◎ 張 蕾

（唐傳生物科技（廈門）有限公司，福建 廈門 361026）

糖類物質(zhì)是多羥基醛、多羥基酮及其縮聚物的總稱，又稱為碳水化合物。糖類物質(zhì)是自然界分布最廣泛、數(shù)量最多的一類化合物，由植物通過光合作用合成，屬于天然合成化合物。自然界中，幾乎所有的生物體內(nèi)均含有糖類物質(zhì)。其中，植物體內(nèi)含糖類物質(zhì)最多，占其干重的50%～90%，動(dòng)物體中含糖較少，僅占組織器官干重的2%，但是卻對(duì)動(dòng)物的生命活動(dòng)起著重要作用。

我國(guó)在戰(zhàn)國(guó)時(shí)期就開始食用蔗糖，到晉朝時(shí)有了制糖技術(shù)。北宋時(shí)期，王灼撰寫了我國(guó)第一部制糖專著《糖霜譜》，詳細(xì)記錄了自甘蔗栽培到制作冰糖的全過程，揭開了制糖的新篇章。雖然人們很早就掌握了甘蔗的栽培、糖的提取和食用技術(shù)，但是直到19 世紀(jì)后期，隨著科學(xué)的發(fā)展，人們才對(duì)糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有了認(rèn)識(shí)。20 世紀(jì)70 年代之后，隨著現(xiàn)代分離、分析技術(shù)的迅速發(fā)展，人們獲得了更多糖的結(jié)構(gòu)信息；而細(xì)胞生物學(xué)的飛速發(fā)展，不斷揭示了糖的諸多生物學(xué)功能。尤其是近年來的研究，使人們對(duì)糖有了更深的認(rèn)識(shí)。糖是除核酸和蛋白質(zhì)之外另一類重要的生命物質(zhì)，是生命體內(nèi)重要的信息分子，參與了多細(xì)胞生命的受精、著床、分化、發(fā)育、免疫、感染、癌變和衰老等全部時(shí)間和空間過程。糖在細(xì)胞之間的相互識(shí)別、相互作用，水和電解質(zhì)的輸送，癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，機(jī)體的免疫和免疫抑制，以及細(xì)胞凝集等生物過程中都起著關(guān)鍵作用[1]。

糖類分為單糖、雙糖、多糖，單糖是糖類組成的基本單元。分析多糖時(shí)，需先將其分解為單糖、雙糖、低聚糖等再進(jìn)行檢測(cè)分析，表明對(duì)單糖與雙糖展開分析是糖類分析的基礎(chǔ)。因此，本文基于當(dāng)前單糖、雙糖研究現(xiàn)狀，就單糖、雙糖分析測(cè)定方法進(jìn)行概述，以期為日后單糖和雙糖分析研究提供參考。

1 單糖、雙糖分析方法

1.1 化學(xué)方法

常用的化學(xué)方法有苯酚-硫酸法[2]，該方法基于490 nm 波長(zhǎng)下芳香絡(luò)合物吸光度與糖含量的線性關(guān)系測(cè)定并計(jì)算得到總糖量。苯酚-硫酸法簡(jiǎn)單、快速，適用于復(fù)雜樣品中單糖、多糖測(cè)定，但由于不同單糖的吸收率不同，這種方法只能在特定條件下應(yīng)用。

化學(xué)方法多是基于糖的還原性來分析單糖和多糖，而測(cè)定還原糖最常使用的是酮基反應(yīng)，主要有蘭-埃農(nóng)法、奧夫奈爾法、奈特-艾倫法、姆松-華爾格法，反應(yīng)后可用分光光度法檢測(cè)或稱重法檢測(cè)[3-4]。部分還原糖反應(yīng)可以分為醛糖反應(yīng)和酮糖反應(yīng)。間苯二酚反應(yīng)是酮己糖的特征反應(yīng)，在酸性溶液中將糖轉(zhuǎn)化為羥甲基糠醛，與間苯二酚反應(yīng)，得到的紅色配合物在398 nm 和480 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)特征吸收，該方法已成功應(yīng)用于藥物樣品中乳果糖的光度定量測(cè)定[5]。乳果糖在酸性條件下的水解產(chǎn)物還能與半胱氨酸鹽酸鹽-色氨酸試劑反應(yīng)，生成在518 nm 有最大吸收的粉色復(fù)合物，該反應(yīng)也已應(yīng)用于藥品中乳果糖的測(cè)定[6]。分析復(fù)雜組分時(shí)，如果存在其他還原性物質(zhì)，則會(huì)對(duì)糖的檢測(cè)產(chǎn)生較大影響。

1.2 物理方法

物理方法的研究對(duì)象一般為液體，如旋光法、液體比重測(cè)定法和折光測(cè)定法。由于每種糖在總液體密度、折射率和光束偏振中的作用都是單獨(dú)的，并非化學(xué)計(jì)量反應(yīng)中簡(jiǎn)單的相加，所以物理方法局限于僅受單糖影響折射率的雙糖樣品[7-8]。這些物理方法測(cè)量簡(jiǎn)單且設(shè)備價(jià)格不高，仍被廣泛使用于制糖工業(yè)。此外，還有常用的糖量計(jì)，即特別設(shè)計(jì)的旋光計(jì)和折光計(jì)，可以根據(jù)蔗糖濃度的折射率或旋轉(zhuǎn)角度重新計(jì)算比例，分析過程簡(jiǎn)單、使用方便。

1.3 生物方法

糖類物質(zhì)參與多種酶催化的生物轉(zhuǎn)化過程，因此可利用酶的高效性和專一性進(jìn)行分析。LUZZANA 等[9]通過酶的反應(yīng)，使牛奶中乳糖和乳果糖含量與pH 值成正比，分別在不到2 min 和4 min 的時(shí)間內(nèi)對(duì)乳糖和乳果糖直接進(jìn)行分析，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，乳果糖的靈敏度可達(dá)0.1 mmol·L-1。VARGAS 等[10]在轉(zhuǎn)化酶/果糖脫氫酶INV/FDH 系統(tǒng)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了蔗糖雙酶生物傳感器，將該傳感器與果糖和葡萄糖生物傳感器相結(jié)合，可在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)測(cè)定蔗糖、果糖、葡萄糖。

雖然已有多種使用酶和生物催化材料對(duì)各種糖進(jìn)行生物識(shí)別分析，但迄今為止還沒有開發(fā)出用于糖類物質(zhì)測(cè)定的免疫測(cè)定方法。這是因?yàn)槟承┨侨狈γ庖咴?，無法培育抗體，而有的糖如麥芽糖和乳糖，雖有抗體可用，但其分析應(yīng)用在文獻(xiàn)中未見報(bào)道。

1.4 儀器分析法

1.4.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是單糖、雙糖分析檢測(cè)中最常用的方法，技術(shù)較成熟，穩(wěn)定性好，是國(guó)際AOAC 分析化學(xué)家協(xié)會(huì)推薦的常規(guī)糖類物質(zhì)分析的官方技術(shù)。高效液相色譜儀可耦合的檢測(cè)器較多，常用的有紫外吸收檢測(cè)器（Ultraviolet Detector，UV）、熒光檢測(cè)器（Fluorescence Detectors，F(xiàn)LD）、示差折光檢測(cè)器（Refractive Index Detector，RID）、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）及荷電氣溶膠檢測(cè)器（Charged Aerosol Detection，CAD）等。

（1）紫外吸收檢測(cè)器。紫外吸收檢測(cè)器是高效液相色譜儀應(yīng)用最多、最廣的檢測(cè)器，它是依據(jù)光吸收原理，以適當(dāng)?shù)墓饴泛碗娐?，輸出一個(gè)與試樣組分濃度成正比的紫外-可見光吸收信號(hào)，其結(jié)構(gòu)與一般光度計(jì)相似。紫外吸收檢測(cè)要求被檢測(cè)樣品組分有紫外可見光吸收，而使用的流動(dòng)相無吸收，或在被測(cè)組分吸收波長(zhǎng)處無吸收。而單糖和雙糖沒有紫外吸收，需要經(jīng)過衍生化處理，使待測(cè)組分帶上生色團(tuán)后才能進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)[11]。目前，常見的紫外衍生化試劑有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、4- 氨 基 苯 甲酸乙酯（4-aminobenzoic acid ethyl ester benzocaine，ABEE）、 異 硫 氰 酸 苯 酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、甲氧基苯胺以及對(duì)硝基甲苯氯等。

現(xiàn)今，PMP 反應(yīng)條件較溫和，無需酸催化，是最為常用的衍生化試劑。周熙等[12]將葛仙米水解處理后，用PMP 衍生水解多糖后用HPLC-UV 法測(cè)試，結(jié)果顯示，葛仙米多糖提取物中主要含有甘露糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖，該方法線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確性、重復(fù)性和專屬性好。SPIRO 等[13]先將中性糖轉(zhuǎn)化為氨基葡萄糖，經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生化處理后，用紫外檢測(cè)器測(cè)定糖綴合物中存在的中性糖和己糖胺，該方法靈敏度高，且對(duì)在糖蛋白和糖肽上測(cè)定的單糖組成與先前其他技術(shù)相比較具優(yōu)勢(shì)。GOMIS 等[14]用ABEE 對(duì)蘋果酒進(jìn)行衍生后，采用HPLC-UV 法測(cè)定醛糖（葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、焦糖和鼠李糖）和糖醛酸（d-葡萄糖醛酸、d-半乳糖醛酸）含量，平均回收率為90%～102%，準(zhǔn)確度較高，RSD ＜5%。ABEE 適用于各種糖的衍生，它可以消除因旋光作用而形成的對(duì)偶物，衍生反應(yīng)無副產(chǎn)物產(chǎn)生，衍生化試劑峰在最后流出，不會(huì)干擾待測(cè)物的檢測(cè)，衍生后的物質(zhì)可直接進(jìn)樣。與其他衍生化試劑相比，ABEE 減少了衍生后處理這一步驟，進(jìn)樣更加方便。UV 檢測(cè)器靈敏度高，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫分離，但因其復(fù)雜的衍生過程，HPLC-UV 測(cè)定糖的實(shí)驗(yàn)耗時(shí)都較長(zhǎng)。

（2）熒光檢測(cè)器。FLD 適用于痕量組分和能顯示熒光的物質(zhì)檢測(cè)，而糖類無熒光特性，需衍生處理后才能進(jìn)行檢測(cè)。可用作糖類熒光衍生化試劑的有對(duì)氨基苯甲酸（Para Aminobenzoic Acid，PABA）、苯并吖啶酮-5-乙酰肼（BAAH）、芴甲氧基羰酰氯（Fluorene Methoxy Carbonyl Chloride，F(xiàn)MOC-Cl）等。PABA 是HPLC-FLD 法中最常用的衍生化試劑，XU 等[15]將多糖經(jīng)脫酯、萃取、水解、PABA 衍生，得到熒光標(biāo)記的單糖化合物，最后通過HPLC-FLD 檢測(cè)黃精和玉竹中7 種單糖，其建立的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性關(guān)系好、回收率高，為多糖的研究提供了一種可行的分析工具，對(duì)黃精和玉竹多糖的研究結(jié)果可為天然藥物工業(yè)提供一定指導(dǎo)。ZHANG 等[16]用BAAHHPLC-FLD 法處理分析寬葉羌活根、莖和葉中多糖中單糖組成，結(jié)果表明，BAAH 衍生化大大增加了單糖的疏水性，并使它們?cè)谠黾拥谋Ａ魰r(shí)間下洗脫，而寬葉羌活根、莖和葉中多糖主要由D-半乳糖和D-葡萄糖組成。林啟山等[17]用FMOC-肼和FMOC-Cl 對(duì)10 種單糖進(jìn)行衍生后用熒光檢測(cè)器測(cè)定，且用同樣的方法測(cè)定了胎球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白中寡糖鏈的單糖組成。FMOC-Cl 因有毒有害且具有腐蝕性，在糖分析處理中較少使用。FLD 選擇性好、準(zhǔn)確度高，但是與UV衍生類似，操作煩瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。

（3）示差折光檢測(cè)器。RID 通過連續(xù)測(cè)定色譜柱流出物的光折射率變化測(cè)定溶質(zhì)濃度，所以凡是與流動(dòng)相光折射率有差別的樣品都可以用其檢測(cè)。陳智毅等[18]采用HPLC-RID 法檢測(cè)5 個(gè)白色金針菇子實(shí)體中的單糖和雙糖，結(jié)果表明，這5 個(gè)樣品中共含有木糖、果糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖和乳糖7 種糖，每個(gè)樣品中各種糖含量、種類都有差異，但都以果糖和乳糖為主。劉玉峰等[19]用HPLC-RID 法檢測(cè)食品中的單糖和雙糖，外標(biāo)法定量，每份樣品測(cè)試3 次，其結(jié)果RSD 均小于5%，精密度較高，回收率＞99.7%， 準(zhǔn) 確 度 較 高。ZAKHAROVA 等[20]用HPLC-RID 法測(cè)定葡萄酒、果汁、蜂蜜、乳制品及餅干中的單糖、雙糖和甜味劑，液體樣品中葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測(cè)限為0.1 g·L-1，木糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖和山梨醇的檢測(cè)限為1 g·L-1；固體樣品中葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測(cè)限為0.1%，木糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖和山梨糖的檢測(cè)限為0.6%。RID 操作簡(jiǎn)單，對(duì)糖類靈敏度較高，是食品中應(yīng)用較多、較廣泛的方法，但其對(duì)溫度、流動(dòng)相組成變化敏感，不能梯度洗脫，檢測(cè)限與UV 相比較低，不適合含量低的雜質(zhì)糖檢測(cè)。

（4）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器先用惰性氣體霧化洗脫液，然后讓流動(dòng)相在加熱管中蒸發(fā)，最后剩下的未揮發(fā)溶質(zhì)顆粒在光散射檢測(cè)池中被檢測(cè)。NOGUEIRA 等[21]采用ELSD 對(duì)啤酒中碳水化合物的HPLC 方法進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證，分別在果糖0.05 ～5.00 g·L-1，葡萄糖0.05 ～5.00 g·L-1，麥芽糖0.05 ～15.00 g·L-1，麥芽三糖0.05 ～10.00 g·L-1，麥芽四糖0.05 ～5.00 g·L-1的線性范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，檢出限 分 別為0.005 g·L-1、0.008 g·L-1，0.010 g·L-1、0.010 g·L-1和0.010 g·L-1，RSD 為1.59%～5.95%，回收率為94 %～98.4%。林慧等[22]采用HPLC-ELSD法測(cè)定食品中的5 種糖（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖）和5 種糖醇（赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖醇），結(jié)果表明，5 種糖和5 種糖醇均在0.2 ～20.0 mg·mL-1線性關(guān)系良好，RSD ＜5%，回收率為91.53%～105.20%，靈敏度高，重現(xiàn)性好。HPLC-ELSD 法可以檢測(cè)不含發(fā)色團(tuán)的化合物，操作簡(jiǎn)單，對(duì)溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合梯度洗脫，但其靈敏度和重現(xiàn)性差，且過程需蒸發(fā)溶劑，故只能選擇有揮發(fā)性的流動(dòng)相，且樣品的揮發(fā)性必須小于流動(dòng)相揮發(fā)性。HPLC-ELSD 法是現(xiàn)今食品中糖類物質(zhì)檢測(cè)最常用的方法。

（5）荷電氣溶膠檢測(cè)器。CAD 是在檢測(cè)器內(nèi)將分析物轉(zhuǎn)化成溶質(zhì)顆粒，溶質(zhì)顆粒與帶正電荷的氮?dú)庀嘧?，電荷隨之轉(zhuǎn)移到顆粒上，溶質(zhì)顆粒再把它們攜帶的電荷轉(zhuǎn)移到收集器，然后通過高靈敏度的靜電檢測(cè)計(jì)測(cè)出溶質(zhì)顆粒的帶電量，由此產(chǎn)生的信號(hào)電流與溶質(zhì)的含量成正比。CAD 可實(shí)際應(yīng)用于任何非揮發(fā)或半揮發(fā)性化合物的測(cè)定，如藥物、碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽、類固醇和脂類等。GREMBECKA 等[23]采用HPLC-CAD法，經(jīng)Shodex Asahipak，NH2P-50 4E，5 μm殼狀顆粒填充柱（4.6 mm×250 mm）分離后，同時(shí)測(cè)定葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、赤蘚糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、山梨醇和木糖醇，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方法的線性、精密度和準(zhǔn)確度，9 種樣品的檢出限和定量限分別為0.12 ～0.44 μg·mL-1、0.40 ～1.47 μg·mL-1。張雪等[24]利用HPLC-CAD 法同時(shí)測(cè)定白及中的果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖，采用Xbridge Amide 色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果顯示分離效果良好，25批白及樣品的果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖的平均含量分別為5.90 ～28.51 mg·g-1、11.53 ～ 37.86 mg·g-1、0.40 ～ 2.19 mg·g-1、11.13 ～53.72 mg·g-1。CAD 與ELSD 相比，靈敏度更高、檢測(cè)限更低，可以檢測(cè)納克級(jí)別的化合物，且檢測(cè)與化學(xué)結(jié)構(gòu)無關(guān)，具有反應(yīng)重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、維護(hù)成本低等特點(diǎn)，是常規(guī)食品分析的理想選擇，但是CAD 價(jià)格是其他檢測(cè)器的數(shù)倍，維護(hù)較麻煩。

1.4.2 氣相色譜法

氣相色譜（Gas Chromatography，GC）是基于樣品中各組分在氣相和固定液液相間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離。GC 分離效能高、分析速度快、靈敏度高，適合復(fù)雜混合物的分析。糖是不易揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的化合物，熔點(diǎn)較高，用GC 檢測(cè)前必須進(jìn)行衍生化處理，極大地限制了GC 用于糖類分析的發(fā)展。對(duì)于糖的衍生，常用方法有甲基化、乙?；?、三氟乙酸鹽化和三甲基硅基化等[25]。氣相色譜檢測(cè)單、雙糖時(shí)主要耦合火焰離子化檢測(cè)器（Flame Lonization Detector，F(xiàn)ID）和質(zhì)譜檢測(cè)器（Mass Spectrometry，MS）使用。

（1）火焰離子化檢測(cè)器。FID 利用氫火焰作為能源，當(dāng)待測(cè)物進(jìn)入火焰則在高溫下電離，產(chǎn)生比基流高幾個(gè)數(shù)量級(jí)的離子，在高壓電作用下形成離子流，其經(jīng)高電阻放大轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再根據(jù)電信號(hào)進(jìn)行定量分析。CAI 等[26]將煙草進(jìn)行加壓液體萃取，用乙酸醛腈法與鄰甲氧基肟-三甲基硅基法聯(lián)用進(jìn)行衍生化和超聲輔助分散液液微萃取處理后，采用GC-FID法分析主要碳水化合物，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)3 個(gè)烤煙品種的碳水化合物含量進(jìn)行了分析，檢測(cè)到葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和肌醇。KA?KONIEN? 等[27]采用1-(三甲基硅基)咪唑衍生樣品，GC-FID 法分析26 份蜂蜜樣本，結(jié)果表明，所有樣品均含果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、松二糖、海藻糖、異麥芽酮糖、纖維二糖、棉子糖和潘糖，其中有22 個(gè)樣品以葡萄糖為主。FID 靈敏度高，線性范圍寬，但對(duì)含羰基、羥基、鹵代基和胺基的有機(jī)物靈敏度很低或根本無響應(yīng)，所以測(cè)試糖類物質(zhì)時(shí)需經(jīng)衍生處理。

（2）質(zhì)譜檢測(cè)器。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）具有高分辨率的氣相色譜和高靈敏度的質(zhì)譜，被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離和鑒定。MS 通過對(duì)樣品離子的質(zhì)荷比分析而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定性和定量，是測(cè)定復(fù)雜化合物的有效手段。SANZ 等[28]用三甲基硅烷基化試劑將不同的水果汁衍生化后，用GC-MS 測(cè)定果汁中的肌醇和單雙糖，結(jié)果表明，果汁中均含有葡萄糖、果糖和蔗糖，不同類型的果汁中3 種糖含量的差異很大。DE LA FUENTE 等[29]用氯羥胺、六甲基二硅氮烷處理蜂蜜后，用GC-MS 定量測(cè)定出了2 個(gè)單糖，14 個(gè)雙糖和21 個(gè)三糖。GC-MS 可以分析出化合物的分子量、元素組成、分子式和分子結(jié)構(gòu)，在定性檢測(cè)和定量檢測(cè)兩方面都很受歡迎。GC-MS 兼?zhèn)淞松V的高分離能力和質(zhì)譜的強(qiáng)定性能力，靈敏度高、檢測(cè)快速，但是其與GC-FID 一樣需要衍生處理。

1.4.3 離子色譜法

離子交換色譜（Ion Chromatography，IC）利用待測(cè)組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異而實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜靈敏度高、分析效果好、分析速度快，幾分鐘內(nèi)可完成一個(gè)樣品的檢測(cè)。分析糖類物質(zhì)時(shí)，離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)（IC-PAD）法得到了廣泛應(yīng)用，其無需衍生即可分析單糖和大多數(shù)寡糖、低聚糖。LO COCO 等[30]將巧克力樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋和純化后，在PA10 色譜柱上注射，采用高效陰離子色譜-脈沖安培法檢測(cè)巧克力基質(zhì)中葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖的含量，用外標(biāo)法定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高。楊曉敏[31]采用離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法分析乳制品中的果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖和乳糖，結(jié)果表明，這5 種單雙糖含量在0.1 ～20.0 mg·kg-1線性關(guān)系良好，回收率高。離子交換色譜法測(cè)試不同樣品時(shí)，對(duì)溶液pH 要求較高，所以需根據(jù)不同樣品需求調(diào)節(jié)合適的pH 值。

1.4.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）是LC和GC 技術(shù)中一個(gè)新穎、有吸引力的替代技術(shù)，是一種具有高效益、高分離速度和大量的理論板等優(yōu)點(diǎn)的電驅(qū)動(dòng)分離技術(shù)。CE 不需過多樣品和試液，僅需要微量（微升)的緩沖液、有機(jī)溶劑和添加劑即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)由于進(jìn)樣量過低（納升）和毛細(xì)管內(nèi)徑小而導(dǎo)致的檢測(cè)靈敏度低的現(xiàn)象。此外，CE可以很容易地與各種光學(xué)和電化學(xué)探測(cè)器耦合。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)已成功地應(yīng)用于單、雙糖的分離和測(cè)定。

在光度檢測(cè)中，由于糖類物質(zhì)缺乏發(fā)色團(tuán)，需要柱前衍生化或其他轉(zhuǎn)化，也可以采用間接吸光度檢測(cè)，需將離子發(fā)色團(tuán)添加到背景電解質(zhì)中，如2,6-吡啶二羧酸、馬來酸和鄰苯二甲酸、山梨酸、1-萘乙酸、2,6-吡啶二羧酸。林雁飛等[32]以α-萘胺為衍生劑，用毛細(xì)管電泳法對(duì)蜂蜜中7 種單雙糖的衍生物進(jìn)行分離檢測(cè)，回收率為100%～105%，RSD ＜2%。郭建敏等[33]利用高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法直接分離和測(cè)定了不同果汁中的糖類物質(zhì)，外標(biāo)定量法分析果汁中的主要糖類物質(zhì)，結(jié)果表明，4 種果汁中含量較高的糖類均為果糖、葡萄糖和蔗糖，木糖、麥芽糖和山梨醇含量較低，不同品種間差異較大。RAMíREZ 等[34]采用CE 間接紫外檢測(cè)法對(duì)蔗糖、麥芽糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖5 種糖進(jìn)行了全電泳分離，以1-萘乙酸為背景電解質(zhì)，pH 值為12.5，間接紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為222 nm，毛細(xì)管（75 μm×120 cm），電壓為25 kV 的條件下，在50 ～400 mg·L-1得到線性校正曲線，測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確度高，線性良好，此外，該方法無需標(biāo)記即可確定單糖、二糖和三糖。

1.4.5 紅外光譜法

糖類物質(zhì)在紅外波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有特定的吸收，所以可以通過紅外光譜分析單糖和雙糖。紅外光譜在單、雙糖分析時(shí)需要同時(shí)在多個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，然后使用特殊的多元統(tǒng)計(jì)技術(shù)將光譜數(shù)據(jù)與所選組分的濃度聯(lián)系起來。采用多元線性回歸（MLR）或偏最小二乘（PLS）回歸方程等方法建模分析，可根據(jù)所選波長(zhǎng)的吸光度值預(yù)測(cè)各組分的濃度[35]。紅外光譜法成本低、檢測(cè)速度快，但易受環(huán)境影響而導(dǎo)致基線不穩(wěn)定，且糖的結(jié)構(gòu)相似，它們的光譜會(huì)相互重疊，影響結(jié)果判斷。

HUANG 等[36]采用衰減全反射-中紅外光譜（ATR-MIR）法測(cè)定大麥芽中葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖，分析了100 個(gè)麥芽樣品，用HPLC 法測(cè)定單個(gè)糖的濃度，PLS 回歸模型對(duì)葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖的交叉驗(yàn)證確定系數(shù)（R2）分別為0.64、0.84、0.80、0.60；交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）分別為1.38 mg·mL-1、0.12 mg·mL-1、8.30 mg·mL-1、0.91 mg·mL-1。

CASCANT 等[37]利用衰減的全反射率傅里葉變換紅外光譜，建立了3 個(gè)獨(dú)立PLS 回歸模型，用于直接測(cè)定葡萄糖、果糖和麥芽糖，預(yù)測(cè)的均方根誤差在7.04 ～12.55 mg（糖）/g（樣品）。目前的ATRFTIR-PLS 方法能夠準(zhǔn)確、快速的測(cè)定，無需消耗溶劑或產(chǎn)生有毒廢物。SHEN 等[38]采用傅里葉變換中紅外光譜快速測(cè)定黃酒中糖和酸的含量，采用PLSR 建立了與糖含量和酸度相關(guān)的11 個(gè)參數(shù)的校正模型，即總糖、非糖固體、葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽糖、泛糖、總酸、氨基酸氮、pH 值和乳酸，在校正步驟中，大部分參數(shù)能被準(zhǔn)確確定，但異麥芽糖和異麥芽糖的預(yù)測(cè)結(jié)果不理想。LOHR 等[39]分別對(duì)菊花和天竺葵插枝的完整插枝和離體葉片上下側(cè)進(jìn)行了近紅外光譜分析，建立了葉片中葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉的偏最小二乘校準(zhǔn)模型，用逐步酶光度法對(duì)其進(jìn)行了分析，單糖和可溶性糖含量的校正模型較差，而淀粉和淀粉可溶性糖含量的校正模型較好。

ILASLAN 等[40]利用拉曼光譜技術(shù)快速、低成本地定量分析商品軟飲料中的葡萄糖、果糖和蔗糖，利用拉曼光譜數(shù)據(jù)建立標(biāo)定模型并繪制曲線，采用PLS回歸方法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)軟飲料中糖的含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，葡萄糖、果糖、蔗糖的回歸值的斜率分別為0.967、0.992、1.008，檢驗(yàn)的決定系數(shù)（R2）值分別為0.913、0.998、0.993，并采用HPLC 方法驗(yàn)證了拉曼光譜法的有效性。

2 展望

隨著現(xiàn)今分析儀器的快速發(fā)展進(jìn)步，單糖、雙糖分析技術(shù)發(fā)展迅猛，方法多種多樣。目前最常用的檢測(cè)方法是HPLC 法，HPLC 可耦合多種檢測(cè)器，測(cè)糖時(shí)可分為需衍生與無需衍生兩類。需衍生的有UV、FLD，因?yàn)檠苌僮骱臅r(shí)長(zhǎng)、步驟煩瑣，且衍生過程可能引入雜質(zhì)，所以HPLC-UV、HPLC-FLD 通用性大大降低。RID、ELSD、CAD 無需衍生，操作簡(jiǎn)單。物理方法和化學(xué)方法有一定局限性，誤差相對(duì)較大。生物法是最為通用的方法，其不需要任何特殊的重型儀器，但在一個(gè)分析系統(tǒng)中有兩種或更多的酶時(shí)會(huì)難以判斷，與色譜和電泳方法相比，這種生物分析系統(tǒng)的實(shí)際用途是有限的，只能測(cè)定某種特定的糖。GC不需要使用超純有機(jī)溶劑，但其也要進(jìn)行衍生化處理，限制了GC 在糖類分析上的發(fā)展。IC 靈敏高，分析速度快，PAD 的應(yīng)用增加了這種檢測(cè)方法的選擇性，但I(xiàn)C 有時(shí)存在信號(hào)不穩(wěn)定的問題。CE 是一種比較經(jīng)濟(jì)的新型技術(shù)，分離效率高、分析時(shí)間短，樣品和試劑消耗極低。IR 是一種相對(duì)便宜、非破壞性和非?？焖俚募夹g(shù)方法，可以應(yīng)用于原始樣品的分析，并允許在一次運(yùn)行中確定少數(shù)成分，但它需要通過化學(xué)計(jì)量來處理分析數(shù)據(jù)，而且對(duì)外部條件較為依賴，并需要對(duì)每個(gè)樣品基體的變化進(jìn)行優(yōu)化。

綜上所述，每種測(cè)定糖的方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，可以進(jìn)行破壞性或非破壞性分析、特殊分析物或多分析物的檢測(cè)、常規(guī)應(yīng)用或偶然應(yīng)用等。氣相色譜、生物酶法因其局限性與特殊性，難以發(fā)展，而由于色譜柱技術(shù)的發(fā)展，液相色譜將會(huì)不斷完善，成為更有前途的分析方法；離子色譜、毛細(xì)管電泳和紅外技術(shù)無需衍生化，無有毒物質(zhì)產(chǎn)生，與綠色化學(xué)要求兼容，符合綠色發(fā)展要求，有望成為單糖和雙糖分析檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化方法。