沈躍鵬

（開封市農林科學研究院 河南 開封 475004）

利用小麥成熟胚作為外植體， 進行愈傷組織的誘導與再生分化， 對于建立小麥高效遺傳轉化體系具有十分重要的意義。 生長調節(jié)劑在愈傷組織誘導過程中具有十分重要的作用。 長期以來，人們對培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑的種類和劑量進行了較多研究，一般認為2,4-D 是小麥組織培養(yǎng)中起主導作用的植物生長調節(jié)物質，是影響組織再分化的關鍵因素，常用劑量為0.2～2.0 mg/L。 目前，在多種植物的胚性愈傷組織誘導中， 不同研究者通過在誘導培養(yǎng)基中加入不同濃度的2,4-D（或配合其他激素），均成功地誘導出了胚性愈傷組織，如枇杷[1]、荔枝[2]、枸杞[3]等。 關于小麥組織培養(yǎng)方面的研究也較多，已篩選出了多種含2,4-D 的培養(yǎng)基和材料[4-5]，但關于3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸在植物愈傷組織誘導及再生效果方面的研究較少。 為建立小麥穩(wěn)定高效再生體系， 探索2,4-D和3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸對小麥成熟胚出愈率和胚性愈傷率的影響，2022 年本文作者以MS 為基本培養(yǎng)基分別添加脯胺酸、 水解酪蛋白和不同劑量的2,4-D 或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，形成多種試驗培養(yǎng)基，由此開展了本次研究。

1 材料與方法

1.1 小麥成熟胚

試驗選用開麥18、開麥20、開麥22 等3 個小麥品種的成熟胚。

1.2 試驗培養(yǎng)基

以MS 為基本培養(yǎng)基分別添加脯胺酸、水解酪蛋白和3 個劑量水平的2,4-D 或3, 6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，形成S 和M2 類8 種試驗培養(yǎng)基（表1）。

表1 不同試驗培養(yǎng)基的組成

1.3 試驗方法

1.3.1 出愈率的計算 分別取開麥18、 開麥20、開麥22 等3 個品種大小一致的種子用75%的乙醇浸泡3～5 min， 然后用無菌水沖洗3～4 次， 用0.1%的HgCl2（W/W）消毒15～20 min，然后再用無菌水沖洗3～4 次，放入33℃的無菌水中浸泡3～5 h；用滅過菌的解剖刀剝出胚，盾片向上，分別置于8 種試驗培養(yǎng)基上，在26℃暗室中培養(yǎng)。 3 個品種分別在每種培養(yǎng)基中重復培養(yǎng)3 次， 各重復均用40 粒成熟胚。 15 d后調查計算愈傷組織誘導率，即出愈率。

1.3.2 胚性愈傷率的計算 把誘導15 d 的愈傷組織切分成兩半，接種于繼代培養(yǎng)基，采用16 h 光照、8 h黑暗光周期（光照度1 750～2 200 lx）。 在光下出現綠色的愈傷組織視為胚性愈傷組織。 培養(yǎng)20 d 時調查計算胚性愈傷組織誘導率，即胚性愈傷率。

1.4 數據處理

數據處理及統(tǒng)計分析利用Excel 2010 統(tǒng)計軟件進行。

2 結果與分析

培養(yǎng)基是植物成熟胚愈傷組織誘導的物質基礎，其構成顯著影響到愈傷組織的誘導效果（表2）。由表3、表4 可知，出愈率和胚性愈傷率在不同培養(yǎng)基間的差異和品種間的差異均達極顯著水平， 而培養(yǎng)基×品種的互作均未達到顯著水平。 可見，不同培養(yǎng)基對小麥成熟胚愈傷組織的誘導效應存在極顯著差異， 不同品種小麥成熟胚愈傷組織誘導效果也存在極顯著的差異， 但培養(yǎng)基和品種對誘導效果的影響相對獨立。 為了解析培養(yǎng)基構成對誘導效果的影響，設計一組正交比較（表5）方法，進行單個自由度的方差分析。

表2 不同試驗培養(yǎng)基的平均出愈率和平均胚性愈傷率

表3 不同試驗培養(yǎng)基與各品種出愈率的方差分析

表4 不同培養(yǎng)基與各品種胚性愈傷率的方差分析

表5 試驗培養(yǎng)基分組比較的正交系數和平均差數

2.1 生長調節(jié)劑對小麥成熟胚愈傷組織出愈率的影響

由表2、表3 和表5 可知，①添加脯氨酸和水解酪蛋白對出愈率影響不顯著；②添加脯氨酸、水解酪蛋白時，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類培養(yǎng)基比含有2,4-D 的S 類培養(yǎng)基的出愈率高3.89%，達到極顯著水平；③不加脯氨酸和水解酪蛋白時，M 類培養(yǎng)基較S 類培養(yǎng)基的出愈率高1.94%， 提高不顯著； ④對于M 類培養(yǎng)基，3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸劑量為4 mg/L 的出愈率比2 mg/L 的高7.36%，達極顯著水平；2 mg/L 的出愈率比1 mg/L 的出愈率高4.72%，未達顯著水平；⑤對于S 類培養(yǎng)基，2,4-D 劑量為4 mg/L 的出愈率比2 mg/L 的出愈率高9.86%，達極顯著水平， 2 mg/L 的出愈率比1 mg/L 的出愈率高5.28%， 達顯著水平。 由此可見， 添加脯氨酸和水解酪蛋白對小麥成熟胚愈傷組織的出愈率影響不顯著， 但添加脯氨酸和水解酪蛋白時使用生長調節(jié)劑3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的出愈率極顯著高于使用2,4-D 的，在本試驗的劑量范圍內，兩種生長調節(jié)劑對小麥愈傷組織的出愈率的誘導效果均以高劑量為優(yōu)。

對8 種試驗培養(yǎng)基的出愈率進行多重比較（表6）表明，M4 培養(yǎng)基的出愈率最高，為88.89%，但與S4和M2 的出愈率86.67%和83.89%相比差異不顯著，而顯著高于M0， 極顯著地高于S0、S2、M1 和S1；S4培養(yǎng)基的出愈率與M2 和M0 差異不顯著，但顯著高于S0 和S2，極顯著高于M1 和S1；M2、M0、S0、S2 和M1 這5 種培養(yǎng)基的出愈率差異不顯著，但前四者均顯著或極顯著高于S1，而M1 和S1 差異不顯著。 由此可見，隨著生長調節(jié)劑劑量水平的提高，出愈率增高；在生長調節(jié)劑的劑量相同時，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類試驗培養(yǎng)基的誘導效果優(yōu)于含有2,4-D 的S 類試驗培養(yǎng)基。

表6 不同試驗培養(yǎng)基的出愈率差異顯著性比較

2.2 生長調節(jié)劑對小麥成熟胚愈傷組織胚性愈傷率的影響

由表2、表4 和表5 可知，①添加脯氨酸和水解酪蛋白的培養(yǎng)基的平均胚性愈傷率為13.19%， 比沒有添加脯氨酸和水解酪蛋白的增加了4.31%，達極顯著水平；②添加脯氨酸和水解酪蛋白時，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類培養(yǎng)基的胚性愈傷率比含有2,4-D 的S 類培養(yǎng)基高1.76%， 達極顯著水平；③不添加脯氨酸和水解酪蛋白時，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類培養(yǎng)基與含有2,4-D 的S 類培養(yǎng)基的平均胚性愈傷率分別為8.61%、9.17%，差異未達顯著水平；④對于含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類培養(yǎng)基，3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸劑量為4 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 或2 mg/L 的低1.94%，接近顯著水平，2 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 的高2.22%，也接近顯著水平；⑤對于含有2,4-D 的S 類基本培養(yǎng)基，2,4-D 劑量為4 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 或2 mg/L 的低0.97%，差異不顯著，2 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 的高2.51%，達顯著水平。 綜上所述，添加脯氨酸和水解酪蛋白可以極顯著提高胚性愈傷率，在此前提下，使用3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸顯著優(yōu)于使用2,4-D。 本試驗表明，以MS 為基本培養(yǎng)基，附加脯氨酸和水解酪蛋白各500 mg/L 和2 mg/L的3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的胚性愈傷率最高。

對胚性愈傷率進行多重比較（表7）表明，培養(yǎng)基M2、S2 和M1 的胚性愈傷率位居前3 位， 分別為15.83%、13.89%和13.61%， 三者間差異不顯著；S2、M1、M4、S4、S1 這5 個試驗培養(yǎng)基的胚性愈傷率差異不顯著， 但前四者顯著或極顯著地高于S0 和M0；S1、S0 差異不顯著，但二者顯著高于M0。 由此可見，兩種生長調節(jié)劑的劑量為2 mg/L 的試驗培養(yǎng)基的胚性愈傷率高于其他劑量的試驗培養(yǎng)基； 含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類試驗培養(yǎng)基優(yōu)于含有2,4-D 的S 類試驗培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加脯氨酸和水解酪蛋白可顯著提高胚性愈傷率。

表7 不同培養(yǎng)基的出愈率和胚性愈傷率差異顯著性比較

2.3 不同品種間的小麥成熟胚愈傷組織的誘導效果

如上所述， 出愈率和胚性愈傷率的品種間差異均達極顯著水平，開麥18、開麥20、開麥22 等3 個品種的愈傷組織出愈率分別為88.23%、80.63%、76.88%， 胚性愈傷率分別達到14.69%、11.25%和10.41%（表2）， 可見開麥18 成熟胚的愈傷組織誘導效果最好。

3 討論與結論

培養(yǎng)基的成分是影響誘導率和愈傷組織質量的主要因素之一，不同培養(yǎng)基的誘導效果有很大差異。出愈率低可以通過增加接種成熟胚量來彌補從而獲取大量的愈傷組織， 而愈傷組織質量是決定高效培養(yǎng)體系的關鍵。 所以應把胚性愈傷率作為衡量培養(yǎng)基好壞的重要指標。

本研究以MS 為基本培養(yǎng)基，通過分別添加脯胺酸、 水解酪蛋白和不同劑量的生長調節(jié)劑2,4-D 或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，形成8 種試驗培養(yǎng)基，研究開麥18 等3 個品種成熟胚的出愈率和胚性愈傷率。 結果表明，出愈率和胚性愈傷率在不同培養(yǎng)基間的差異和品種間的差異均達極顯著水平，而培養(yǎng)基×品種的互作差異不顯著；在MS 基本培養(yǎng)基上添加脯氨酸和水解酪蛋白可極顯著地提高小麥成熟胚愈傷組織的胚性愈傷率，但對出愈率影響不顯著；在此基礎上， 添加3, 6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的出愈率和胚性愈傷率比2,4-D 分別高3.89%和4.31%，均達極顯著水平；對于出愈率以高劑量為佳，胚性愈傷率以2 mg/L 為宜。 由此可見，3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸對小麥成熟胚愈傷組織的誘導效果優(yōu)于2,4-D，且以劑量為2 mg/L 為宜； 脯氨酸和水解酪蛋白可顯著提高小麥成熟胚愈傷組織的胚性愈傷率， 對出愈率無顯著影響。這與付風玲[6]等適量的L-脯氨酸和水解酪蛋白具有提高胚性愈傷率的作用的研究結果一致。綜合出愈率和胚性愈傷率試驗結果表明，M2 培養(yǎng)基為小麥愈傷組織誘導的適宜培養(yǎng)基。