任 楠 劉金婧 徐海銘 趙 凱 劉明波

1.解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853；2.解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海南三亞 572013

喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉部最常見的惡性腫瘤[1]，位于頭頸部惡性腫瘤的第三位[2]。LSCC 的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3-4]，使多數(shù)患者的預(yù)后較差[5]。因此，在分子水平上探索調(diào)控LSCC 侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵因子，對(duì)LSCC 的早期診斷及治療起著重要作用。課題組前期工作中，應(yīng)用TCGA 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了LSCC 的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，通過生存分析發(fā)現(xiàn)2 個(gè)與預(yù)后相關(guān)的mRNA [碘甲原氨酸脫碘酶Ⅰ（deiodinase iodothyronine type Ⅰ，DIO1）和STC2][6]。DIO1 屬于脫碘酶硒蛋白家族[7-8]，其可調(diào)節(jié)活化甲狀腺激素的生物利用度[9-12]，控制細(xì)胞增殖、分化和代謝[13-15]。本研究探討TU686 細(xì)胞系中DIO1 的表達(dá)，及對(duì)LSCC 增殖、遷移、侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人喉鱗狀細(xì)胞癌TU686 細(xì)胞系由解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科課題組傳代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（Invitrogen，批號(hào)：15596026）；PCDNA3.1 質(zhì)粒表達(dá)載體（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，批號(hào)：GOSA0355591-1）；CCK-8試劑盒（Beyotime，貨號(hào)：C0040）；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、S6K1、4EBP1、Akt 抗體（Abcam，貨號(hào)：ab227639、ab207608、ab137321、ab131440、ab2606、ab18785）。低溫離心機(jī)（Sigma，型號(hào)：3-18K）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，型號(hào)：StepOne）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將細(xì)胞接種至含有10%胎牛血清和青-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。TU686 細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用培養(yǎng)基稀釋DIO1 質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑混合，后將復(fù)合物加入培養(yǎng)皿中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染1 d 后細(xì)胞傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將正常TU686 細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后的TU686 細(xì)胞為DIO1 過表達(dá)組，根據(jù)過表達(dá)量繼續(xù)分為DIO1-1 μg 組、DIO1-2 μg 組。

1.3.2 RT-qPCR 驗(yàn)證DIO1 的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA，RT-qPCR 將DIO1 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 并擴(kuò)增，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔（GAPDH 為內(nèi)參）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，共1 個(gè)循環(huán)；變性95℃20 s，退火60℃20 s，延伸72℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系共20 μl：cDNA 2 μl，master mix 10 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)完成后，采用2-△△Ct法計(jì)算DIO1 的表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.3 Western blot 檢測(cè)DIO1、E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、p-S6K1、S6K1、p-4EBP1、4EBP1、p-Akt、Akt 的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，裂解細(xì)胞提取蛋白；SDS-PAGE 法分離蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)膜，封閉洗膜。一抗?jié)舛葹?∶1 000，4℃孵育過夜；二抗?jié)舛葹?∶2 000，室溫孵育；ECL 法顯色（GAPDH 為內(nèi)參）。

1.3.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將各組細(xì)胞接種于96 孔板中，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，貼壁后加入CCK-8溶液。酶標(biāo)儀測(cè)定第24、48、72 h 的450 nm 波長的光密度（optical density，OD）值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.5 PI/DAPI 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將各組細(xì)胞培養(yǎng)皿用PBS 漂洗，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，DAPI/PI 液室溫染色，封片劑封片，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將各組細(xì)胞接種至6 孔板中，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，用槍頭在孔中劃出直線，間隔24 h 后觀察細(xì)胞分布并拍照。

1.3.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力 將各組細(xì)胞接種至Transwell 上室，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)后使用甲醛固定，Giemsa 染色，擦去上室中的細(xì)胞，顯微鏡觀察下室層面的細(xì)胞，拍照，計(jì)數(shù)。侵襲能力：小室經(jīng)基質(zhì)膠預(yù)處理，其他方法同上。

1.3.8 基因富集情況 分析DIO1-1 μg 組、DIO1-2 μg組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及mTORC1 信號(hào)通路相關(guān)基因的差異表達(dá)情況，得到受DIO1 表達(dá)影響的相關(guān)基因，并進(jìn)行基因探針富集分析，檢測(cè)相關(guān)基因集的富集情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 14.2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞的DIO1 表達(dá)

DIO1 過表達(dá)組DIO1 mRNA、蛋白水平高于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞的生存能力

24、48、72 h，DIO1 過表達(dá)組OD 值低于對(duì)照組（P＜0.01）；DIO1 過表達(dá)組PI 染色陽性比例高于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞的生存能力

2.3 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞的遷移能力

DIO1 過表達(dá)組相對(duì)遷移距離短于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞的遷移能力

2.4 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞的遷移及侵襲能力

DIO1 過表達(dá)組遷移及侵襲能力低于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞的遷移及侵襲能力

2.5 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞EMT 進(jìn)程的變化

NES＜0 即DIO1 的表達(dá)與EMT 相關(guān)基因集的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。DIO1-1 μg 組、DIO1-2 μg 組E-cadherin高于對(duì)照組，N-cadherin、Vimentin 低于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞EMT 進(jìn)程的變化

2.6 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞mTORC1 信號(hào)通路的變化

NES＜0 即DIO1 的表達(dá)與mTORC1 信號(hào)通路相關(guān)基因集的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。DIO1-1 μg 組、DIO1-2 μg 組p-S6K1 和p-4EBP1 低于對(duì)照組（P＜0.01）。DIO1-1 μg組、DIO1-2 μg 組與對(duì)照組p-Akt 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染后TU686 細(xì)胞mTORC1 信號(hào)通路的變化

3 討論

目前，雖然手術(shù)是LSCC 的主要治療方式[16-18]，但是發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)及預(yù)后分子對(duì)LSCC 的研究至關(guān)重要[19-23]。本研究構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)DIO1 的TU686 細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，DIO1 可以抑制腫瘤細(xì)胞的生存、遷移及侵襲能力及EMT。GESA 分析發(fā)現(xiàn)，mTORC1 信號(hào)通路與DIO1 呈負(fù)相關(guān)，且mTORC1 底物在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞呈現(xiàn)低表達(dá)，且mTORC1 信號(hào)通路可以調(diào)控EMT 的進(jìn)程[24-25]，提示在LSCC 中，DIO1 可能是通過mTORC1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)EMT 的進(jìn)程。

綜上所述，DIO1 可以抑制LSCC 的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，作為抑癌基因在LSCC 侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，為LSCC 發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制提供了新方向。