克隆形成數(shù)比較

圖2 各組卵巢顆粒細胞克隆形成圖注:PCOS:多囊卵巢綜合征;Compound C:AMPK抑制劑;EX527:SIRT1抑制劑

2.5 各組卵巢顆粒細胞凋亡情況 與對照組相比,PCOS組顆粒細胞凋亡率升高(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組顆粒細胞凋亡率降低(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組顆粒細胞凋亡率升高(P<0.05),見表4、圖3。

表4 各組顆粒細胞凋亡情況

圖3 各組顆粒細胞凋亡情況注:PCOS:多囊卵巢綜合征;Compound C:AMPK抑制劑;EX527:SIRT1抑制劑

2.6 各組卵巢顆粒細胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達的比較 與對照組相比,PCOS組卵巢顆粒細胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平降低(P<0.05);與PCOS組相比,芍藥苷低濃度組、芍藥苷高濃度組卵巢顆粒細胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平升高(P<0.05);與芍藥苷高濃度組相比,芍藥苷高濃度+Compound C組、芍藥苷高濃度+EX527組卵巢顆粒細胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平降低(P<0.05),見表5、圖4。

表5 各組卵巢顆粒細胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達情況

圖4 各組卵巢顆粒細胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達注:A.對照組;B.PCOS組;C.芍藥苷低濃度組;D.芍藥苷高濃度組;E.芍藥苷高濃度+Compound C組;F.芍藥苷高濃度+EX527組

3 討論

PCOS是育齡期女性常見的內(nèi)分泌失調(diào)疾病,患者表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、不孕、痤瘡、多毛,影響女性生殖健康。顆粒細胞是構(gòu)成卵泡的細胞群,為卵母細胞提供營養(yǎng),是后續(xù)雌激素、孕激素的關(guān)鍵來源,對胚胎植入子宮內(nèi)膜提供支持,其豐富程度與卵子質(zhì)量密切相關(guān)[13-14]。在高雄激素刺激下,顆粒細胞數(shù)量不足,卵泡發(fā)育不良,也是患者不孕的重要原因。因此,去除刺激并恢復(fù)顆粒細胞的正常增殖是PCOS疾病治療的方式之一。

芍藥苷是來源于芍藥科植物的活性物質(zhì),具有抗癌、抗自由基損傷、抑制細胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性、免疫調(diào)節(jié)等活性,且芍藥苷毒性很低,對大鼠心、肝、脾、肺等多種臟器無明顯毒副作用。芍藥甘草湯是PCOS的治療名方,程瑤[15]研究顯示,在PCOS疾病狀態(tài)下,大鼠代謝異常,芍藥苷草湯的主要成分-芍藥苷的生物利用度顯著下降。于春玲等[16]研究顯示,芍藥苷可調(diào)整經(jīng)期前綜合征大鼠血清雌激素水平以及大腦皮層雌激素受體表達。以上研究均表明,芍藥苷可能在PCOS大鼠顆粒細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。本研究中,經(jīng)芍藥苷處理大鼠,血清E2、P水平升高,提示芍藥苷對促進PCOS大鼠的激素分泌有效。將大鼠顆粒細胞分離并培養(yǎng),經(jīng)鑒定,PCOS模型大鼠卵巢顆粒細胞FSHR陽性率升高,FSHR是顆粒細胞的特異性標(biāo)志物,提示制備的顆粒細胞具備正常形態(tài)。給予不同濃度芍藥苷處理,發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的活性增加,凋亡率下降,且在兩個濃度中細胞活性與凋亡率存在差異。細胞增殖升高與凋亡的降低也充分證明了芍藥苷對卵巢顆粒細胞的作用。但芍藥苷發(fā)揮促卵巢顆粒細胞增殖,抑制顆粒細胞凋亡的作用機制仍有待進一步分析。

AMPK是一種細胞代謝傳感器,在保護細胞功能方面起著至關(guān)重要的作用。研究顯示,PCOS大鼠不孕可能與AMPK通路受阻導(dǎo)致的線粒體損傷有關(guān)[17]。鄧煜等[18]研究顯示,白藜蘆醇可通過激活A(yù)MPK通路抑制多囊卵巢綜合征大鼠卵巢顆粒細胞自噬。以上研究表明,AMPK可在PCOS中發(fā)揮作用。SIRT1可參與DNA修復(fù)、細胞存活等細胞過程,其在卵母細胞的發(fā)育以及衰老中發(fā)揮作用[19]。PGC-1α是一種多功能轉(zhuǎn)錄輔激活因子,可參與調(diào)解線粒體生物發(fā)生的多種核受體和轉(zhuǎn)錄因子的活性,在高能量需求的組織中高表達,調(diào)控能量代謝,與雌激素受體相結(jié)合,參與卵巢癌的調(diào)控[20]。金小琴等[21]研究顯示,PGC-1α對大鼠卵巢顆粒細胞代謝有影響。

本研究中,PCOS大鼠卵巢顆粒細胞AMPK受抑制,與正常大鼠卵巢顆粒細胞比較,p-AMPK/AMPK值降低,SIRT1、PGC-1α蛋白表達降低,提示AMPK/SIRT1/PGC-1α通路可能在卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡中發(fā)揮作用。為探究芍藥苷能否通過調(diào)整此通路影響顆粒細胞的增殖與凋亡,本研究還檢測了芍藥苷處理后的顆粒細胞,發(fā)現(xiàn)p-AMPK/AMPK值升高,SIRT1、PGC-1α蛋白表達升高,提示芍藥苷可能通過調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路發(fā)揮作用,為驗證此猜想,在芍藥苷高濃度基礎(chǔ)上分別添加AMPK抑制劑(Compound C)、SIRT1抑制劑(EX527),發(fā)現(xiàn)芍藥苷對顆粒細胞的作用均被逆轉(zhuǎn),此結(jié)果驗證了本研究開始的猜想。

綜上所述,芍藥苷可能通過調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促進PCOS卵巢顆粒細胞增殖,并抑制細胞凋亡。